一种脐带间充质干细胞外泌体及其提取方法与应用

1.本发明涉及组织细胞学技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体及其提取方法与应用。


背景技术：

2.随着生物科学、材料科学以及化学等学科的发展，特别是组织工程技术的发展，人体组织器官的修复替代进入了一个崭新的阶段。临界性骨缺损一直是临床骨科医生面临的棘手问题，临床治疗困难。而老年性骨质疏松相关的骨缺损(senile osteoporosis related bone defect,sorbd)的治疗更是难上加难。
3.骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bmscs)数量减少和衰老导致的功能异常是老年性骨质疏松(senile osteoporosis,so)发生发展的决定性因素，同时也是老年性骨质疏松相关的骨缺损(sorbd)难以治疗的主要病理学机制。在老年骨质疏松患者或骨质疏松动物模型中，骨髓间充质干细胞(bmscs)的成骨能力下降，而成脂能力增强，属于功能异常的衰老bmscs(senescence bmscs,sen
‑
bmscs)。因此，在骨缺损部位移植“健康”干细胞成为治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损(sorbd)的重要研究思路。然而，通过移植干细胞治疗仍面临诸多问题；比如移植后细胞存活比例低，定向分化能力有限，干细胞特性逐渐丧失等，最终难以获得长效的骨修复效果。
4.因此，从老年性骨质疏松病理生理学特点出发，着眼于改善自身sen
‑
bmscs的性能，以此促进骨缺损修复成为研究的重点。


技术实现要素：

5.针对目前通过在骨缺损部位移植“健康”干细胞治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损(sorbd)所面临的移植后细胞存活比例低，定向分化能力有限，干细胞特性逐渐丧失，最终难以获得长效的骨修复等问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，本发明的方法提取制得的脐带间充质干细胞外泌体可以作为有效成分用于制备治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损的药物。该药物治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损(sorbd)的机理是通过脐带间充质干细胞外泌体来改善衰老骨髓间充质干细胞，提升骨髓间充质干细胞的成骨能力和增殖能力，从而促进骨缺损修复。
6.本发明是通过如下技术方案实现的：
7.一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
8.一、脐带间充质干细胞的原代培养：
9.(1)将脐带置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗，清洗后剪成小段，然后剖开脐带，剔除一条脐静脉、两条脐动脉，得到脐带华通胶组织；将所述脐带华通胶组织置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗，然后继续裁剪，得到组织块；
10.(2)将所述组织块置于培养皿中静置培养；
11.(3)待细胞生长至80
‑
90％融合时，用胰蛋白酶/edta消化液消化传代，得到脐带间
充质干细胞；
12.二、脐带间充质干细胞的预处理：
13.(1)向所述脐带间充质干细胞中加入雷帕霉素进行预处理；
14.(2)经雷帕霉素预处理后再置于培养皿中进行培养，收集细胞培养上清液，用于外泌体提取；
15.三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：
16.(1)将上述收集的细胞培养上清液置于离心机中低速离心，除去死亡细胞，离心后收集上清液；
17.(2)将低速离心后收集的上清液置于离心机中进行中速离心，除去细胞碎片，离心后收集上清液；
18.(3)将中速离心后收集的上清液置于再次离心机中进行高速离心，离心后收集沉淀；
19.(4)将所收集的沉淀加入缓冲液中进行重悬，得到脐带间充质干细胞外泌体。
20.本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体的提取方法中所涉及的操作步骤均保证为无菌操作，所用试剂均为无菌试剂。
21.具体的，在本发明的方法中所用的脐带来源于正常足月健康剖宫产新生儿的脐带(脐带需在获得产妇及家属之情、同意的前提下获得)。
22.进一步的，一、脐带间充质干细胞的原代培养：步骤(1)将脐带置于含双抗的磷酸盐缓冲液(pbs)中清洗1
‑
3次，清洗后将脐带剪成2
‑
3cm长的小段，然后纵行剖开脐带，剔除一条脐静脉、两条脐动脉，得到脐带华通胶组织；将所述脐带华通胶组织置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗3
