微流体细胞培养的制作方法

微流体细胞培养
1.本技术是申请号为2016800363322，申请日为2016年4月22日，发明名称为“微流体细胞培养”的中国专利申请的分案申请。
2.发明背景
3.在生物科学和相关领域中，培养一个或多个细胞可能是有用的。本发明的一些实施方案包括用于在微流体装置中培养细胞或细胞群的装置和方法。


技术实现要素：

4.一方面，提供了用于培养一个或多个生物细胞的微流体装置，其包括：液流区域(flow region)，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其包括分离区域和连接区域，所述分离区域与所述连接区域为流体性连接，且所述连接区域包括到所述液流区域的近端开口(proximal opening)，其中所述至少一个生长腔室还包括至少一个表面，所述至少一个表面被条件化(conditioned to)为在微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性(portability)或其任意组合。在一些实施方案中，微流体装置的分离区域可以被配置为含有第二流体培养基，并且其中当所述液流区域和所述至少一个生长腔室分别被第一和第二流体培养基基本充满时，所述第二流体培养基的组分可以扩散进入所述第一流体培养基和/或所述第一流体培养基的组分可以扩散进入所述第二流体培养基，并且所述第一培养基可以基本不流入所述分离区域。在一些实施方案中，所述微流体装置还可以包括微流体通道，所述微流体通道具有所述液流区域的至少一部分，并且其中所述至少一个生长腔室的连接区域可以直接向所述微流体通道内开放。
5.在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以用一种或多种在微流体装置内支持细胞可移植性的试剂所条件化。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以被包括亚烷基醚部分的聚合物所条件化。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以被包括糖部分的聚合物所条件化。在一些实施方案中，包括糖部分的聚合物可以包括葡聚糖。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以被包括氨基酸部分的聚合物所条件化。在一些实施方案中，聚合物可以是牛血清白蛋白(bsa)或dnase 1。在其他实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以被包括羧酸部分、磺酸部分、核酸部分或膦酸部分的聚合物所条件化。在一些实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以被包括羧酸部分、磺酸部分、核酸部分或膦酸部分的聚合物所条件化。
6.在微流体装置的各种实施方案中，至少一个经条件化的表面包括共价连接至微流体装置的表面的连接基团，且该连接基团可以连接至被配置为在微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，该连接基团可以是硅氧基连接基团。在其他实施方案中，该连接基团可以是膦酸酯连接基团。在各种实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括烷基或氟代烷基部分。在一些实施方案中，氟代烷基部分可以是全氟代烷基部分。在一些实施方案中，该烷基或氟代烷基部分可以具有大于10个碳的骨架链长度。烷基或氟代烷基部分可以具有线性结构。在微流体装置的各种实施方案中，至少一个经条件化的表面的连接基团可以直接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植
性或其任意组合的部分。在其他实施方案中，连接基团可以间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，连接基团可以经由连接部分而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，连接基团可以包括亚三唑基部分。在其他实施方案中，连接基团可以包括一个或多个亚芳基部分。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括糖部分。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括亚烷基醚部分。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括氨基酸部分。或者，至少一个经条件化的表面可以包括两性离子。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括膦酸部分或羧酸部分。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面包括氨基或胍部分。在一些其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团 (包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
7.在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括至少一个细胞贴附阻断分子。在一些实施方案中，该至少一个细胞贴附阻断分子可以破坏激动蛋白丝形成、阻断整合素受体或减少细胞与dna污染的表面的结合。在一些实施方案中，该至少一个细胞贴附阻断分子可以是含rgd的肽。在其他实施方案中，该至少一个细胞贴附阻断分子可以是细胞松弛素b、抗整合素的抗体、纤连蛋白的抑制剂，其可以包括小分子或dnase 1蛋白质。在其他实施方案中，该至少一个细胞贴附阻断分子可以包括超过一种类型的细胞贴附阻断分子的组合。
8.在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括可裂解部分。在一些实施方案中，可裂解部分可以被配置为允许破坏经条件化的表面，从而促进培养后的一个或多个生物细胞的可移植性。
9.在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括哺乳动物血清的一种或多种组分。该哺乳动物血清的一种或多种组分可以包括补充物、胎牛血清(fbs)或胎牛血清(fcs)。
10.在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置还可以包括具有介电电泳(dep)配置的衬底(substrate)。在一些实施方案中，具有dep配置的衬底可以被配置为将一个或多个生物细胞引入或移出生长腔室。dep配置可以是光致动的。
11.在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以被配置为在至少约30℃的温度下稳定。
12.在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置的至少一个生长腔室的分离区域可以具有足以支持细胞扩增至约100个细胞的范围的尺寸。在一些实施方案中，可以将不超过1
×
102个生物细胞保持在至少一个生长腔室中，且该至少一个生长腔室的体积可以小于或等于约2
×
106立方微米。在其他实施方案中，可以将不超过1
×
102个生物细胞保持在至少一个生长腔室中，且该至少一个生长腔室的体积可以小于或等于约1
×ꢀ
107立方微米。
13.在微流体装置的各种实施方案中，装置还可以包括至少一个入口，其被配置为将第一或第二流体培养基输入到液流区域中；以及至少一个出口，其被配置为当第一培养基离开液流区域时接收该第一培养基。在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置还可以包括至少一个生长腔室或其分离区域上方的可变形盖子区域，从而压低该可变形盖子区域施加足以将生物细胞从分离区域输出到液流区域的力。在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置可以包括盖子，其中该盖子的至少一部分可以是透气性的，从而提供进入位于微流体装置中的流体培养基的气体分子的源。盖子的透气性部分可以位于至少一个生长腔室的上方。在其他实施方案中，盖子的透气性部分可以位于液流区域的上方。在其他实施方案中，该至少一个生长腔室可以包括多个生长腔室。
14.在各种实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括多种生物细胞。在微流体装置的各种实施方案中，至少一个生长腔室可以包括至少一个表面，该至少一个表面被条件化为支持哺乳动物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。在其他实施方案中，至少一个生长腔室可以包括至少一个表面，该至少一个表面被条件化为支持免疫细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。在其他实施方案中，免疫细胞可以是淋巴细胞或白细胞。在一些其他实施方案中，免疫细胞可以是b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞或树突细胞。
15.在微流体装置的各种实施方案中，至少一个生长腔室可以包括至少一个表面，该至少一个表面被条件化为支持贴壁细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
16.在微流体装置的各种实施方案中，至少一个生长腔室可以包括至少一个表面，该至少一个表面被条件化为支持杂交瘤细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
17.在微流体装置的各种实施方案中，至少一个生长腔室可以包括至少一个表面，该至少一个表面被条件化为支持生物细胞的单个细胞和相应的克隆集落的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
18.另一方面，提供了用于在微流体装置上培养一个或多个生物细胞的系统，该系统包括微流体装置，该微流体装置具有液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其中所述生长腔室具有至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为在微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。该至少一个生长腔室可以包括分离区域和连接区域，所述分离区域与所述连接区域为流体性连接，且所述连接区域具有到所述液流区域的近端开口。在一些实施方案中，微流体装置的分离区域可以被配置为含有第二流体培养基，并且当所述液流区域和所述至少一个生长腔室分别被第一和第二流体培养基基本充满时，所述第二流体培养基的组分可以扩散进入所述第一流体培养基和/或所述第一流体培养基的组分可以扩散进入所述第二流体培养基，并且所述第一培养基可以基本不流入所述分离区域。在一些实施方案中，所述微流体装置还可以包括微流体通道，所述微流体通道包括所述液流区域的至少一部分，并且其中所述至少一个生长腔室的连接区域可以直接向所述微流体通道内开放。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置，以任何组合具有任意元件。
19.在该系统的各种实施方案中，该系统还可以包括流控制器，其被配置为灌注至少第一流体培养基。控制器被配置为非连续地灌注至少第一流体培养基。
20.在该系统的各种实施方案中，系统的微流体装置还可以包括具有介电电泳(dep) 配置的衬底，该衬底被配置为将一个或多个生物细胞引入或移出生长腔室。dep配置可以是
光致动的。
21.在该系统的各种实施方案中，系统还可以包括储液器，其被配置为含有第一流体培养基，其中该储液器与微流体装置为流体性连接。储液器可以被配置为被气体环境接触，该气体环境能够使第一流体培养基被溶解的气体分子所饱和。
22.在该系统的各种实施方案中，系统还可以包括与微流体装置的至少一个入口连接的传感器，其中该传感器可以被配置为检测第一流体培养基的ph。在该系统的各种实施方案中，系统还可以包括与至少一个出口连接的传感器，其中传感器被配置为在第一流体培养基离开微流体装置时检测第一流体培养基的ph。在一些实施方案中，传感器可以是光传感器。
23.在该系统的各种实施方案中，系统还可以包括检测器，其被配置为捕捉至少一个生长腔室和其中所含的任何生物细胞的图像。在一些实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括一种或多种哺乳动物细胞。在其他实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括一种或多种杂交瘤细胞。在其他实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括一种或多种淋巴细胞或白细胞。或者一个或多个生物细胞可以包括一种或多种贴壁细胞。
24.在该系统的各种实施方案中，生长腔室中的一个或多个生物细胞可以是单个细胞且集落可以是生物细胞的克隆集落。
25.另一方面，提供了一种组合物(composition)，其包括具有介电电泳(dep)配置和表面的衬底；以及共价连接至衬底表面的氧化物部分的经条件化的表面。组合物可以具有式1或式2的结构，并且可以具有本文所定义的式1或式2的元件的任何值：
26.在组合物的一些实施方案中，经条件化的表面可以包括共价连接至表面的氧化物部分的连接基团，且连接基团可以连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，连接基团可以是硅氧基连接基团。在其他实施方案中，连接基团可以是膦酸酯基团。在一些实施方案中，连接基团可以直接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，连接基团可以间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，连接基团可以经由与连接部分的连接而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，连接基团可以经由与连接部分的第一末端的连接而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接部分还可以包括线性部分，其中线性部分的骨架包含1至200 个非氢原子，其选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合。在一些实施方案中，连接部分还可以包括亚三唑基部分。在一些实施方案中，亚三唑基部分可以中断连接部分的线性部分或者可以在第二末端连接至连接部分的
线性部分。在其他实施方案中，线性部分的骨架可以包括亚芳基部分。
