一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针及其合成与应用

1.本发明涉及荧光探针技术领域，特别是涉及一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针及其合成与应用。


背景技术：

2.肼(n2h4)，又称联氨，是一种无色的油性液体，有一种类似于氨的刺激性气味，具有很强的还原性、高碱性和良好的水溶性，可应用于喷气发动机、火箭燃料和化工生产。然而肼具有高毒性，肼和水可以以任何体积比混合成水合肼，损害人类健康。工业生产污水通常含有硝酸肼、硫酸肼等肼类化合物，随意排放对生态环境造成严重危害。
3.公开号为cn110452171a的专利公开了一种萘酰亚胺母体结构的肼检测用荧光探针，4
‑
溴
‑
1,8
‑
二萘甲酸酐和4
‑
(2
‑
氨基乙基)吗啉反应得到中间产物，中间产物再与2,4
‑
二硝基苯磺酰氯反应得到探针，该专利对肼有着高度的敏感性，能够用于检测肼，但荧光探针通常分子结构复杂、在复杂环境中不稳定，无法检测肼类化合物。
4.公开号为cn110452250a的专利公开了一种荧光素母体结构的检测肼用荧光探针，该专利是基于二氯荧光素设计合成了肼检测用荧光探针，并对其分子结构进行了相应的表征分析，对肼的识别有着响应时间短，抗干扰，选择性好等优点，但对肼的检测限为3.1ppb，仍然较高，且生产成本较高。
5.公开号为cn108982447b的专利公开了一种用于检测肼的比率式荧光探针的制备方法及应用，该专利制备得到的分子探针可应用与生物样本检测，具有低生物毒性、选择性好、现象明显易观察和准确度高等优点，但此专利需要利用共聚焦激光扫描显微镜获取细胞的荧光图像，操作繁琐，检测时间长，仪器昂贵，无法实现实时分析和生物成像。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：
8.一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针，所述荧光探针包括a
‑
1和a
‑
2，其化学结构式为：
9.a
‑
1：
10.a
‑
2：
11.一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针的合成方法，包括如下步骤：
12.(1)制备a
‑
1：将二氯荧光素加入到圆底烧瓶中，氮气保护下加入二氯甲烷搅拌溶解，然后在0℃冰浴下依次加入三乙胺和丙烯酰氯，混合搅拌10min 后在室温下反应12h，反应期间通过tlc鉴别和定性分析少量物质，跟踪反应进程，反应结束后真空除去溶剂，柱层析后得到探针a
‑
1；
13.(2)制备a
‑
2：将荧光素加入到圆底烧瓶中，氮气保护下加入二氯甲烷搅拌溶解，然后在0℃冰浴下依次加入三乙胺和丙烯酰氯，混合搅拌10min后在室温下反应12h，反应期间通过tlc鉴别和定性分析少量物质，跟踪反应进程，反应结束后真空除去溶剂，柱层析后得到探针a
‑
2。
14.(3)制备荧光探针：将步骤(1)获得的探针a
‑
1和步骤(2)获得的探针 a
‑
2按比例混合得到所述荧光探针。
15.优选的，所述柱层析的洗脱液为石油醚
‑
乙酸乙酯，其中石油醚和乙酸乙酯的体积比为6：1，所述柱层析以25％
‑
65％/60min梯度进行洗脱，洗脱时的流速为6ml/min。
16.优选的，所述探针a
‑
1与所述探针a
‑
2的混合比例为1：3～1：5。
17.基于上述荧光探针，本发明还提出了一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针的应用，包括有检测方法，具体步骤如下：
18.将肼类化合物加入含探针a
‑
1和a
‑
