一株荧光假单胞菌zym-cha0及其在防治芋头重茬病中的应用

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1.本发明属于植物病害生物防治技术领域，更具体的，涉及一株荧光假单胞菌 zym-cha0及其在防治芋头重茬病中的应用。


背景技术：

2.科赫法则是伟大的德国细菌学家罗伯特
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科赫(robert koch，1843～1910年) 提出的一套科学验证方法，用以验证了细菌与病害的关系，柯赫氏法则已被移植并成为植物病理学中一项经典法则，其包括：1.共存性观察：被疑为病原物的生物必须经常被发现于病植物体上。2.分离：必须把该生物从病植物体分离出来，在培养基上养成纯培养，纯培养即只有该种生物而无其它生物的培养物。3.接种：用上述纯培养接种于健康植物上，又引起与原标本相同的病害。
3.农作物尤其是经济作物，品牌建设的好坏直接影响种植户获得的经济利益，而形成品牌需要持续稳定的产品供应。这就要求最大限度的提高土地使用效率。而增加土地使用强度带来的问题是作物重茬引起的病害，我国很多地方重茬病害均非常严重，一般为致病性微生物引起的土传病害，具体到在芋头种植过程中，细菌引起的软腐病占很大比例，但是很多软腐病的致病菌并非一种细菌，很有可能是由多种致病菌引起。防治重茬病要取得良好的效果，首先需要找出明确的病因，其次要有有效的治疗手段。利用科赫法则寻找致病菌是现在普遍认同的做法，找出致病菌后选择有针对性的药剂进行治疗才可以最终获得需要的结果。根际的微生物种群可以被认为是抵御植物根系病原体的第一道防线，利用有益微生物抵抗致病菌，可以减少农药使用量和减轻环境污染，还能增加土壤的生态多样性，以及土壤本身对疾病的缓冲和免疫力。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供了一株荧光假单胞菌zym-cha0，其对细菌性病原菌具有良好的拮抗效果，可保护芋头不被细菌侵害，且能改善芋头品质，提高芋头抗病能力，在防治芋头重茬病中有较好的应用前景。
5.本发明通过下述技术方案实现。
6.本发明目的之一，提供一株荧光假单胞菌zym-cha0，所述荧光假单胞菌 (pseudomonas protegens)zym-cha0保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为cgmcc no:14476；保藏日期为2017年07月31日。
7.本发明目的之二，提供上述荧光假单胞菌zym-cha0在防治芋头重茬病中的应用。
8.本发明目的之三，提供一种防治芋头细菌性病害的生物制剂，其含有上述荧光假单胞菌zym-cha0。
9.作为优选技术方案，所述生物制剂中，荧光假单胞菌zym-cha0的浓度为 od600 15～25、活菌数为20亿cfu/ml～500亿cfu/ml。
10.作为优选技术方案，将所述生物制剂接种于芋头根际土壤来防治芋头细菌性病害。
11.作为优选技术方案，将所述生物制剂蘸根来防治芋头细菌性病害。
12.作为优选技术方案，将所述生物制剂采用随水滴灌或者草炭吸附后，进行沟施或穴施接种于芋头根际土壤来防治芋头细菌性病害。
13.本发明有益效果：本发明荧光假单胞菌zym-cha0对细菌性病原菌具有良好的拮抗效果，可保护芋头不被细菌侵害，且能改善芋头品质，提高芋头抗病能力，在防治芋头重茬病中有较好的应用前景。
附图说明
14.图1为平板对峙法筛选结果图；
15.图2为含有芋头块的单菌纯培养样品培养36小时后的结果图；
16.图3为含有芋头块的单菌纯培养样品培养100小时后的结果图；
17.图4为本发明荧光假单胞菌zym-cha0培养三天后对芋头土壤主要病原菌的拮抗实验结果图；
18.图5为本发明荧光假单胞菌zym-cha0培养一周后对芋头土壤主要病原菌的拮抗实验结果图；
19.图6为本发明荧光假单胞菌zym-cha0对芋头块的保护效果图；
20.图7为本发明荧光假单胞菌zym-cha0对芋头田间种植的长势影响图。
具体实施方式