27.在各种实施方案中，被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以包括烷基部分、氟代烷基部分、单糖或多糖、醇部分、多元醇部分、亚烷基醚部分、聚电解质部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸盐阴离子部分、羧酸甜菜碱部分、磺基甜菜碱部分、氨基磺酸部分或氨基酸部分。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括氨基酸、烷基部分、全氟代烷基部分、葡聚糖部分和/或亚烷基醚部分。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括烷基或全氟代烷基部分。在一些实施方案中，烷基或全氟代烷基部分具有超过10个碳的骨架链长度。在各种实施方案中，经条件化的表面还可以包括一个或多个可裂解部分。可裂解部分可以被配置为允许破坏经条件化的表面，从而促进培养后的一个或多个生物细胞的可移植性。
28.另一方面，提供了一种用于在微流体装置中培养至少一种生物细胞的方法，所述微流体装置具有液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，该方法包括以下步骤：向所述至少一个生长腔室引入至少一种生物细胞，其中所述至少一个生长腔室被配置为具有至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合；以及孵育所述至少一种生物细胞至少足够长的一段时间，以扩增所述至少一种生物细胞以产生生物细胞的集落。该至少一个生长腔室可以包括分离区域和连接区域，所述分离区域与所述连接区域为流体性连接，且所述连接区域具有到所述液流区域的近端开口。在一些实施方案中，微流体装置的分离区域可以被配置为含有第二流体培养基，并且其中当所述液流区域和所述至少一个生长腔室分别被第一和第二流体培养基基本充满时，所述第二流体培养基的组分可以扩散进入所述第一流体培养基和/或所述第一流体培养基的组分可以扩散进入所述第二流体培养基，并且所述第一培养基可以基本不流入所述分离区域。在一些实施方案中，微流体装置还可以包括微流体通道，所述微流体通道具有所述液流区域的至少一部分，并且其中所述至少一个生长腔室的连接区域可以直接向所述微流体通道内开放。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置，以任何组合具有任意元件。
29.在该方法的一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括共价连接至表面的连接基团，此外，其中连接基团连接至被配置为支持微流体装置内的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些其他实施方案中，被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以包括烷基或氟代烷基 (其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括烷基或全氟代烷基部分。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括亚烷基醚部分或葡聚糖部分。
30.在该方法的一些实施方案中，该方法可以包括条件化所述至少一个生长腔室的至少一个表面的步骤。在一些实施方案中，条件化可以包括用包括聚合物的条件化试剂来处
理所述至少一个生长腔室的至少一个表面。在其他实施方案中，条件化可以包括用哺乳动物血清的一种或多种组分来处理所述至少一个生长腔室的至少一个表面。在其他实施方案中，条件化可以包括用至少一种细胞贴附阻断分子来处理所述至少一个生长腔室的至少一个表面。
31.在该方法的一些实施方案中，向所述至少一个生长腔室引入至少一种生物细胞可以包括使用具有足够强度的介电电泳(dep)力来移动所述至少一种生物细胞。在一些实施方案中，使用dep力可以包括光致动该dep力。
32.在该方法的一些实施方案中，该方法还可以包括在孵育步骤期间灌注第一流体培养基的步骤，其中将第一流体培养基经由微流体装置的至少一个入口引入，并经由微流体装置的至少一个出口输出，其中在输出时，第一流体培养基任选地包括来自第二流体培养基的组分。
33.在该方法的一些实施方案中，该方法还可以包括在孵育步骤之后的使经条件化的表面的一个或多个可裂解部分裂解的步骤，从而促进一个或多个生物细胞从生长腔室或其分离区域输出并进入液流区域。
34.在该方法的一些实施方案中，该方法还可以包括使一个或多个生物细胞从生长腔室或其分离区域输出并进入液流区域的步骤。
35.在该方法的一些实施方案中，至少一种生物细胞可以包括哺乳动物细胞。在该方法的其他实施方案中，至少一种生物细胞可以包括至少一种免疫细胞。在该方法的其他实施方案中，所述至少一种免疫细胞可以包括淋巴细胞或白细胞。在该方法的一些其他实施方案中，所述至少一种免疫细胞可以包括b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞或树突细胞。在其他实施方案中，至少一种生物细胞可以包括贴壁细胞。或者，至少一种生物细胞可以包括杂交瘤细胞。
36.在该方法的一些实施方案中，向至少一个生长腔室中引入至少一种生物细胞的步骤可以包括向生长腔室中引入单个细胞，且通过孵育步骤产生的生物细胞的集落可以是克隆集落。
37.另一方面，提供了用培养生物细胞的试剂盒，其包括微流体装置，该微流体装置具有：液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其包括至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为在微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。至少一个生长腔室可以包括分离区域和连接区域，所述分离区域与所述连接区域为流体性连接，且所述连接区域具有到所述液流区域的近端开口。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置，具有元件的任意组合。在一些实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括烷基部分、氟代烷基部分、单糖或多糖部分、醇部分；多元醇部分；亚烷基醚部分；聚电解质部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸酯部分；羧酸甜菜碱部分、磺基甜菜碱部分；氨基磺酸部分；或氨基酸部分。在一些实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面包含糖部分、亚烷基醚部分、烷基部分、氟代烷基部分或氨基酸部分中的至少一种。在一些实施方案中，烷基或氟代烷基部分具有超过10个碳的骨架链长度。
38.在试剂盒的各种实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括共价连接至微流体装置的表面的连接基团，且该连接基团可以连接至被配置为支持微流体装置内的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施
方案中，连接基团可以是硅氧基连接基团。在其他实施方案中，连接基团可以是膦酸酯连接基团。在一些实施方案中，连接基团可以直接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在其他实施方案中，连接基团可以间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接基团可以经由连接部分而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接基团可以经由与连接部分的第一末端的连接而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在各种实施方案中，连接部分还可以包括线性部分，其中线性部分的骨架包含1至200个非氢原子，其选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合。在一些实施方案中，连接部分可以包括亚三唑基部分。
39.在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒还可以包括表面条件化试剂。在一些实施方案中，表面条件化试剂可以包括聚合物，该聚合物包含亚烷基醚部分、羧酸部分、磺酸部分、膦酸部分、氨基酸部分、核酸部分或糖部分中的至少一种。在一些实施方案中，表面条件化试剂可以包括聚合物，该聚合物包括亚烷基醚部分、氨基酸部分和/或糖部分中的至少一种。
40.在其他实施方案中，表面条件化试剂可以包括至少一种细胞贴附阻断分子。在一些实施方案中，所述至少一种细胞贴附阻断分子可以破坏激动蛋白丝形成、阻断整合素受体或减少细胞与dna污染的表面的结合。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以是细胞松弛素b、含rgd的肽、纤连蛋白的抑制剂、抗整合素的抗体或 dnase 1蛋白质。在一些实施方案中，表面条件化试剂可以包括超过一种细胞贴附阻断分子的组合。
41.在其他实施方案中，表面条件化试剂可以包括哺乳动物血清的一种或多种组分。在一些实施方案中，哺乳动物血清可以是胎牛血清(fbs)或胎牛血清(fcs)。
42.在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒还可以包括培养基添加物，其包括被配置为对生长腔室的至少一个表面的条件化进行补充的试剂。培养基添加物可以包括聚合物。
43.在试剂盒的各种实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括可裂解部分。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括被配置为使经条件化的表面的可裂解部分裂解的试剂。
44.在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒还可以包括至少一种检测生物细胞的状态的试剂。
45.附图简要说明
46.图1示出根据本发明一些实施方案的与微流体装置和相关联的控制设备一起使用的系统的实例。
47.图2a和图2b示出根据本发明一些实施方案的微流体装置。
48.图2c和图2d示出根据本发明一些实施方案的生长腔室。
49.图2e示出根据本发明一些实施方案的详细的生长腔室。
50.图2f示出根据本发明实施方案的微流体装置。
51.图3a示出根据本发明一些实施方案的与微流体装置和相关联的控制设备一起使用的系统的具体实例。
52.图3b示出根据本发明一些实施方案的成像装置。
53.图4a-c显示微流体装置的另一实施方案，包括本文所用的生长腔室的另一实例。
54.图5a至5e各自代表能够向微流体装置提供经条件化的培养基以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的系统组件的实施方案。
55.图6是具有一个或多个能够检测进入和/或离开微流体装置的培养基的ph的传感器的微流体装置的表现形式。
56.图7是用于在微流体装置灌注流体培养基的方法的一个实施方案的实例。
57.图8是用于在微流体装置中灌注流体培养基的方法的另一个实施方案的实例。
58.图9是提供增强的支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的经条件化的表面的示意性表现形式。
59.图10a-10e是根据本文所述方法的培养实验的一个实施方案的照片表现形式。
60.图11a是根据本文所述方法的培养实验的另一个实施方案的照片表现形式，显示在将细胞置于装置的生长腔室中之前的微流体装置。
61.图11b是图11a的培养实验的实施方案的照片表现形式，其处于将一个细胞置于微流体装置的一个生长腔室中时稍后的时间。
62.图12a-12c是图11a和b的培养实验的实施方案的照片表现形式，其处于稍后的时间点，显示图11b的细胞在孵育期间的细胞扩增。
63.图13a-13c是图11a-b和图12a-12c的培养实验的实施方案的照片表现形式，其处于稍后的时间点，显示在孵育期间结束之后输出扩增的细胞。
64.图14a和14b是在具有至少一个经条件化的表面的微流体装置中另一个培养实验的实施方案的照片表现形式。
具体实施方式
65.微流体环境提供了机会，以便为细胞或细胞群提供局部化环境，以时间依赖的方式和位置依赖的浓度向细胞或细胞群提供营养物和/或可溶性细胞生长信号传导物质。这些条件可以代表更类似于体内的生长环境，或者允许偏离这种典型条件，以允许研究非标准条件以及在非标准条件下的生长。使用标准化的大规模细胞培养方法不能满足这些要求。然而，需要进行改进，以更容易地控制一个或多个细胞，以便：a)将细胞置于有助于支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的微流体环境中；b)成功地保持细胞和/或扩增细胞的群体；和/或c)定义导致成功的生长和/或保持的条件。本文所述的系统和方法允许更精确的细胞处理、环境控制和用于微流体细胞培养的细胞分离技术，并且可以用于生产例如克隆细胞群体。
66.本说明书描述了本发明的示例性实施方案和应用。然而，本发明不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于在本文中描述的方式或者示例性实施方案和应用运行的方式。而且，附图可以显示简化的或局部的视图，并且为了清楚起见，附图中的元件尺寸可以被夸大或者可以不按比例。此外，当在本文中使用术语“在
…
上”、“连接至”或“耦接至”时，一个元件(例如，材料、层、衬底等)可以“在另一个元件上”、“连接至另一个元件”或“耦接至另一个元件”，而不管该一个元件直接在另一个元件上、连接或耦接至该另一个元件，还是有一个或多个介入元件在该一个元件和该另一个元件之间。另外，若提供方向(如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、之下、之上、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)，则其是相
对的，并且仅仅提供其是以示例的方式并且是为了便于说明和讨论，而不是限制的方式。此外，在提及一系列元件 (例如元件a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列出的元件自身的任何一个、少于全部所列出的元件的任何组合和/或全部所列出的元件的组合。说明书中的段落划分仅仅是为了便于查看，并且不限制所讨论的元件的任何组合。
67.如本文所使用的，“基本上”是指足以达到预期目的。因此，术语“基本上”允许基于绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等进行诸如本领域普通技术人员可以预期，但对总体性能没有显著影响的小的、不重要的改变。当针对数值或者可以被表示为数值的参数或特征使用时，“基本上”是指在百分之十以内。
68.术语“多个”是指多于一个。如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、 7、8、9、10个或更多。