2的缓冲溶液中充分反应1h，通过反应后溶液体系颜色的变化实现对肼类化合物的裸眼识别，通过检测反应溶液在 523nm处的荧光强度实现对肼类化合物的荧光识别。
19.优选的，所述缓冲溶液为pbs和dmso溶液，所述缓冲溶液的浓度为10 μm，ph为7.4，pbs和dmso的体积比为9：1。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.1.本发明创新了合成方法，原材料中没有用到毒性较大的氯化亚砜和n,n
‑ꢀ
二甲基甲酰胺，且原料价格低廉、对环境友好，因此合成成本低、合成产率高。
22.2.本发明以荧光素和二氯荧光素为荧光母体，以丙烯酰氯为识别基团，合成了可以检测肼类化合物的“turn
‑
on”型荧光探针a
‑
1和a
‑
2，由于肼类化合物具有强亲核性，与识别基团丙烯酸酯发生反应使荧光素母体游离出来，通过反应后溶液体系从无色变为绿色，实现对肼类化合物的裸眼识别。
23.3.本发明将a
‑
1与a
‑
2混合，与单独的探针a
‑
1相比，生产成本低，能够实现对肼类化合物快速高效的检测，对肼类化合物的检测具有更低的检测限。
24.4.本发明本发明在干扰物质共存环境下，探针a
‑
1和a
‑
2对肼类化合物均可以实现快速响应，且荧光增强显著，体现本发明具有较好的选择性和抗干扰能力。
25.5.本发明的ph适应性良好，待测物在ph＝7～10范围内荧光响明显且稳定。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为本发明a
‑
1的合成路线示意图；
28.图2为本发明a
‑
2的合成路线示意图；
29.图3
‑
6分别为本发明a
‑
1对肼、硫酸肼、硝酸肼和偏二甲肼浓度响应的线性关系图；
30.图7
‑
10分别为本发明a
‑
2对肼、硫酸肼、硝酸肼和偏二甲肼浓度响应的线性关系图；
31.图11
‑
14分别为本发明a
‑
1对肼、硫酸肼、硝酸肼和偏二甲肼的响应时间示意图；
32.图15
‑
18分别为本发明a
‑
2对肼、硫酸肼、硝酸肼和偏二甲肼的响应时间示意图；
33.图19
‑
21为本发明a
‑
1对干扰物的选择性响应示意图；
34.图22
‑
24为本发明a
‑
2对干扰物的选择性响应示意图；
35.图25为本发明a
‑
1在不同ph下对目标物的响应程度示意图；
36.图26为本发明a
‑
2在不同ph下对目标物的响应程度示意图。
具体实施方式
37.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
38.实施例1：
39.本实施例提供了一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针的合成方法，包括制备a
‑
1和a
‑
2，具体步骤如下：
40.制备0.3g探针a
‑
1的方法包括如下步骤：准确称取0.60g(1.5mmol)二氯荧光素加入到100ml圆底烧瓶中，氮气保护下加入20ml二氯甲烷搅拌溶解，然后在0℃冰浴下依次加入0.20ml三乙胺(1.8mmol)、0.25ml丙烯酰氯(3mmol)混合搅拌10min后在室温下反应12h，期间通过tlc鉴别和定性分析少量物质，跟踪反应进程，反应结束后真空除去溶剂，用体积比为6：1的石油醚
‑
乙酸乙酯洗脱液以25％
‑
65％/60min梯度进行洗脱，洗脱时的流速为6ml/min，柱层析后得到探针a
‑
1，探针a
‑
1的合成路线如图1所示。
41.制备0.2g探针a
‑
2的方法包括如下步骤：准确称取0.40g荧光素(1.2mmol)加入到50ml圆底烧瓶中，氮气保护下加入20ml二氯甲烷搅拌溶解，然后在0℃冰浴下依次加入0.17ml三乙胺(1.2mmol)、0.25ml丙烯酰氯(3mmol)混合搅拌10min后在室温下反应12h，期间通过tlc鉴别和定性分析少量物质，跟踪反应进程，反应结束后真空除去溶剂，用体积比为6：1的石油醚