‑
5次，然后用眼科剪剪成1mm3的组织块。
23.进一步的，一、脐带间充质干细胞的原代培养：步骤(2)将所述组织块置于培养皿中，将培养皿置于5％co2、37℃的培养箱中倒立放置1
‑
3小时，使组织块自然黏附在皿底上；然后加入dmem+10％血清+1％双抗培养基，使组织块完全浸润在培养基中，正置放在培养箱中，静置培养；每天用显微镜观察细胞生长情况，7天后首次换液，此后3天换液1次。具体的，将组织块均匀种于10cm培养皿中，每个组织块之间间距约1cm。
24.进一步的，二、脐带间充质干细胞的预处理：步骤(1)向所述脐带间充质干细胞中加入40
‑
60nmol/l雷帕霉素预处理2
‑
4小时。
25.进一步的，三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：步骤(1)中的离心速率为1500
‑
2000g，离心20
‑
30分钟，离心温度为4℃。
26.进一步的，三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：步骤(2)中的离心速率为9000
‑
10000g，离心30
‑
40分钟，离心温度为4℃。
27.进一步的，三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：步骤(3)中的离心速率为100000
‑
120000g，离心50
‑
60分钟，离心温度为4℃。先通过低速离心先除去死亡细胞，然后再进行中速离心去除细胞碎片，最后再进行高速离心，收集沉淀。
28.进一步的，三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：步骤(4)将所收集的沉淀加入dpbs缓冲液中进行重悬，得到脐带间充质干细胞外泌体。
29.一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于，采用上述的提取方法提取得到。
30.一种脐带间充质干细胞外泌体的应用，其特征在于，将上述的提取方法提取得到
的脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损的药物。
31.具体的，老年性骨质疏松相关的骨缺损(sorbd)一直是临床骨科医生面临的棘手问题，骨髓间充质干细胞(bmscs)数量减少和衰老(sen
‑
bmscs)导致的功能异常是老年性骨质疏松(so)发生发展的决定性因素，同时也是老年性骨质疏松相关的骨缺损(sorbd)难以治疗的主要病理学机制；从老年性骨质疏松相关的骨缺损(sorbd)病理生理学特点出发，改善自身sen
‑
bmscs的性能，促进骨缺损修复成为相关领域研究的重点。本发明的申请人经研究发现将脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc
‑
mscs)可使sen
‑
bmscs重新恢复成骨能力、衰老相关指标，如炎性相关cox
‑
2、slep mrna表达下降。经过本发明申请人的进一步研究发现，将脐带间充质干细胞(hucb
‑
mscs)分泌的细胞外囊泡(huc
‑
mscs
‑
derived extracellular vesicles,huc
‑
msc
‑
evs)与sen
‑
bmscs共孵育发现，huc
‑
msc
‑
evs可增加成骨相关基因表达，同时发现自噬相关基因beclin
‑
1，lc3表达同步上调。据此可推断，huc
‑
msc
‑
evs可能通过调控自噬恢复了自身sen
‑
bmscs的成骨性能。
32.经过申请人的研究发现人脐带间充质干细胞分泌的细胞外囊泡(即人脐带间充质干细胞外泌体)可以促进sen
‑
bmscs重新恢复成骨能力，增加sen
‑
bmscs数量；进一步我们发现自噬相关基因表达同步上调，可能是外泌体改善sen
‑
bmscs的机制之一。
33.基于申请人的研究发现人脐带间充质干细胞外泌体可以促进sen
‑
bmscs重新恢复成骨能力，增加sen
‑
bmscs数量，促进骨缺损修复，因此本发明提出了一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，并将提取得到的脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损的药物，可以预见的是通过该外泌体制备的药物能够促进sen
‑
bmscs重新恢复成骨能力，提升增殖能力，促进骨缺损修复。
34.本发明的有益效果：
35.(1)针对在骨缺损部位移植健康干细胞治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损中所面临的移植后细胞存活比例低，定向分化能力有限，干细胞特性逐渐丧失，最终难以获得长效的骨修复等问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法；本发明的方法通过使用雷帕霉素预处理的脐带间充质干细胞来提取脐带间充质干细胞外泌体，并将该外泌体用于制备治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损的药物，来改善衰老骨髓间充质干细胞，能够显著提升骨髓间充质干细胞的成骨能力和增殖能力。