69.如本文所用，“空气”是指在地球大气中占主要的气体的组合物。四种最丰富的气体是氮气(通常以约78体积％例如约70-80％范围内的浓度存在)、氧气(通常以海平面处约20.95体积％例如约10％至约25％范围内的浓度存在)、氩气(通常以约1.0体积％例如约0.1％至约3％范围内的浓度存在)和二氧化碳(通常以约0.04体积％例如约 0.01％至约0.07％范围内的浓度存在)。空气可以含有其他痕量气体，例如甲烷、一氧化二氮或臭氧；痕量污染物和有机物质例如花粉、柴油颗粒等等。空气可以包括水蒸气 (通常以约0.25％存在，或者可以以约10ppm至约5体积％存在)。可以作为经过滤的受控的组合物提供空气用于培养实验中，并且可以如本文所述地被条件化。
70.如本文所使用的，术语“置于”涵盖其含义“位于”。
71.如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是这样的装置：其包括被配置为保持流体的一个或多个独立微流体管路，每个微流体管路包括流体上互连的管路元件，包括但不限于，一个或多个区域、一个或多个液流路径、一个或多个通道、一个或多个腔室和/或一个或多个坞(pens)以及被配置为允许流体(以及可选地，悬浮在流体中的微物体(micro-objects))流入和/或流出微流体装置的至少两个端口(port)。通常，微流体装置的微流体管路将包括至少一个微流体通道和至少一个腔室，并且将保持小于约1ml体积的流体，例如，小于约750、500、250、200、150，100、75、50、25、 20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2微升。在某些实施方案中，微流体管路保持大约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、 10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300微升的流体。
72.如本文所用，“纳流体装置”(nanofluidic device)或“纳流体设备”(nanofluidicapparatus)是一类微流体装置，其具有包含至少一个管路元件的微流体管路，该管路元件被配置为保持小于约1微升体积的流体，例如，小于约750、500、250、200、150、 100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nl或更少。通常，纳流体装置将包括多个管路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、 50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多个)。在某些实施方案中，至少一个管路元件中的一个或多个(例如全部)被配置为保持以下体积的流体：约100pl至1nl、100pl至2nl、100pl至5nl、250pl至 2nl、250pl至5nl、250pl至10nl、500pl至5nl、500pl至10nl、500pl至 15nl、750pl至10nl、750pl至15nl、750pl至20nl、1至10nl、1至15nl、 1至20nl、1至25nl或1至50nl。在其它实施方案中，至少一
个管路元件中的一个或多个(例如全部)被配置为保持以下体积的流体：约100至200nl、100至300nl、 100至400nl、100至500nl、200至300nl、200至400nl、200至500nl、200至 600nl、200至700nl、250至400nl、250至500nl、250至600nl或250至750 nl。
73.如本文所使用的“微流体通道”或“液流通道”是指微流体装置的液流区域，其具有明显长于水平和垂直尺寸的长度。例如，液流通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少300倍、长度的至少400倍、长度的至少500倍或更长。在一些实施方案中，液流通道的长度范围为约20,000微米至约100,000微米，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，水平尺寸范围为约100微米至约1000微米(例如，约 150至约500微米)，且垂直尺寸范围为约25微米至约200微米，例如，约40至约150 微米。应指出的是，液流通道可以在微流体装置中具有多种不同的空间构造，并且因此不限于理想的线性元件。例如，液流通道可以是或者包括具有以下配置的一个或多个部分：弯曲、弯折、螺旋、倾斜、下降、分叉(例如，多个不同的液流路径)及其任何组合。此外，液流通道可以具有沿其路径的不同的横截面面积(扩大和收缩)，以在其中提供期望的流体流动。
74.如本文所使用的，术语“阻塞”通常是指足够大的凸块或类似类型的结构，以便部分地(但不完全)阻止目标微物体在微流体装置中的两个不同区域或管路元件之间移动。两个不同的区域/管路元件可以是例如微流体孵育腔室和微流体通道、或者微流体孵育腔室的连接区域和分离区域。
75.如本文所使用的，术语“收缩”通常是指微流体装置中管路元件(或两个管路元件之间的界面)的宽度变窄。收缩可以位于例如微流体孵育腔室与微流体通道之间的界面处，或者微流体孵育腔室的分离区域与连接区域之间的界面处。
76.如本文所使用的，术语“透明”是指允许可见光通过但是在光通过时基本不改变光的材料。
77.如本文所用，术语“微物体”通常是指可以根据本发明而被分离和收集的任何微观物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、luminex
tm
珠等)；磁珠；微米棒(microrods)；微细线(microwires)；量子点等；生物微物体，例如细胞(例如，胚胎、卵母细胞、精细胞、从组织分离的细胞、真核细胞、原生细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、免疫细胞(包括但不限于t细胞、 b细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突细胞等等)、杂交瘤、培养的细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞(包括但不限于循环肿瘤细胞)、感染细胞、转染和/或转化细胞(包括但不限于cho细胞)、报道细胞、原核细胞等)；生物细胞器(如核)；囊泡或复合物；合成泡囊；脂质体(例如，合成的或由膜制剂衍生的)；脂质纳米筏(nanorafts) (如ritchie et al.(2009)reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayernanodiscs,method enzymol.,464:211-231(里奇等人(2009年)，磷脂双分子层纳米盘中的膜蛋白的重组，方法酶学，464:211-231)中所描述的)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附着于细胞的微珠、脂质体包覆的微珠、脂质体包覆的磁珠等)。这些珠还可以具有共价或非共价连接的其它部分/分子，例如能够在测定中使用的荧光标记、蛋白质，小分子信号传导部分、抗原或化学/生物物质。
78.如本文所使用的，术语“细胞”是指生物细胞，其可以是植物细胞、动物细胞(如，哺乳动物细胞)、细菌细胞、真菌细胞等等。哺乳动物细胞可以例如来自人、小鼠、大鼠、马、山
羊、绵羊、牛、灵长类动物等等。
79.如果集落中能够繁殖的所有活细胞都是衍生自单个母细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆的”。术语“克隆的细胞”是指同一克隆集落的细胞。
80.如本文所使用的，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(如，2-20、4-40、 6-60、8-80、10-100、20-200、40-400、60-600、80-800、100-1000或超过1000个细胞)。
81.如本文所使用的，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包括流体和气体组分二者的环境，这些组分提供保持细胞存活和/或扩增所必须的条件。
82.如本文所使用的，术语“扩增”在涉及细胞时是指增加细胞的数目。
83.本文所提及的“透气性的”意味着材料或结构对氧气、二氧化碳或氮气中的至少一种是可渗透的。在一些实施方案中，透气性的材料或结构对氧气、二氧化碳和氮气中的一种以上是可渗透的，并且还可以对所有这三种气体都是可渗透的。
84.流体培养基的“组分”是存在于培养基中的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖类、碳水化合物、脂类、脂肪酸、胆固醇、代谢产物等。
85.如本文关于流体培养基所使用的，“使
…
扩散”和“扩散”是指流体培养基的组分沿着浓度梯度的热力学移动。
86.短语“培养基的流动”是指流体培养基的整体移动，其首先是由于扩散之外的任何机制。例如，培养基的流动可以包括由于点之间的压力差而从一个点到另一个点的流体培养基的移动。这样的流动可以包括液体的连续的、脉冲的、周期的、随机的、间歇的或往复的流动，或者其任何组合。当一种流体培养基流入到另一种流体培养基中时，可以导致培养基的湍流和混合。
87.短语“基本上没有流动”是指流体培养基的流速在时间上的平均值小于材料(例如，感兴趣的分析物)的组分扩散到流体培养基中或者在流体培养基内扩散的速率。这种材料的组分的扩散速率可取决于例如温度、组分的大小以及组分与流体培养基之间的相互作用的强度。
88.如本文关于微流体装置内的不同区域所使用的，短语“流体性连接”是指当不同区域基本上被液体(诸如流体培养基)填充时，每个区域中的流体被连接以形成流体的单个本体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体培养基)在组成上一定是相同的。相反，在微流体装置的不同的流体性连接的区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，如蛋白质、碳水化合物、离子或其它分子)，其随着溶质沿着其各自的浓度梯度移动和/或由于流体流过该装置而不断变化。
89.微流体(或纳流体)装置可以包括“扫过”(swept)区域和“未扫过”(unswept) 区域。如本文所使用的，“扫过”区域包括微流体管路的一个或多个流体性互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件均经历培养基的流动。扫过区域的管路元件可以包括例如区域、通道以及腔室的全部或部分。如本文所使用的，“未扫过”区域包括微流体管路的一个或多个流体性互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件基本上都不经历流体流动。未扫过区域可以与扫过区域为流体性连接，假设该流体性连接被配置为使得在扫过区域与未扫过区域之间能够扩散培养基，但基本上没有培养基的流动。因此，微流体装置可以被配置为基本上使未扫过区域与扫过区域中的培养基的流分离，同时使得在
扫过区域与未扫过区域之间基本上仅能够进行扩散流体连通。例如，微流体装置的液流通道是扫过区域的实例，而微流体装置的分离区域(下文将进一步详细描述)是未扫过区域的示例。
90.如本文所使用的，流体培养基流的“未扫过”速率是指这样的流速：其足以允许生长腔室的分离区域中的第二流体培养基的组分扩散进入液流区域中的第一流体培养基和/或允许第一流体培养基的组分扩散进入分离区域中的第二流体培养基；并且其中第一培养基基本上不流入分离区域。
91.如本文所使用的，“液流路径”是指限定并经受培养基流动轨迹的一个或多个流体性连接的管路元件(例如，一个或多个通道、一个或多个区域、一个或多个腔室等)。因此，液流路径是微流体装置的扫过区域的实例。其它管路元件(例如，未扫过区域) 可以与包括液流路径的管路元件为流体性连接，而不经受液流路径中培养基的流动。
92.如本文所使用的，“亚芳基”是指具有六至十个环原子的芳香性基团(如，c6-c10 芳香性基团或c6-c10芳基)，其具有至少一个具有共轭π电子体系的环，该环是碳环 (例如，苯基、芴基和萘基)，且具有一个或两个与分子其他部分的连接点。每当其在本文中出现，诸如“6至10”的数值范围是指给定范围中的每个整数；例如，“6至10 个环原子”意味着芳基可以由6个环原子、7个环原子等等，直至并包括10个环原子组成。该术语包括单环和稠环多环(即，共享相邻的环原子对的环)基团。亚芳基的实例包括但不限于亚苯基、亚萘基等等。亚芳基部分可以进一步被取代，或者可以除了与分子的其他部分连接的一个或两个点之外不具有其他取代基。
93.如本文所使用的，“亚杂芳基”是指5-至18-元芳香性基团(例如，c5-c13杂芳基)，其包括一个或多个选择氮、氧和硫的环杂原子，且其可以包括单环、二环、三环或四环环体系，且修饰语“亚”表明杂芳基环体系具有一个或两个与分子其他部分的连接点。每当其在本文中出现，诸如“5至18”的数值范围是指给定的范围中每个整数；例如，“5至18个环原子”意味着杂芳基可以由5个环原子、6个环原子等等，直至并包括 18个环原子组成。含n的“杂芳香性”或“杂芳基”部分是指这样的芳香性基团：其中环的至少一个骨架原子是氮原子。多环杂芳基可以是稠合的或非稠合的。杂芳基基团中的杂原子可以任选地被氧化。一个或多个氮原子，若存在时，可以被任选地季铵化。杂芳基通过环的任意原子连接至分子的其余部分。亚杂芳基的实例包括但不限于亚苯并咪唑基、亚苯并吲哚基、亚异噁唑基、亚噻唑基、亚三唑基、亚四唑基和亚噻吩基(即亚噻吩基(thienylene))。亚杂芳基部分可以进一步被取代，或者可以除了与分子的其他部分连接的一个或两个点之外不具有其他取代基。
94.如本文所使用的，术语“杂环基”是指取代的或未取代的3-、4-、5-、6-或7-元饱和或部分饱和的环，其含有一、二或三个杂原子，优选一个或两个杂原子，所述杂原子独立地选自氧、氮和硫；或者是指二环环体系，其含有至多10个原子，包括至少一个独立地选自氧、氮和硫的杂原子，其中含有杂原子的环是饱和的。杂环基的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢糠基、吡咯烷基、哌啶基、4-吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、吗啉基、哌嗪基、二氧戊环基、二氧六环基、二氢吲哚基和5-甲基-6-苯并二氢吡喃基。杂环基团可以具有一个或两个与分子其余部分的连接点，并且可以被进一步取代或不被进一步取代。
95.系统。提供了一种用于在微流体装置中培养一个或多个生物细胞的系统，包括微流体装置，该微流体装置包括：液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一
个生长腔室，其中所述生长腔室具有被条件化为支持的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的至少一个表面。