‑
乙酸乙酯洗脱液以25％
‑
65％/60min梯度进行洗脱，洗脱时的流速为6ml/min，柱层析后得到探针a
‑
2，探针a
‑
2的合成路线如图2所示。
42.将探针a
‑
1和探针a
‑
2按1：3～1：5的比例混合，得到目标荧光探针。
43.实施例2：
44.本实施例提供了一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针的应用，说明实施例1合成的荧光探针可以实现裸眼检测肼类化合物。
45.将10μl肼类化合物(500μm，50eq)加入含荧光探针的缓冲溶液中，缓冲溶液为体积比9：1的pbs和dmso溶液，浓度为10μm，ph为7.4，充分反应1h后，自然光下，相较于空白溶液，荧光探针与待测物反应后溶液体系变为明显的黄绿色；在325nm紫外灯下，发现肼类化合物呈明显的黄绿色荧光，该结果表明实施例1合成的荧光探针可以实现裸眼检测肼类化合物。
46.实施例3：
47.如图2
‑
10，本实施例提供了一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针的应用，说明实施例1合成的荧光探针的荧光强度随肼类化合物浓度的增加而增强。
48.a
‑
1：在探针a
‑
1的缓冲溶液中分别加入浓度为0、50、100、150、200、 250、300、350、400、450、500μm的肼、硫酸肼、硝酸肼、偏二甲肼，分别检测在523nm处的荧光强度变化。结果如图3
‑
6所示，探针a
‑
1的荧光强度随待测物浓度的增加而显著增强，计算得到探针a
‑
1对肼、硫酸肼、硝酸肼以及偏二甲肼的检测限分别为：0.21μm(6.7ppb)、0.24μm(31.2ppb)、0.21μm (19.9ppb)和0.64μm(38.5ppb)。
49.a
‑
2：在探针a
‑
2的缓冲溶液中分别加入浓度为0、50、100、150、200、 250、300、350、400、450、500μm的肼、硫酸肼、硝酸肼、偏二甲肼，分别检测在523nm处的荧光强度变化。结果如图7
‑
10所示，探针a
‑
2的荧光强度随待测物浓度的增加而增强，计算得到探针a
‑
2对肼、硫酸肼、硝酸肼以及偏二甲肼的检测限分别为：2.4μm(76.8ppb)、5.2μm(676.0ppb)、2.9μm (275.5ppb)和5.8μm(348ppb)。
50.实施例4：
51.如图11
‑
18所示，本实施例提供了一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针的应用，说明实施例1合成的荧光探针对肼类化合物的响应时间不同。
52.a
‑
1：向含10μm探针a
‑
1的缓冲溶液中分别加入浓度为1000μm(100eq)的肼、硫酸肼、硝酸肼、偏二甲肼待测溶液，得到荧光强度随时间变化的关系图。结果如图11
‑
14所示，探针a
‑
1对肼的响应最快，在10min时反应基本达到平衡，对硝酸肼的响应时间为25min，硫酸肼为35min，相比之下偏二甲肼的响应时间超过40min。
53.a
‑
2：向含10μm探针a
‑
2的缓冲溶液中分别加入浓度为1000μm(100eq)的肼、硫酸肼、硝酸肼、偏二甲肼待测溶液，得到荧光强度随时间变化的关系图。结果如图15
‑
18所示，探针a
‑
2对肼类化合物在10min内持续响应，且荧光响应程度可达到裸眼检测的效果，在相同的反应时间下，a
‑
2与肼反应的荧光强度更高，说明探针a
‑
2对肼响应最快，硝酸肼次之，硫酸肼和偏二甲肼相近。
54.实施例5：
55.如图19
‑