36.(2)本发明提供的方法首次发现将huc
‑
msc
‑
evs与sen
‑
bmscs共培养后能够恢复sen
‑
bmscs成骨性能，明显改善骨髓间充质干细胞的衰老状态；分析了huc
‑
msc
‑
evs携带的自噬相关microrna，并进一步揭示了其调控sen
‑
bmscs自噬的信号通路。
37.(3)本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，本发明的提取方法提取制得的脐带间充质干细胞外泌体可以用于制备治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损的药物。该药物治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损(sorbd)的机理是通过提取得到的脐带间充质干细胞外泌体来改善衰老骨髓间充质干细胞，能够显著提升骨髓间充质干细胞的成骨能力和增殖能力，从而促进骨缺损修复。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本
领域的技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
39.图1为实施例1提取的脐带间充质干细胞外泌体的透射电镜图；
40.图2为实施例1提取的脐带间充质干细胞外泌体的粒径分布图；
41.图3
‑
4为实施例1和对比例1提取的脐带间充质干细胞外泌体提升衰老骨髓间充质干细胞(sen
‑
bmscs)的增殖能力图；
42.图5为衰老骨髓间充质干细胞(sen
‑
bmscs)的成骨分化能力图；
43.图6为经对比例1提取的脐带间充质干细胞外泌体改善后衰老骨髓间充质干细胞(sen
‑
bmscs)的成骨分化能力图；
44.图7为经实施例1提取的脐带间充质干细胞外泌体改善后衰老骨髓间充质干细胞(sen
‑
bmscs)的成骨分化能力图。
具体实施方式
45.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.实施例1
47.一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，包括如下步骤：
48.一、脐带间充质干细胞的原代培养：
49.(1)将脐带置于含双抗的磷酸盐缓冲液(pbs)中清洗1次，清洗后将脐带剪成2cm长的小段，再置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗1次，然后纵行剖开脐带，剔除一条脐静脉、两条脐动脉，得到脐带华通胶组织；将所述脐带华通胶组织置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗3次，然后用眼科剪剪成1mm3的组织块(脐带来源于正常足月健康剖宫产新生儿的脐带，得到产妇及家属之情同意的前提下获得)；
50.(2)将所得组织块置于培养皿中，将培养皿置于5％co2、37℃的培养箱中倒立放置2小时，使组织块自然黏附在皿底上；然后加入dmem+10％血清+1％双抗培养基，使组织块完全浸润在培养基中，正置放在培养箱中，静置培养，每天用显微镜观察细胞生长情况，7天后首次换液，此后3天换液1次；
51.(3)待细胞生长至80
‑
90％融合时，用胰蛋白酶/edta消化液消化传代，得到脐带间充质干细胞；
52.二、脐带间充质干细胞的预处理：
53.(1)向所述脐带间充质干细胞中加入50nmol/l雷帕霉素预处理2小时；
54.(2)将经雷帕霉素预处理后的脐带间充质干细胞再置于培养皿中进行培养，收集细胞培养上清液，用于外泌体提取；
55.三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：
56.(1)将上述收集的细胞培养上清液置于离心机中在4℃下以2000g的速度低速离心20分钟，除去死亡细胞，离心后收集上清液；
57.(2)将低速离心后收集的上清液置于离心机中在4℃下以9000g的速度中速离心30
分钟，除去细胞碎片，离心后收集上清液；
58.(3)将中速离心后收集的上清液置于再次离心机中在4℃下以100000g的速度高速离心1小时，离心后收集沉淀；
59.(4)将所收集的沉淀加入dpbs缓冲液中进行重悬，即可得到脐带间充质干细胞外泌体。
60.通过透射电镜(tem)对上述实施例1提取得到的脐带间充质干细胞外泌体进行观察，其结果如图1所示，从图1中可以看出密布的小囊泡，即为外泌体。鉴于外泌体的直径约为30
‑
200nm，因此，我们又利用仪器zetaview pmx120检测了上述外泌体的直径大小(检测的步骤是将外泌体稀释适当倍数，滴加到仪器上，打开程序开始检测，根据仪器读数就可以得到直径的大小)分析了所提取的外泌体的直径大小，如图2所示，从图2中可以看出大部分外泌体的直径都集中在200nm之内。通过上述的测试证明了本发明的方法成功提取了脐带间充质干细胞外泌体。