96.用于操作和观察这种装置的微流体装置和系统。图1示出可以在本发明的实施中使用的微流体装置100和系统150的实例。示出了微流体装置100的透视图，其盖110 被部分切除以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括具有液流路径106的微流体管路120，流体培养基180(任选地携带一个或多个微物体(未示出)) 可以经过液流路径106流入和/或流过微流体管路120。虽然在图1中示出单个微流体管路120，但是合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3个)这种微流体管路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳流体装置。在图1所示的实施方案中，微流体管路120包括多个微流体生长腔室124、126、128和130，其每个均具有与液流路径106为流体性连通的一个或多个开口。如下文进一步讨论的，微流体生长腔室包括已被优化用于即使当培养基180流过液流路径106时，仍然将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特性和结构。然而，在描述上述之前，提供了对微流体装置100和系统150的简要说明。
97.如图1中大体所示，微流体管路120由外壳102来限定。尽管外壳102可以物理地构造成不同的配置，但是在图1所示的实例中，外壳102被描述为包括支撑结构104 (例如，基部)、微流体管路结构108和盖110。支撑结构104、微流体管路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体管路结构108可以被布置在支撑结构104的内表面109上，且盖110可以被布置在微流体管路结构108上方。微流体管路结构108与支撑结构104和盖110一起，可以限定微流体管路120的元件。
98.如图1所示，支撑结构104可以位于微流体管路120的底部，盖110可以位于微流体管路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其它取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体管路120的顶部，盖110可以位于微流体管路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，其每个均包括进入或流出外壳102的通路。通路的实例包括阀、门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体管路结构108中的间隙形成的通孔。然而，端口107可以位于外壳102的其它组件(诸如盖110)中。图1中仅示出一个端口107，但是微流体管路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体管路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体管路120的出口。端口107用作入口还是出口可以取决于流体流过液流路径106的方向。
99.支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和一个衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极 (例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104还可以包括印刷电路板组件(“pcba”)。例如，半导体衬底可以安装在pcba上。
100.微流体管路结构108可以限定微流体管路120的管路元件。此类管路元件可以包括当微流体管路120被流体充满时可以流体性互连的空间或区域，例如液流通道、腔室、坞、阱(trap)等。在图1所示的微流体管路120中，微流体管路结构108包括框架114和微流体管路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体管路材料116。例如，框架114可以是基本上包围微流体管路材料116的相对刚性结构。例如，框架 114可以包括金属材料。
101.可以用空腔等来图案化(patterned)微流体管路材料116，以限定微流体管路120 的管路元件和互连。微流体管路材料116可以包括柔性材料，诸如柔性聚合物(例如橡胶、塑
料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“pdms”)等)，其可以是透气性的。可以构成微流体管路材料116的材料的其它实例包括模制玻璃；可蚀刻材料，诸如硅氧烷(例如可光图案化的硅氧烷或“pps”)；光致抗蚀剂(例如su8)等。在一些实施方案中，此类材料(以及因此微流体管路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体管路材料116可以被布置在支撑结构104上和框架114内部。
102.盖110可以是框架114和/或微流体管路材料116的集成(integral)部件。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体管路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体管路材料116分开的结构，如图所示，或者可以是框架114或微流体管路材料116的集成部件。类似地，框架114和微流体管路材料116可以是如图1所示的分离结构或者是同一结构的集成部件。
103.在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似特性的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，诸如pdms。在一些实施方案中，盖110可以既包括刚性材料也包括可变形材料。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于生长腔室124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料相交界的可变形材料。在一些实施方案中，盖110还可以包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，诸如氧化铟锡(ito)，其可以被涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，该一个或多个电极可以是嵌入在可变形材料(例如聚合物(例如pdms))中的柔性电极，例如单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如us 2012/0325665 (chiou等人)中描述了可以用于微流体装置的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以修饰盖110(例如，通过条件化向内朝向微流体管路120的表面的全部或部分)来支持细胞贴附、活力和/或生长。这种修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可以包括至少一种透气性的材料(例如，pdms或pps)。
104.图1还示出用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。如图所示，系统150包括电源192、成像装置194和倾斜装置190。
105.电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。例如，电源192可以包括一个或多个交流(ac)和/或直流(dc)电压或电流源。成像装置194可以包括用于捕捉微流体管路120内的图像的装置(诸如数字照相机)。在一些情形下，成像装置194还包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如用于低光应用)的检测器。成像装置194还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体管路120中并收集从微流体管路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射的光束可以包括源自led或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的发射的反射。如关于图3所讨论的，成像装置194还可以包括显微镜(或光学系统)，其可以包括或可以不包括目镜。
106.系统150还可以包括倾斜装置190，其被配置为围绕一个或多个旋转轴旋转微流体装置100。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体管路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体管路120) 可以保持在水平取向(即相对于x轴和y轴为0
°
)、垂直取向(即相对于x轴和/或y轴为90
°
)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体管路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和
微流体管路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1
°
、0.2
°
、0.3
°
、0.4
°
、0.5
°
、0.6
°
、0.7
°
、0.8
°
、 0.9
°
、1
°
、2
°
、3
°
、4
°
、5
°
、10
°
、15
°
、20
°
、25
°
、30
°
、35
°
、40
°
、45
°
、50
°
、55
°
、60
°
、 65
°
、70
°
、75
°
、80
°
、90
°
或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以将微流体装置100(和微流体管路120) 相对于x轴和/或y轴倾斜大于90
°
的角度，或者使微流体装置100(和微流体管路120) 相对于x轴或y轴倾斜180
°
，以便完全反转微流体装置100(和微流体管路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190围绕由液流路径106或微流体管路120的某些其它部分限定的旋转轴来倾斜微流体装置100(和微流体管路120)。
107.在一些情形下，微流体装置100倾斜成垂直取向，使得液流路径106位于一个或多个生长腔室的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示在由重力限定的垂直轴上，液流路径106被定位为高于一个或多个生长腔室(即，在液流路径106上方的生长腔室中的物体会具有比液流路径中的物体高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示在由重力限定的垂直轴上，液流路径106被定位为低于一个或多个生长腔室(即，在液流路径106下方的生长腔室中的物体将具有比液流路径中的物体低的重力势能)。
108.在一些情形下，倾斜装置190围绕平行于液流路径106的轴来倾斜微流体装置100。此外，微流体装置100可以倾斜成小于90
°
的角度，使得液流路径106位于一个或多个生长腔室的上方或下方，而不是位于生长腔室的正上方或正下方。在其它情况下，倾斜装置190围绕垂直于液流路径106的轴来倾斜微流体装置100。在另外其它情况下，倾斜装置190围绕既不平行也不垂直于液流路径106的轴来倾斜微流体装置100。
109.系统150还可以包括培养基源178。培养基源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，其每个均用于保持不同的流体培养基180。因此，如图1所示，培养基源178可以是位于微流体装置100外部并与微流体装置100分离的装置。或者，培养基源178可以全部或部分位于微流体装置100的外壳102之内。例如，培养基源 178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。
110.图1还示出了描述构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的实例的简化框图。如图所示，这种控制和监测设备152的实例包括主控制器154，包括：培养基模块160，用于控制培养基源178；运动模块162，用于控制微流体管路120中微物体(未示出)和/或培养基(例如，培养基的液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制用来捕捉图像(例如，数字图像)的成像装置 194(例如照相机、显微镜、光源或其任何组合)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其它模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其它功能。如图所示，设备152还可以包括显示装置170和输入/输出装置 172。
111.主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据被存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源码等)操作。或者或此外，控制模块156 可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置培养基模块160、运动模块 162、成像模块164、倾斜模块166和/或其它模块168。因此，可以由如上所述配置的主控制器154、培养基模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其它模块168中的任意一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其它微流体设备所执行的功能、过程、动作、行动或
过程的步骤。类似地，主控制器154、培养基模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其它模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中所使用的数据。
112.培养基模块160控制培养基源178。例如，培养基模块160可以控制培养基源178，以将选择的流体培养基180输入到外壳102中(例如，通过入口端口107)。培养基模块160还可以控制从外壳102中移除培养基(例如，通过出口端口(未示出))。因此，可以将一种或多种培养基选择性地输入到微流体管路120中以及从其中移除。培养基模块160还可以控制流体培养基180在微流体管路120内部的液流路径106中的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，培养基模块160阻止培养基180在液流路径106中和通过外壳 102的流动。
113.运动模块162可以被配置为控制微流体管路120中微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文关于图2a和2b所讨论的，外壳102可以包括介电电泳(dep)、光电镊子(oet)和/或光电润湿(oew)配置(图1中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如光电晶体管)的激活，以选择和移动液流路径106和/或生长腔室124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或培养基液滴(未示出)。