21.下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
22.实施例1
23.本发明荧光假单胞菌zym-cha0的分离筛选方法。
24.选用实验室分离的三株荧光假单胞菌，与传统生防菌(阳性对照)一起实验，采用滤纸片法筛选，具体筛选步骤为：
25.1、土壤采样：选取健康头茬芋头地块和重茬地块芋头地的土壤，以及少量的当地农田土壤或者当地农作物，分为三组，采用铝制饭盒或相似的容器存放采到的土壤，土壤深度以地表下5-25cm为主，具体如下表：
26.表1土壤采样情况表
27.采样场地位置邱家白庙确切地点村宣传碑旁边地块场地历史芋头种植地块相关细节除去表面浮土后选择性取样采样日期2017-05-10天气晴土壤剖面形态一致
28.2、土壤菌分离纯化菌培养：将采集到的土壤样品过筛后，用无菌水梯度稀释，涂平板，30℃过夜培养，其中平板培养基的选择如下：芽孢杆菌采用生孢培养基；放线菌和真菌分别采用高氏一号和pda培养基；作为补充，对于对当地土壤营养物质有偏向性的细菌采用当地土壤浸出液培养基培养。
29.3、生防菌筛选：涂板挑取20-100个单菌落的平板，将板子上的单克隆用接种针接种标记到另一编号的平板作为分离的纯菌株，结果见图1，初筛大约80 种菌，平板对峙法筛选对模式致病菌株的生长蔓延具有具有明显抑制效果的菌株作为生防菌，结果见图1，筛选得到抑菌效果较好的菌株。
30.将纯培养的致病菌菌落在1ml ep管中用无菌水稀释，然后倾注平板作为底盘菌，上层生防菌株也是发酵液用相同方法稀释后，吸取100微升滴加到滤纸片上吹干或者自然晾干后贴在致病菌平板上。连续观察5天对致病菌的抑菌效果，筛选出抑菌效果最好的菌株即为本发明荧光假单胞菌zym-cha0。
31.实施例2
32.芋头致病菌的筛选。
33.将病变芋头地土壤或病变芋头称重后用十倍无菌水溶解，在摇床上以220 rpm，30℃震荡10min，梯度稀释后分别取相同稀释度样品涂布lb平板和pda 平板。lb平板上以细菌为主，pda平板上真菌、霉菌为主。通过计算lb和pda 平板上单克隆数目初步得出结论致病性土壤中真菌、霉菌总数约为18
×
105，细菌总数约为12
×
105，挑取lb/pda上数量最多的单菌落，作为待测定致病性的单菌纯培养，用于后续使用芋头块测定致病性。
34.将芋头切块，加入上述分离到的纯培养中，含有芋头块的单菌纯培养样品放入培养箱培养不同时间，结果见图2、图3；其中，图2、图3所示编号为1#、 2#、3#、4#、5#、6#、7#的平板分别为1号霉菌、2号细菌、3号细菌、4号细菌、5号霉菌、6号霉菌、7号霉菌的单菌纯培养；如图2所示的是24小时的培养结果，芋头块腐烂变质程度依次为：3号细菌＞7号霉菌＞2号细菌＞4号细菌＞1号霉菌＞6号霉菌＞5号霉菌，3#lb平板上的3号细菌对芋头的侵害最为严重，可以在24小时内导致芋头迅速腐败，其次是7#pda平板上的7号霉菌致病菌，但是7#pda平板上的芋头块腐烂情况较轻。如图3所示，48小时后观察发现2#、3#、4#lb平板所有细菌平板上的芋头均已腐烂，而用于培养霉菌的 1#、5#、6#、7#平板虽然霉菌铺满整个平板，但是芋头块仍然较硬基本无变化，所以该片土壤主要病原菌为细菌，且3号细菌致病性最强、数量最多，为主要需要对抗防治的致病菌对象，2号细菌、4号细菌也需要加以防控。
35.实施例3
36.本发明荧光假单胞菌zym-cha0对实施例2中筛选的致病菌的拮抗作用。
37.图4中，所示的平板编号2#、3#、4#分别为实施例2筛选出的2号细菌、3 号细菌、4号细菌三种芋头致病菌作为平板底盘菌；每个平板中，p
△
为斜面稳定传代十代后的阳性对照，来源为市售荧光假单胞菌普通菌株，pw斜面稳定传代十代后的为本发明菌株zym-cha0，c
△
为初始阳性对照，cw为初始本发明菌株 zym-cha0；由图4可以看出培养三天后，pw和cw均对3号细菌表现出了明显的抑制作用，但是对2号细菌、4号细菌抑制不明显；由图5可以看出，培养一周后，p
△
、pw、c
△
、cw四株菌对2号细菌均表现出了抑制作用，周围可以观察到相似的抑菌圈，但是pw对3号细菌、4号细菌的抑菌圈直径远远大于阳性对照p
△