61.图1的比例尺为200nm；图2中纵坐标代表外泌体个数；横坐标代表直径，单位是nm。
62.实施例2
63.一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，包括如下步骤：
64.一、脐带间充质干细胞的原代培养：
65.(1)将脐带置于含双抗的磷酸盐缓冲液(pbs)中清洗3次，清洗后将脐带剪成3cm长的小段，再置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗1次，然后纵行剖开脐带，剔除一条脐静脉、两条脐动脉，得到脐带华通胶组织；将所述脐带华通胶组织置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗4次，然后用眼科剪剪成1mm3的组织块(脐带来源于正常足月健康剖宫产新生儿的脐带，得到产妇及家属之情同意的前提下获得)；
66.(2)将所得组织块置于培养皿中，将培养皿置于5％co2、37℃的培养箱中倒立放置1小时，使组织块自然黏附在皿底上；然后加入dmem+10％血清+1％双抗培养基，使组织块完全浸润在培养基中，正置放在培养箱中，静置培养，每天用显微镜观察细胞生长情况，7天后首次换液，此后3天换液1次；
67.(3)待细胞生长至80
‑
90％融合时，用胰蛋白酶/edta消化液消化传代，得到脐带间充质干细胞；
68.二、脐带间充质干细胞的预处理：
69.(1)向所述脐带间充质干细胞中加入40nmol/l雷帕霉素预处理4小时；
70.(2)将经雷帕霉素预处理后的脐带间充质干细胞再置于培养皿中进行培养，收集细胞培养上清液，用于外泌体提取；
71.三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：
72.(1)将上述收集的细胞培养上清液置于离心机中在4℃下以1800g的速度低速离心25分钟，除去死亡细胞，离心后收集上清液；
73.(2)将低速离心后收集的上清液置于离心机中在4℃下以9500g的速度中速离心35分钟，除去细胞碎片，离心后收集上清液；
74.(3)将中速离心后收集的上清液置于再次离心机中在4℃下以110000g的速度高速离心50分钟，离心后收集沉淀；
75.(4)将所收集的沉淀加入dpbs缓冲液中进行重悬，即可得到脐带间充质干细胞外
泌体。
76.实施例3
77.一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，包括如下步骤：
78.一、脐带间充质干细胞的原代培养：
79.(1)将脐带置于含双抗的磷酸盐缓冲液(pbs)中清洗3次，清洗后将脐带剪成2cm长的小段，再置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗1次，然后纵行剖开脐带，剔除一条脐静脉、两条脐动脉，得到脐带华通胶组织；将所述脐带华通胶组织置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗5次，然后用眼科剪剪成1mm3的组织块(脐带来源于正常足月健康剖宫产新生儿的脐带，得到产妇及家属之情同意的前提下获得)；
80.(2)将所得组织块置于培养皿中，将培养皿置于5％co2、37℃的培养箱中倒立放置3小时，使组织块自然黏附在皿底上；然后加入dmem+10％血清+1％双抗培养基，使组织块完全浸润在培养基中，正置放在培养箱中，静置培养，每天用显微镜观察细胞生长情况，7天后首次换液，此后3天换液1次；
81.(3)待细胞生长至80
‑
90％融合时，用胰蛋白酶/edta消化液消化传代，得到脐带间充质干细胞；
82.二、脐带间充质干细胞的预处理：
83.(1)向所述脐带间充质干细胞中加入60nmol/l雷帕霉素预处理3小时；
84.(2)将经雷帕霉素预处理后的脐带间充质干细胞再置于培养皿中进行培养，收集细胞培养上清液，用于外泌体提取；
85.三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：
86.(1)将上述收集的细胞培养上清液置于离心机中在4℃下以1500g的速度低速离心30分钟，除去死亡细胞，离心后收集上清液；
87.(2)将低速离心后收集的上清液置于离心机中在4℃下以10000g的速度中速离心40分钟，除去细胞碎片，离心后收集上清液；
88.(3)将中速离心后收集的上清液置于再次离心机中在4℃下以120000g的速度高速离心50分钟，离心后收集沉淀；
89.(4)将所收集的沉淀加入dpbs缓冲液中进行重悬，即可得到脐带间充质干细胞外泌体。
90.对比例1
91.对比例1也提供一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，对比例1与实施例1的区别在于，对比例1中不使用雷帕霉素预处理脐带间充质干细胞，其余的提取过程均与实施例1相同。
92.测试1：检测上述实施例1和对比例1分别提取的脐带间充质干细胞外泌体对于衰老的骨髓间充质干细胞(sen