114.成像模块164可以控制成像装置194。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置194的图像数据。来自成像装置194的图像数据可以包括由成像装置194捕捉的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、培养基液滴、标记(例如荧光标记等) 的积聚)。通过使用由成像装置194捕捉的信息，成像模块164还可以计算微流体装置 100内物体(例如，微物体、培养基液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。
115.倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。或者或此外，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时间，以优化微物体经由重力向一个或多个生长腔室的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体管路120中的微物体和/或培养基液滴的运动的数据。通过使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体管路120的倾斜，以便调节微物体和/或培养基液滴在微流体管路120中移动的速率。倾斜模块166 还可以使用该数据来迭代地调节微物体和/或培养基液滴在微流体管路120中的位置。
116.在图1所示的实例中，微流体管路120被示为包括微流体通道122和生长腔室124、 126、128、130。每个腔室均包括通向通道122的开口，但是其它部分被包围，使得腔室可以将腔室内的微物体与通道122的液流路径106或其它腔室中的流体培养基180 和/或微物体基本上分离。在一些情形下，腔室124、126、128、130被配置为物理地圈住微流体管路120内的一个或多个微物体。根据本发明的生长腔室可以包括各种形状、表面和特性，如下文将详细讨论和示出的，其被优化为与dep、oet、oew和/或重力一起使用。
117.微流体管路120可以包括任何数目的微流体生长腔室。尽管示出了五个生长腔室，但微流体管路120可以具有更少或更多的生长腔室。在一些实施方案中，微流体管路 120包括多个微流体生长腔室，其中两个或更多个生长腔室包括不同的结构和/或特征。
118.在图1所示的实施方案中，示出了单个通道122和液流路径106。然而，其它实施方案可以包含多个通道122，每个通道均被配置为包括液流路径106。微流体管路120 还包括与液流路径106和流体培养基180为流体连通的入口阀或端口107，由此流体培养基180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情形下，液流路径106包括单个路径。在一些情形下，
单个路径被布置为z字形图案，使得液流路径106以交替的方向穿过微流体装置100两次或更多次。
119.在一些情形下，微流体管路120包括多个平行的通道122和液流路径106，其中每个液流路径106内的流体培养基180沿相同的方向流动。在一些情形下，每个液流路径106内的流体培养基沿正向或反向中的至少一个方向流动。在一些情形下，多个生长腔室被配置(例如，相对于通道122)使得它们可以并行装载有目标微物体。
120.在一些实施方案中，微流体管路120还包括一个或多个微物体阱132。阱132通常形成在构成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体生长腔室124、126、128、130 的一个或多个的开口相对地设置。在一些实施方案中，阱132被配置为从液流路径106 接收或捕捉单个微物体。在一些实施方案中，阱132被配置为从液流路径106接收或捕捉多个微物体。在一些情形下，阱132包括基本上等于单个目标微物体的体积的体积。
121.阱132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入阱132。在一些情形下，阱132包括开口，开口的高度和宽度基本上等于单个目标微物体的尺寸，从而防止更大的微物体进入微物体阱。阱132还可以包括被配置为有助于将目标微物体保留在阱 132内的其它特征。在一些情形下，阱132相对于微流体生长腔室的开口对准并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入生长腔室的开口中的轨迹离开阱132。在一些情形下，阱132包括小于目标微物体的侧通路134，以便有助于穿过阱132的流，从而增大在阱 132中捕捉微物体的可能性。
122.在一些实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将介电电泳(dep)力施加在流体培养基180(例如，在液流路径中和/或在生长腔室中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将dep力施加到微流体管路120 的一个或多个部分，以便将单个微物体从液流路径106转移到期望的微流体生长腔室中。在一些实施方案中，使用dep力来防止生长腔室(例如，生长腔室124、126、128 或130)内的微物体从生长腔室移位。此外，在一些实施方案中，使用dep力，来从生长腔室中选择性地移除先前根据本发明的教导收集的微物体。在一些实施方案中， dep力包括光电镊子(oet)力。
123.在其他实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(oew)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定液流路径和/或生长腔室的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体管路120 中的液滴。例如，在一些实施方案中，将oew力施加到支撑结构104(和/或盖110) 中的一个或多个位置，以将单个液滴从液流路径106转移到期望的微流体生长腔室中。在一些实施方案中，使用oew力来防止生长腔室(例如，生长腔室124、126、128或 130)内的液滴从生长腔室移位。另外，在一些实施方案中，使用oew力来从生长腔室中选择性地移除先前根据本发明的教导收集的液滴。
124.在一些实施方案中，将dep和/或oew力与其它力(例如流动和/或重力)结合，以便操纵、运输、分离和分类微流体管路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将外壳102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将液流路径106和位于其中的微物体定位在微流体生长腔室的上方，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到腔室中。在一些实施方案中，可以在施加其它力之前施加dep和/或oew力。在其它实施方案中，可以在施加其它力之后施加dep和/或oew力。在其它情况下，可以在施加其它力的同时或者与其他力交替地施加dep和/或oew力。
125.图2a-2f示出可用于本发明的实施中的微流体装置的各种实施方案。图2a描述了其中微流体装置200被配置为光致动的电动力学装置的实施方案。本领域中已知多种光致动的电动力学装置，包括具有光电镊子(oet)配置的装置和具有光电润湿(oew) 配置的装置。在以下美国专利文献中示出了合适的oet配置的实例，其均通过引用整体并入本文：美国专利第re 44,711号(wu等人)(最初以美国专利号7,612,355发布)；和美国专利第7,956,339号(ohta等人)。美国专利第6,958,132号(chiou等人)和美国专利申请公布第2012/0024708号(chiou等人)中示出了oew配置的实例，上述两者都通过引用整体并入本文。光致动的电动力学装置的另一个实例包括组合的 oet/oew配置，在美国专利公布第20150306598号(khandros等人)和20150306599 (khandros等人)以及其对应的pct公布wo2015/164846和wo2015/164847中示出其实例，其通过引用整体并入本文。
126.运动微流体装置配置。如上所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体管路中诸如微物体或液滴的物体。微流体装置可以具有多种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其它考量。例如，可以利用介电电泳 (dep)配置来选择和移动微流体管路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构 104和/或盖110可以包括dep配置，用于选择性地在微流体管路120中的流体培养基 180中的微物体上诱导dep力，从而选择、捕捉和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(ew)配置，用于在微流体管路120中的流体培养基180中的液滴上选择性地诱导ew力，从而选择、捕捉和/或移动单个液滴或液滴组。
127.在图2a和图2b中示出包括dep配置的微流体装置200的一个实例。虽然为了简单起见，图2a和图2b分别示出具有开放区域/腔室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面图和顶截面图，但应当理解，区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体管路元件的一部分，诸如生长腔室、生长腔室、液流区域或液流通道。此外，微流体装置200可以包括其它流体管路元件。例如，微流体装置200可以包括多个生长腔室或生长腔室和/或一个或多个液流区域或液流通道，例如本文关于微流体装置 100所述的那些。dep配置可以被并入到微流体装置200的任何此类流体管路元件中，或选择其一部分。还应当理解，上述或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任何一个可以被并入到微流体装置200中和/或与微流体装置200结合使用。例如，上述包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，其包括培养基模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其它模块168中的一个或多个。
128.如图2a所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104、以及具有顶部电极210的盖110，其中顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/腔室202的相对表面。因此，包含在区域/腔室202中的培养基180在顶部电极210与电极活化衬底206 之间提供电阻连接。还示出了电源212，其被配置为被连接到底部电极204和顶部电极 210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室202中产生dep力所需要的。电源212可以是例如交流(ac)电源。
129.在某些实施方案中，图2a和图2b所示的微流体装置200可以具有光致动的dep 配置。因此，可以由运动模块162所控制的来自光源220的光222的变化图案可以选择性地激活和去激活电极活化衬底206的内表面208的区域214处的dep电极的变化图案。(下文中，具有dep配置的微流体装置的区域214被称为“dep电极区域”。) 如图2b所示，指向电极活化衬底
206的内表面208的光图案222可以以诸如正方形的图案照亮选择的dep电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未照射的dep电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”dep电极区域214。通过dep电极活化衬底206的相对电阻抗(即，从底部电极204直到与液流区域106中培养基180相交界的电极活化衬底206的内表面208)大于通过每个暗dep电极区域214处的区域/腔室202中的培养基180的相对电阻抗(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)。然而，照亮的dep电极区域214a表现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，其小于通过每个照亮的dep电极区域214a处的区域/腔室202中培养基180 的相对阻抗。
130.在电源212被激活的情况下，前述dep配置在照射的dep电极区域214a与相邻的暗dep电极区域214之间的流体培养基180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体培养基180中附近微物体(未示出)的局部dep力。因此，可以通过改变从光源220投射到微流体装置200中的光图案222，在区域/腔室202的内表面208处的许多不同的此类dep电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体培养基180 中微物体的dep电极。dep力吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和培养基180和/或微物体(未示出)的介电特性的参数。
131.图2b所示的照亮的dep电极区域214a的正方形图案224仅仅是一个实例。通过投射到装置200的光图案222可以照射(从而被激活)dep电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案222来重复地改变照亮的/激活的dep电极区域214的图案。
132.在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-si:h)层或由其构成。a-si:h可以包括例如约8％至40％的氢(以100
×
氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-si:h层可以具有约500nm至约2.0微米的厚度。在这样的实施方案中，根据光图案222，可以在电极活化衬底208 的内表面208上的任何地方以任何图案来形成dep电极区域214。因此，无需固定dep 电极区域214的数目和图案，而是可以将其对应于光图案222。已经在例如美国专利第 re 44,711号(wu等人)(最初发布为美国专利第7,612,355号)中描述了具有包括光电导层(例如上文所述的光电导层)的dep配置的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