，培养一周后pw(zym-cha0菌株)对三种主要致病菌均表现出很好的抑制作用，在2号细菌、3号细菌、4号
细菌平板上均表现出了很好的抑菌效果，尤其是对4号细菌有明显抑菌圈，优于对4号细菌观察不到明显的抑菌圈的阳性对照。
38.实施例4
39.本发明荧光假单胞菌zym-cha0对芋头块的保护作用。
40.采用打孔器制作的芋头块直接代替拮抗实验所用的滤纸片，芋头片用本发明荧光假单胞菌zym-cha0菌液浸泡后作为处理组(+p)，并设置不浸泡的对照组 ck，加入至2号细菌、3号细菌、4号细菌三种芋头致病菌的纯培养中，培养 24小时后观察，结果见图6。由图6可知，ck组中3号细菌纯培养中的芋头块完全腐烂，2号、4号出现不同程度的黑褐色病斑，而(+p)处理组芋头基本完好，没有病斑或者腐烂的情况。较ck对照组，本发明荧光假单胞菌浸泡过的芋头块(+p)芋头腐烂情况明显较轻，所以本发明荧光假单胞菌zym-cha0对芋头块有明显的保护作用。
41.实施例5
42.田间防效实施实验
43.1、实验方法
44.实验地点位于青岛市即墨区邱家白庙，该地区为芋头的常年种植用地，芋头叶表有较多黑斑，多有烂根，重茬病发病情况十分严重，首次施肥前后无杀菌剂使用；
45.荧光假单胞菌zym-cha0原始发酵液活菌数为80
×
108cfu/ml-20
×
108cfu/ml；
46.实验共设计两组，每组120-130棵，发酵液稀释100倍后进行灌根，根据芋头生长情况总计追施三次；
47.对照组(ck)：空白水处理；
48.处理组(zym-cha0)：荧光假单胞菌zym-cha0发酵液2.5l灌根。
49.2、结果统计
50.2.1长势比较
51.芋头收获前1-2个月统计病情指数，并对芋头总体生长情况进行拍照，做整体长势对比，具体见图7。由图7可知，较之对照区，采用本发明荧光假单胞菌 zym-cha0处理后，芋头的长势更好。
52.2.2病情比较
53.芋头收获前1-2个月统计病情指数，病叶分级标准如下：
54.0级：无病斑；
55.1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；
56.2级：病斑面积占整个叶面积的6％～10％；
57.3级：病斑面积占整个叶面积的11％～25％；
58.4级：病斑面积占整个叶面积的26％～40％；
59.5级：病斑面积占整个叶面积的40％以上；
60.其中，病情指数＝∑(各级病叶数
×
相对级数)/(调查总数
×
最高分级级数)
×
100，具体结果见下表：
61.表2病情级别统计表
62.病情级别012345合计病情指数zym-cha0105246223413735％
ck012565014313551％
63.2.3安全性观察
64.调查供试药剂处理后对芋头叶片、茎秆等有无药害产生，以及对芋头生长有无不良影响。以对照区作比对，重点观察药剂处理区有无矮化、褪绿、畸形等症状出现。如有发现，按药害程度分级方法进行记录，用以明确供试药剂对芋头的安全性。药害分级方法如下：
65.－：无药害；
66.+：轻度药害，不影响作物正常生长；
67.++：明显药害，可复原，不会造成作物减产；
68.+++：高度药害，影响作物正常生长，对作物产量和品质都造成一定损失，一般要求补偿部分经济损失；
69.++++：药害严重，作物生长受阻，产量和质量损失严重，必须补偿经济损失；
70.安全性观察结果：与对照区相比，处理组的病情均小于对照区相比，所以药害等级整体为“－”，即无药害。
71.2.4芋头产量与品质统计
72.每组随机统计大约五十个芋头的重量，结果见表4，并检验检测芋头中粗多糖、蛋白质和脂肪的含量，结果见表3。
73.表3芋头营养成分检测结果
74.营养成分％粗多糖/％脂肪/％蛋白质/％ck4.210.22.03zym-cha04.510.32.01
75.由表3可知，在田间应用上，使用本发明荧光假单包菌zym-cha0较未添加组芋头的粗多糖含量提高7％和脂肪含量提高50％，可见芋头品质得到了改善，抗病能力得以提高。
76.表4芋头重量统计情况
77.[0078][0079]
由表4可知，无论单果的总重还是优良子芋的平均重量，处理组均高于对照组，其中优良子芋重量的重量增加明显，约为40％。