24所示，本实施例提供了一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针的应用，说明实施例1合成的荧光探针检测肼类化合物时具有较好的的选择性，抗干扰能力强。
56.a
‑
1：在含探针a
‑
1的溶液中，分别加入常见的阴阳离子和含氮小分子，包括zn
2+
、mn
2+
、cu
2+
、cd
2+
、fe
3+
、ba
2+
、mg
2+
、no2‑
、no3‑
、hso3‑
、so3‑
、sh
‑
、et3n、 dmf、nh3·
h2o，et3n、dmf、nh3·
h2o这三种胺分子的加入不会改变探针的荧光强度，测试结果表明，探针a
‑
1对干扰物质几乎没有响应。在测试体系中加入肼类待测物进行抗干扰实验，结果如图19
‑
21所示，在干扰物质共存环境下，探针a
‑
1对肼类化合物仍有较好的响应，证明探针a
‑
1具有较好的选
择性，抗干扰能力强。
57.a
‑
2：在含探针a
‑
2的溶液中，分别加入常见的阴阳离子和含氮小分子，包括zn
2+
、mn
2+
、cu
2+
、cd
2+
、fe
3+
、ba
2+
、mg
2+
、no2‑
、no3‑
、hso3‑
、so3‑
、sh
‑
、et3n、 dmf、nh3·
h2o，et3n、dmf、nh3·
h2o这三种胺分子的加入不会改变探针的荧光强度，测试结果表明，除hso3‑
外，探针a
‑
2对其他干扰物质几乎没有响应，hso3‑
相较于加入肼类化合物后的荧光强度变化小，说明在hso3‑
干扰下，探针a
‑
2仍能与肼类化合物产生较强的荧光响应。在测试体系中加入了肼类化合物进行抗干扰实验，结果如图22
‑
24所示，在含氮分子共存的体系中，et3n和nh3·
h2o 对探针a
‑
2产生较为明显的荧光响应，但dmf对a
‑
2基本没有干扰，表明探针 a
‑
2对部分含氮分子具有良好的选择性。
58.实施例6：
59.如图25所示，本实施例提供了一种用于快速检测肼类化合物的荧光探针的应用，说明实施例1合成的荧光探针在不同ph下对目标物的响应程度不同，荧光探针在ph＝7～10的体系中稳定性高。
60.a
‑
1：如图19所示，探针a
‑
1在ph≤5的体系中，由于酸性条件下肼类化合物中的氮原子质子化降低了亲核能力，反应活性降低，荧光响应不明显；在 ph≥6的体系中，随着碱性的增强，探针a
‑
1自身发生水解，逐渐出现荧光响应，随着ph的增大，体系中h+逐渐减少，探针a
‑
1与肼类化合物的反应活性逐渐升高；在ph＝7～10的体系中，肼类化合物的荧光响应明显且稳定，说明探针a
‑
1的ph适应性良好。
61.a
‑
2：如图26所示，探针a
‑
2在ph≤5的体系中，由于酸性条件下肼类化合物中的氮原子质子化降低了亲核能力，反应活性降低，荧光响应不明显；在ph≥6的体系中，随着碱性的增强，探针a
‑
2自身发生水解，逐渐出现荧光响应；在ph＝7～10的体系中，肼类化合物的荧光响应明显且较为稳定，说明探针a
‑
2具有宽ph适应范围，且在ph＝7～10的体系中检测肼类化合物稳定性高。
62.综上所述，实施例1获得的荧光探针对肼、硫酸肼、硝酸肼以及偏二甲肼均可实现快速响应，且荧光增强显著，具有较低的检测限，同时具有良好的抗干扰性和选择性。荧光探针与肼类化合物反应后，溶液体系从无色变为绿色，可以实现裸眼识别，由于a
‑
1对肼的响应时间比a
‑
2快，a
‑
1的检测限低于a
‑
2， a
‑
1的选择性与抗干扰能力强于a
‑
2，同时a
‑
1的ph适应性优于a
‑
2，但a
‑
2 的生产成本比a
‑
1低，因此探针a
‑
1和a
‑
2中探针a
‑
1的占比要低于a
‑
2，a
‑
1 和a
‑
2按比例混合能够实现稳定的响应时间，同时能够在干扰性环境下实现快速检测。
63.以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。