133.在其他实施方案中，电极活化衬底206可以包括具有多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层的衬底，例如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管均对应于dep电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如导电金属电极)，其中每个这种电极均对应于dep电极区域214。电极活化衬底206可以包括这类光电晶体管或光电晶体管控制电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上正方形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列，如图2b所示。或者，图案可以是形成六方点格的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列。不管何种图案，电路元件可以在电极活化衬底206的内表面208 处的dep电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案222选择性地激活和去激活那些电连接(即光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接都可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206的相对阻抗(即，从底部电极204到与区域/腔室202中的培养基180相交界的电极活化衬底206的内表面208)大于在相应 dep电极区域214处通过培养基180的相对阻抗(即，从电极活化衬底206的
内表面 208到盖110的顶部电极210)。然而，当由光图案222中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个照亮的dep电极区域214处通过培养基180的相对阻抗，从而在相应dep电极区域214处激活dep电极，如上所述。因此，可以按照光图案222确定的方式，在区域/腔室202中电极活化衬底206的内表面208处的许多不同 dep电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥培养基180中的微物体(未示出)的dep电极。
134.在例如美国专利第7,956,339号(ohta等人)中已经描述了具有包括光电晶体管的电极活化衬底的微流体装置的实例(参见例如图21和图22所示的装置300以及其描述)，其全部内容通过引用并入本文。在例如美国专利公布第2014/0124370号(short 等)中已经描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的实例(参见例如各个附图所示的装置200、400、500、600和900以及其描述)，其全部内容通过引用并入本文。
135.在dep配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁 (或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁 (或支撑结构104)的一部分。区域/腔室202可以在第一壁与第二壁之间。在其它实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和 /或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源220可以替代地用于从下方照亮外壳102。
136.利用具有dep配置的图2a-图2b的微流体装置200，通过将光图案222投射到装置200中，以便以围绕并捕捉微物体的图案(例如，正方形图案224)来激活电极活化衬底206的内表面208的dep电极区域214a处的第一组一个或多个dep电极，运动模块162可以选择区域/腔室202中的培养基180中的微物体(未示出)。然后运动模块 162可以通过相对于装置200移动光图案222以激活在dep电极区域214处的第二组一个或多个dep电极，来移动捕捉到的微物体。或者，可以相对于光图案222来移动装置200。
137.在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化衬底206的内表面208处的dep电极的光激活的dep配置。例如，电极活化衬底206可以包括与包含至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的选择性可寻址和可激励电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)，以激活或去激活dep电极区域214处的dep电极，从而在激活的dep电极附近的区域/腔室202中的微物体(未示出)上产生净dep力。取决于诸如电源212的频率和区域/腔室202中培养基(未示出)和/或微物体的介电性质的特征，dep力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组dep电极(例如，在形成正方形图案224的一组dep电极区域 214处)，可以在区域/腔室202内捕集和移动区域/腔室202中的一个或多个微物体。图 1中的运动模块162可以控制这类开关，从而激活和去激活各个dep电极，以选择、捕集和移动区域/腔室202周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址和可激励电极的dep配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经在例如美国专利第 6,294,063号(becker等人)和第6,942,776号(medoro))中描述，其全部内容通过引用并入本文。
138.作为又一实例，微流体装置200可以具有电润湿(ew)配置，其可以代替dep配置，或者可以位于微流体装置200中与具有dep配置的部分分离的部分中。ew配置可以是光电润湿配置或介电质上电润湿(ewod)配置，这两者都是本领域已知的。在一些ew配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)与底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可以包括疏
水材料和/或可以涂覆有疏水材料。对于具有ew 配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。
139.介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化物层，并且可以具有约50nm至约250 nm(例如约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物(诸如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪))的层。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组分和厚度如何，介电层可以具有约10kω至约50kω的阻抗。
140.在一些实施方案中，介电层的向内朝向区域/腔室202的内表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的实例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如，)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如cytop
tm
)。构成疏水材料的分子可以共价连接到介电层的表面。例如，可以通过连接部分(例如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团)将疏水材料的分子共价连接到介电层的表面。因此，在一些实施方案中，疏水材料可以包括烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳的链，或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可以包含氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施方案中，疏水涂层具有约10nm至约50nm的厚度。在其它实施方案中，疏水涂层具有小于10nm(例如，小于5nm、或约1.5nm至3.0nm)的厚度。
141.在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是与用于涂覆支撑结构104的介电层相同的疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层与顶部电极210之间的电极活化衬底206。电极活化衬底206和盖110的介电层可以具有与电极活化衬底206和支撑结构104的介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。
142.在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料，例如如上所述的光电导材料。因此，在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅层(a
‑ꢀ
si:h)或由其构成。a-si:h可以包括例如约8％至40％的氢(以100
×
氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-si:h层可以具有约500nm至约2.0微米的厚度。或者，如上所述，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置是本领域已知的和/或可以用本领域已知的电极活化衬底来构建。例如，美国专利第6,958,132号(chiou等人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-si:h的光电导材料的光电润湿配置，而上述参引的美国专利公布第2014/0124370号(short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底。
143.因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案222可以用于激活电极活化衬底206中的光电导ew区域或光响应ew电极。电极活化衬底206的这类激活的ew区域或ew电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射到电极活化衬底206上的光图案222 (或相对于光源220移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，含有水性介质、溶液或溶剂)穿过存在于区域/腔室202中的不混溶流体(例如，油介质)。
144.在其他实施方案中，微流体装置200可以具有ewod配置，并且电极活化衬底206 可以包括不依赖于光进行激活的选择性可寻址和可激励的电极。因此，电极活化衬底 206可以包括这类电润湿(ew)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形ew电极的阵列，如图2b所示。或者，图案可以是形成六边点格的基本上六边形ew电极的阵列。不管何种图案，可以通过电开关(例如半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)ew电极。通过选择性地激活和去激活电极活化衬底 206中的ew电极，可以在区域/腔室202内移动与覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208相接触的液滴(未示出)。图1中的运动模块162可以控制这样的开关，从而激活和去激活各个ew电极，以选择并移动区域/腔室202周围的特定液滴。具有包括选择性寻址和可激励电极的ewod配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经在例如美国专利第8,685,344号(sundarsan等人)中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。
145.不管微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，ac电压电势)。电源212可以与图1参引的电源192相同或是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供ac电压和/或电流。对于ac电压，电源212可以提供这样的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围：其如上所述，足以产生足够强以捕集和移动区域/腔室202中各个微物体(未示出)的净dep力(或电润湿力)，和/或还如上所述，足以改变区域/腔室202 中支撑结构104的内表面208(即介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿特性。这种频率范围和平均或峰值功率范围是本领域已知的。例如，参见美国专利第6,958,132 号(chiou等人)、美国专利第re44,711号(wu等人)(最初发布为美国专利第7,612,355 号)和美国专利申请公布第us2014/0124370号(short等人)、us2015/0306598(khandros 等人)和us2015/0306599(khandros等人)。
146.生长腔室。在图2c和图2d所示的微流体装置240内示出一般生长腔室244、246 和248的非限制性实例。每个生长腔室244、246和248均可以包括分离结构250，其限定分离区域258和将分离区域258流体性连接到通道122的连接区域254。连接区域254可以包括到通道122的近端开口252以及到分离区域258的远端开口256。连接区域254可以被配置为使得从通道122流入生长腔室244、246、248的流体培养基 (未示出)流的最大穿透深度不延伸到分离区域258中。因此，由于连接区域254，布置在生长腔室244、246、248的分离区域258中的微物体(未示出)或其它材料(未示出)可以与通道122中的培养基180的流分离并且基本上不受其影响。
147.因此，通道122可以是扫过区域的实例，并且生长腔室244、246、248的分离区域258可以是未扫过区域的实例。应当注意，通道122和生长腔室244、246、248可以被配置为包含一种或多种流体培养基180。在图2c-图2d所示的实例中，端口242 被连接到通道122并且允许将流体培养基180引入到微流体装置240中或从其中移除。在引入流体培养基180之前，微流体装置可以装填有诸如二氧化碳气体的气体。一旦微流体装置240包含流体培养基180，则可以选择性地产生和停止通道122中的流体培养基180的流260。例如，如图所示，端口242可以布置在通道122的不同位置处 (例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个端口242到用作出口的另一端口242形成培养基的流260。