‑
bmscs)增殖能力的影响，其测试过程：分别将实施例1和对比例1提取的脐带间充质干细胞外泌体与衰老的骨髓间充质干细胞(sen
‑
bmscs)进行共培养(两者的培养条件相同)；采用cck
‑
8检测经与实施例1和对比例1提取的脐带间充质干细胞外泌体共培养后sen
‑
bmscs的增殖能力，其结果如图3
‑
4所示，从图3中可以看出共培养1天后，经过与对比例1和实施例1提取的脐带间充质干细胞外泌体共培养后均可以明显的提升sen
‑
bmscs增殖能力；从图4中可以看出共培养5天后，对比例1和实施例1提取的脐带间充质
干细胞外泌体均可以显著提升sen
‑
bmscs增殖能力；再者从图3和图4的细胞增殖能力结果中还可以明显看出实施例1提取的外泌体(即雷帕霉素预处理后提取的脐带间充质干细胞外泌体)相对于对比例1而言使sen
‑
bmscs的增殖能力更强(图3和图4中的sen
‑
bmscs作为对照；图3和图4中的sen
‑
bmscs+exo代表外泌体与衰老骨髓间充质干细胞；图3和图4中sen
‑
bmscs+ra
‑
exo代表雷帕霉素预处理外泌体与衰老骨髓间充质干细胞)；可以看出本发明方法提取的脐带间充质干细胞外泌体能够显著提升sen
‑
bmscs的细胞增殖能力。
93.测试2：检测上述实施例1和对比例1分别提取的脐带间充质干细胞外泌体对于衰老的骨髓间充质干细胞(sen
‑
bmscs)成骨分化能力的影响，其测试过程为：
94.s1、向sen
‑
bmscs的完全培养基(dmem+10％血清+1％双抗)中添加β甘油磷酸钠(终浓度为10mm)、维生素c(终浓度为50ug/ml)和地塞米松(终浓度为0.1μm)将sen
‑
bmscs的完全培养基制成成骨诱导培养基；由于完全培养基不能诱导sen
‑
bmscs成骨分化，因此需要在完全培养基中加入上述几种组分将其制成成骨诱导培养基；
95.s2、将sen
‑
bmscs在成骨诱导培养基中进行诱导培养7天，然后进行碱性磷酸酯酶显色；使用bcip/nbt碱性磷酸酯酶显色试剂盒(公司：碧云天生物技术有限公司，货号：c3206)进行碱性磷酸酯酶染色具体步骤如下：
96.s2
‑
1、准备染色工作液,取碱性磷酸酯酶显色缓冲液10ml,bcip溶液33μl，nbt溶液66μl，混合均匀配制成bcip/nbt染色工作液；
97.s2
‑
2、bmscs成骨诱导7天后，用4％多聚甲醛室温固定细胞15分钟，之后用pbs冲洗3遍，加入bcip/nbt染色工作液；
98.s2
‑
3、室温避光孵育30分钟，直至显色至预期；
99.s2
‑
4、去除染色工作液，用蒸馏水冲洗1
‑
2次，终止显色反应；
100.s2
‑
5、室温晾干后，用显微镜进行拍照，其成骨分化能力结果如图5
‑
7所示，其中图5为未与上述实施例1和对比例1提取的外泌体进行共培养的sen
‑
bmscs的成骨分化能力，即图5相当于衰老的骨髓间充质干细胞(sen
‑
bmscs)自身经过成骨诱导培养基培养后的成骨分化能力，将图5作为对照以便于区分外泌体改善后sen
‑
bmscs的成骨分化能力。图6为sen
‑
bmscs与对比例1提取的外泌体共培养后，其成骨分化能力结果，将图6与图5对比后发现图6中的成骨细胞增多，说明了成骨分化能力强，由此可以证明对比例1提取的外泌体能够促进sen
‑
bmscs成骨分化能力增强。图7为sen
‑
bmscs与实施例1提取的外泌体共培养后，其成骨分化能力结果，将图7与图5对比后发现图7中的成骨细胞大幅增加，说明了成骨分化能力大幅增强，由此可知实施例1提取的外泌体能够促进sen
‑
bmscs成骨分化能力增强；将图7与图6对比后发现图7中的成骨细胞相对于图6要更多，因此可以证明实施例1提取的外泌体相对于对比例1对于促进sen
‑
bmscs成骨分化能力增强的效果要更好。
101.骨髓间充质干细胞的成骨分化也就是骨髓间充质干细胞逐渐分化为成骨细胞的过程。成骨细胞越多，说明成骨分化能力越强。碱性磷酸酶(alp)是存在于成骨细胞中的一种酶，碱性磷酸酶显色实验阳性细胞数越多，说明成骨细胞越多，说明成骨分化能力越强。我们的结果表明，本方法提取的雷帕霉素预处理后的脐带间充质干细胞外泌体可以显著的促进衰老骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，alp阳性细胞数目显著增加。
102.结论：通过上述测试1和测试2的结论可以发现，经本发明提取方法提取得到的脐带间充质干细胞外泌体对于衰老的骨髓间充质干细胞(sen
‑
bmscs)的增殖能力和成骨分化
能力均具有显著的促进作用。因此，可以我们可以将本发明方法提取的脐带间充质干细胞外泌体用作于制备治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损的药物。
103.上述为本发明的较佳实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。凡由本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。