148.图2e示出根据本发明的生长腔室244的实例的详细视图。还示出微物体270的实例。
149.已知的是，微流体通道122中流体培养基180的流260经过生长腔室244的近端开口252可以使得培养基180的二次流262进入和/或离开生长腔室244。为了将生长腔室244的分离区域258中的微物体270与二次流262分离，生长腔室244的连接区域254的长度l
con
(即，从近端开口252到远端开口256)应该大于二次流262进入连接区域254的穿透深度d
p
。二次流262的穿透深度d
p
取决于在通道122中流动的流体培养基180的速度以及与通道122的配置相关的各种参数以及到通道122的连接区域254的近端开口252。对于给定的微流体装置，通道122和开口252的配置将是固定的，而通道122中流体培养基180的流260速率将是可变的。因此，对于每个生长腔室244，可以识别通道122中流体培养基180的流260的最大速度v
max
，确保二次流 262的穿透深度d
p
不超过连接区域254的长度l
con
。只要通道122中流体培养基180 的流260速率不超过最大速度v
max
，所得到的二次流262就可以被限制到通道122和连接区域254并保持在分离区域258之外。因此，通道122中的培养基180的流260 将不会把微物体270拖拽出分离区域258。相反，位于分离区域258中的微物体270将停留在分离区域258中，而不管通道122中流体培养基180的流260。
150.此外，只要通道122中培养基180的流260速率不超过v
max
，通道122中流体培养基180的流260就不会把各种各样的颗粒(例如微粒和/或纳米颗粒)从通道122移动至生长腔室244的分离区域258。因此，使得连接区域254的长度l
con
大于二次流 262的最大穿透深度d
p
，可以防止一个生长腔室244被来自通道122或另一个生长腔室(例如，图2d中的生长腔室246、248)的各种各样的颗粒污染。
151.由于通道122和生长腔室244、246、248的连接区域254可能受通道122中培养基180的流260的影响，所以通道122和连接区域254可以被认为是微流体装置240 的扫过(或液流)区域。另一方面，生长腔室244、246、248的分离区域258可以被认为是未扫过(或非液流)区域。例如，通道122中第一流体培养基180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一培养基180的组分扩散(从通道122经过连接区域254并进入到分离区域258中的第二流体培养基280中)与分离区域258中的第二流体培养基280混合。类似地，分离区域258中第二培养基280的组分(未示出)可以基本上仅通过第二培养基280的组分扩散(从分离区域258经过连接区域254并进入到通道 122中的第一培养基180中)与通道122中的第一培养基180混合。第一培养基180可以是与第二培养基280相同或不同的培养基。此外，第一培养基180和第二培养基280 可以在开始时相同，然后变得不同(例如通过由分离区域258中的一个或多个细胞来条件化第二培养基280，或者通过改变流过通道122的培养基180)。
152.由通道122中流体培养基180的流260引起的二次流262的最大穿透深度d
p
可以取决于如上所述的多个参数。这类参数的实例包括：通道122的形状(例如，通道可以将培养基引导到连接区域254中，将培养基从连接区域254转移，或者沿着基本上垂直于连接区域254的近端开口252的方向将培养基引导到通道122中)；通道122在近端开口252处的宽度w
ch
(或横截面积)；和连接区域254在近端开口252处的宽度 w
con
(或横截面积)；通道122中流体培养基180的流260的速度v；第一培养基180 和/或第二培养基280的粘度，等等。
153.在一些实施方案中，通道122和生长腔室244、246、248的尺寸可以相对于通道 122中的流体培养基180的流260的向量被定向如下：通道宽度w
ch
(或通道122的横截面积)可以基本上垂直于培养基180的流260；连接区域254在开口252处的宽度 w
con
(或横截面积)可以基本上平行于通道122中培养基180的流260；和/或连接区域的长度l
con
可以基本上垂直于
通道122中培养基180的流260。前述仅仅是实例，并且通道122和生长腔室244、246、248的相对位置可以是相对于彼此的其它取向。
154.如图2e所示，连接区域254的宽度w
con
可以从近端开口252到远端开口256是均匀的。因此，连接区域254在远端开口256处的宽度w
con
可以是本文为连接区域254 在近端开口252处的宽度w
con
所标识的任何范围。或者，连接区域254在远端开口256 处的宽度w
con
可以大于连接区域254在近端开口252处的宽度w
con
。
155.如图2e所示，分离区域258在远端开口256处的宽度可以与连接区域254在近端开口252处的宽度w
con
基本相同。因此，分离区域258在远端开口256处的宽度可以是本文为连接区域254在近端开口252处的宽度w
con
所标识的任何范围。或者，分离区域258在远端开口256处的宽度可以大于或小于连接区域254在近端开口252处的宽度w
con
。此外，远端开口256可以小于近端开口252，并且连接区域254的宽度w
con
可以在近端开口252与远端开口256之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域254可以在近端开口与远端开口之间变窄。此外，连接区域254的任何部分或子部分(例如，连接区域与近端开口252相邻的一部分)可以变窄。
156.图4a-c描绘了包含微流体管路432和液流通道434的微流体装置400的另一个示例性实施方案，其是图1的各微流体装置100、管路132和通道134的变体。微流体装置400也具有多个生长腔室436，其是上文所述的生长腔室124、126、128、130、 244、246或248的另外的变体。特别地，应当理解，图4a-c所示的装置400的生长腔室436可以代替所述的装置100、200、240和290中的生长腔室124、126、128、 130、244、246或248的任一个。类似地，微流体装置400是微流体装置100的另一个变体，且其也可以具有与上文所述的微流体装置100、200、240、290相同或不同的dep 配置，以及本文所述的其他微流体系统组件中的任一个。
157.图4a-c的微流体装置400包括支撑结构(在图4a-c中不可见，但可以与图1中所描绘的装置100的支撑结构104相同或基本类似)、微流体管路结构412和盖(在图 4a-c中不可见，但可以与图1中所描绘的装置100的盖122相同或基本类似)。微流体管路结构412包括框架414和微流体管路材料416，其可以与图1中所描绘的装置 100的框架114和微流体管路材料116相同或基本类似。如图4a所示，由微流体管路材料416所定义的微流体管路432可以包括多个通道434(示出了两个，但可以有更多个)，多个生长腔室436与其为流体性连接。
158.每个生长腔室436可以包括分离结构446、分离结构446内的分离区域444以及连接区域442。从通道434处的近端开口472到分离结构436处的远端开口474，连接区域442将通道434流体性连接至分离区域444。通常，根据对上文对图2d和2e的讨论，通道434中的第一流体培养基402的流482能够产生第一培养基402从通道434 进入和/或离开生长腔室436的各自连接区域442的二次流484。
159.如图4b所示，每个生长腔室436的连接区域442通常包括在到通道434的近端开口472和到分离结构446的远端开口474之间延伸的区域。连接区域442的长度l
con
可以大于二次流484的最大穿透深度d
p
，在这种情况下，二次流484会延伸进入连接区域442，而不被再引导向分离区域444(如图4a所示)。或者，如图4c所示，连接区域442的长度l
con
可以小于最大穿透深度d
p
，在这种情况下二次流484会延伸通过连接区域442并被再引导向分离区域444。在后一种情况下，连接区域442的长度l
c1
与l
c2
的和大于最大穿透深度d
p
，使得二次流484不延伸进入分离区域444。无论连接区域442的长度l
con
是否大于穿透深度d
p
，或者连接
区域442的长度l
c1
与l
c2
的和是否大于穿透深度d
p
，通道434中的第一培养基402的不超过最大速度v
max
的流482会产生具有穿透深度d
p
的二次流，且生长腔室436的分离区域444中的微物体(未示出，但可以与图2e中所示的微物体270相同或基本类似)不会被通道434中的第一培养基 402的流482带离分离区域444。通道434中的流482也不会将各种各样的物质(未示出)从通道434带到生长腔室436的分离区域444中。这样，扩散是通道434中的第一培养基402中的组分可以从通道434移动进入生长腔室436的分离区域444中的第二培养基404的唯一机制。类似地，扩散是生长腔室436的分离区域444中的第二培养基404中的组分可以从分离区域444移动进入通道434中的第一培养基402的唯一机制。第一培养基402可以是与第二培养基404相同的培养基，或者第一培养基402 可以是与第二培养基404不同的培养基。或者，第一培养基402和第二培养基404可以在开始时相同，然后变得不同，例如通过分离区域444中的一个或多个细胞来条件化第二培养基，或者通过改变流过通道434的培养基。
160.如图4b所示，通道434中通道434的宽度w
ch
(即，横切流体培养基流过通道的方向，如图4a中的箭头482所示)可以基本上垂直于近端开口472的宽度w
con1
，并且因此基本上平行于远端开口474的宽度w
con2
。然而，近端开口472的宽度w
con1
和远端开口474的宽度w
con2
不需要基本上彼此垂直。例如，近端开口472的宽度w
con1
定向于其上的轴(未示出)和远端开口474的宽度w
con2
定向于其上的另一个轴之间的角度可以不同于垂直，并因此不同于90
°
。可选择的定向角度的实例包括以下任意范围内的角度：约30
°
至约90
°
、约45
°
至约90
°
、约60
°
至约90
°
，等等。
161.在生长腔室(例如124、126、128、130、244、246、248或436)的各种实施方案中，分离区域(例如258或444)被配置为包含多个微物体。在其它实施方案中，分离区域可以被配置为仅仅包含一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数目的微物体。因此，例如，分离区域的体积可以是至少3
×
103、6
×
103、9
×
103、1
×
104、2
×
104、4
×
104、8
×
104、1
×
105、2
×
105、4
×
105、8
×
105、1
×
106、2
×
106、4
×
106、6
×ꢀ
106、1
×
107、2
×
107、4
×
107、6
×
107、1
×
108立方微米或更大。
162.在生长腔室的各种实施方案中，通道122、434在近端开口(例如252、472)处的宽度w
ch
可以在以下任一范围内：50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、 70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90
‑ꢀ
250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100
‑ꢀ
150微米和100-120微米。上述仅仅是实例，并且通道122、434的宽度w
ch
可以在其它范围内(例如，由上面列出的任何端点所限定的范围)。此外，通道122、434的w
ch
可以被选择为通道在除了生长腔室的近端开口之外的区域中的任何一个范围。
163.在一些实施方案中，生长腔室的横截面的高度为约30至约200微米、或约50至约150微米。在一些实施方案中，生长腔室的横截面积为约100,000至约2,500,000平方微米、或约200,000至约2,000,000平方微米。在一些实施方案中，连接区域具有与对应的生长腔室的横截面高度相匹配的横截面高度。在一些实施方案中，连接区域具有约50至约500微米、或约100至约300微米的横截面宽度。
164.在生长腔室的各种实施方案中，通道122、434在近端开口252、472处的高度h
ch
可以在以下任何范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微
0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5微升/秒。或者，在一些其他实施方案中，v
max
可以被设置为约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5微升 /秒。在其他实施方案中，v
max
可以被设置为约2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、 3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、6.0、7.0、8.0或约9.0微升/秒。
171.在具有生长腔室的微流体装置的各种实施方案中，生长腔室的分离区域258、444 的体积可以是例如至少3
×
103、6
×
103、9
×
103、1
×
104、2
×
104、4
×
104、8
×
104、1
ꢀ×
105、2
×
105、4
×
105、8
×
105、1
×
106、2
×
106、4
×
106、6
×
106立方微米或或更大。在具有生长腔室的微流体装置的各种实施方案中，生长腔室的体积可以是约5
×
103、7
ꢀ×
103、1
×
104、3
×
104、5
×
104、8
×
104、1
×
105、2
×
105、4
×
105、6
×
105、8
×
105、 1
×
106、2
×
106、4
×
106、8
×
106、1
×
107、3
×
107、5
×
107或约8
×
107立方微米或更大。在一些实施方案中，微流体装置具有其中可以维持不超过1
×
102个生物细胞的生长腔室，并且生长腔室的体积可以不超过2
×
106立方微米。在一些实施方案中，微流体装置具有其中可以维持不超过1
×
102个生物细胞的生长腔室，并且生长腔室可以不超过4
×
105立方微米。在其它实施方案中，微流体装置具有其中可以维持不超过50个生物细胞的生长腔室，生长腔室可以不超过4
×
105立方微米。
172.在各种实施方案中，微流体装置具有如本文所述的任何实施方案中所配置的生长腔室，其中微流体装置具有约100至约500个生长腔室、约200至约1000个生长腔室、约500至约1500个生长腔室、约1000至约2000个生长腔室或约1000至约3500 个生长腔室。
173.在一些其它实施方案中，微流体装置具有如本文所述的任何实施方案中所配置的生长腔室，其中微流体装置具有约1500至约3000个生长腔室、约2000至约3500个生长腔室、约2500至约4000个生长腔室、约3000至约4500个生长腔室、约3500至约5000个生长腔室、约4000至约5500个生长腔室、约4500至约6000个生长腔室、约5000至约6500个生长腔室、约5500至约7000个生长腔室、约6000至约7500个生长腔室、约6500至约8000个生长腔室、约7000至约8500个生长腔室、约7500至约9000个生长腔室、约8000至约9500个生长腔室、约8500至约10,000个生长腔室、约9000至约10,500个生长腔室、约9500至约11,000个生长腔室、约10,000至约11,500 个生长腔室、约10,500至约12,000个生长腔室、约11,000至约12,500个生长腔室、约11,500至约13,000个生长腔室、约12,000至约13,500个生长腔室、约12,500至约 14,000个生长腔室、约13,000至约14,500个生长腔室、约13,500至约15,000个生长腔室、约14,000至约15,500个生长腔室、约14,500至约16,000个生长腔室、约15,000 至约16,500个生长腔室、约15,500至约17,000个生长腔室、约16,000至约17,500个生长腔室、约16,500至约18,000个生长腔室、约17,000至约18,500个生长腔室、约 17,500至约19,000个生长腔室、约18,000至约19,500个生长腔室、约18,500至约 20,000个生长腔室、约19,000至约20,500个生长腔室、约19,500至约21,000个生长腔室或约20,000至约21,500个生长腔室。
174.图2f示出根据一个实施方案的微流体装置290。图2f中示出的微流体装置290是微流体装置100的程式化示意图。在实施中，微流体装置290及其组成管路元件(例如，通道122和生长腔室128)会具有本文所讨论的尺寸。图2f中示出的微流体管路 120具有两个端口107、四个不同的通道122和四个不同的液流路径106。微流体装置 290还包括向每个通道122开口的多个生长腔室。在图2f所示的微流体装置中，生长腔室具有类似于图2e所示坞的
几何形状，并因此具有连接区域和分离区域这两者。因此，微流体管路120既包括扫过区域(例如，通道122和在二次流262的最大穿透深度d
p
内的连接区域254的部分)也包括非扫过区域(例如，分离区域258和不在二次流262的最大穿透深度d
p
内的连接区域254的部分)。
175.图3a和3b示出可用于操作和观察根据本发明的微流体装置(例如，100、200、 440、290)的系统150的各种实施方案。如图3a所示，系统150可以包括被配置为保持微流体装置100(未示出)或本文所述的任何其它微流体装置的结构(“巢(nest)”) 300。巢300可以包括能够与微流体装置360(例如，光致动的电动力学装置100)交界并且提供从电源192到微流体装置360的电连接的插座(socket)302。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统304可以被配置为向插座302 提供偏置电压，使得当插座302保持微流体装置360时，在微流体装置360中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。将偏置电压施加到微流体装置360的能力并不意味着当插座302保持微流体装置360时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏置电压，例如，仅在需要在微流体装置360中便于生成电动力(例如介电电泳或电润湿)时，才施加偏置电压。
176.如图3a所示，巢300可以包括印刷电路板组件(pcba)320。电信号生成子系统 304可以安装在pcba 320上并被电集成到其中。示例性巢300也包括安装在pcba320上的插座302。
177.通常，电信号生成子系统304会包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304 还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量供给至由插座302保持的微流体装置360的波形。在某些实施方案中，示波器测量在接近微流体装置360(和远离波形发生器)位置处的波形，从而确保更准确地测量实际施加到装置的波形。从示波器测量所获得的数据可以被例如提供为对波形发生器的反馈，并且波形发生器可以被配置为基于这种反馈来调节其输出。red pitaya
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是合适的组合式波形发生器和示波器的一个实例。
178.在某些实施方案中，巢300还包括控制器308，例如用于检测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的实例包括arduino
tm
微处理器，例如 arduino nano
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。控制器308可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154 (图1所示)进行通信以执行功能和分析。在图3a所示的实施方案中，控制器308通过界面310(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。
179.在一些实施方案中，巢300可以包括电信号生成子系统304，其包括red pitaya
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波形发生器/示波器单元(“red pitaya单元”)和波形放大电路，其中波形放大电路将 red pitaya单元产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置100。在一些实施方案中，red pitaya单元被配置为测量微流体装置360处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得在微流体装置360处测量到的电压是期望值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在pcba 320上的一对dc-dc转换器产生的 +6.5v至-6.5v的电源，从而在微流体装置100处产生高达13vpp的信号。
180.如图3a所示，巢300还可以包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调整由巢300保持的微流体装置360的温度。例如，热控制子系统306可以包括 peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置360
的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，诸如液体冷却铝块。peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径330，流体路径330被配置为使冷却的流体循环通过冷却块。在图3a所示的实施方案中，巢300 包括入口332和出口334，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入流体路径330中并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施方案中，peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径330可以安装在巢300的壳体340 上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置为调整peltier热电装置的温度，以便实现微流体装置360的目标温度。例如，可以通过诸如pololu
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热电电源(pololurobotics and electronics corp.)的热电电源来实现peltier热电装置的温度调整。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，可以由数字电路提供反馈电路。
181.在一些实施方案中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，其中反馈电路是包括电阻器(例如，电阻为1kω+/-0.1％，温度系数+/-0.02ppm/c0)和ntc热敏电阻(例如，标称电阻为1kω+/-0.01％)的模拟分压器电路(未示出)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载 pid控制环路算法的输入。来自pid控制环路算法的输出可以驱动例如pololu
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马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制 peltier热电装置。
182.巢300可以包括串行端口350，其允许控制器308的微处理器经由界面310与外部主控制器154进行通信。另外，控制器308的微处理器可以与电信号生成子系统304 和热控制子系统306进行通信(例如，经由plink工具(未示出))。因此，经由控制器 308、界面310和串行端口350的组合，电信号生成子系统308和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其他方面之外，主控制器154还可以通过执行用于输出电压调节的换算(scaling)计算来辅助电信号生成子系统308。通过耦接到外部主控制器154的显示装置170所提供的图形用户界面(gui)(未示出) 可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统308获得的温度和波形数据。或者或此外，gui可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。
183.如上所述，系统150可以包括成像装置194。在一些实施方案中，成像装置194包括光调制子系统422。光调制子系统422可以包括数字镜像装置(dmd)或微快门阵列系统(msa)，其中任一个可以被配置为接收来自光源420的光并将接收到的光的一部分发送到显微镜450的光具组中。或者，光调制子系统422可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源420)，例如有机发光二极管显示器(oled)、硅基液晶(lcos) 器件、铁电硅基液晶(flcos)或透射液晶显示器(lcd)。光调制子系统422可以是例如投影仪。因此，光调制子系统422能够发射结构光和非结构光。合适的光调制子系统422的一个实例是来自andor technologies
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的mosaic
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系统。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统422。
184.在某些实施方案中，成像装置194还包括显微镜450。在这类实施方案中，巢300 和光调制子系统422可以被单独地配置为安装在显微镜450上。显微镜450可以是例如标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置为安装在显微镜450的载物台426上和/或光调制子系统422可以被配置成安装在显微镜450的端口上。在其它实施方案
中，本文所述的巢300和光调制子系统422可以是显微镜450的集成组件。
185.在某些实施方案中，显微镜450还可以包括一个或多个检测器440。在一些实施方案中，由成像模块164控制检测器440。检测器440可以包括目镜、电荷耦合器件(ccd)、照相机(例如，数字照相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器440，则一个检测器可以是例如快速帧率照相机，而另一个检测器可以是高灵敏度照相机。此外，显微镜450可以包括光具组，其被配置为接收从微流体装置360反射和/或发射的光并且将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦在一个或多个检测器440上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以不同。
186.在某些实施方案中，成像装置194被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源420来产生结构光(例如，经由光调制子系统422)，并且可以使用第二光源 430来提供非结构光。第一光源420可以产生用于光致动的电运动和/或荧光激发的结构光，并且第二光源430可以用于提供亮视场照明。在这些实施方案中，运动模块164 可以用于控制第一光源420，并且成像模块164可以用于控制第二光源430。显微镜450 的光具组可以被配置为(1)从光调制子系统422接收结构光，并且当该装置被巢300 保持时，将结构光聚焦在微流体装置(诸如光致动的电动力学装置)中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器440上。光具组还可以被配置为从第二光源接收非结构光，并且当该装置被巢300保持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的一部分。
187.在图3b中，第一光源420被示为将光提供给光调制子系统422，其将结构光提供给系统450的显微镜450的光具组。第二光源430被示为经由分束器424将非结构光提供给光具组。来自光调制子系统422的结构光和来自第二光源430的非结构光一起从分束器424通过光具组行进到达第二分束器424(或二向色滤光器448，取决于光调制子系统422提供的光)，在此光通过物镜454向下反射到样本平面428。然后来自样本平面428的被反射和/或发射的光通过物镜454、通过分束器和/或二向色滤光器448 返回至二向色滤光器452。到达二向色滤光器452的仅仅一部分光穿过并到达检测器 440。
188.在一些实施方案中，第二光源430发射蓝光。利用适当的二向色滤光器452，从样本平面428反射的蓝光能够穿过二向色滤光器452并到达检测器440。与之相反，来自光调制子系统422的结构光从样本平面428反射，但不穿过二向色滤光器452。在该实例中，二向色滤光器452滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，对来自光调制子系统422的光的这种滤除才算完成(如图所示)。在实施中，如果来自光调制子系统422的光包括短于495nm的波长 (例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光会穿过滤光器452到达检测器440。在这种实施方案中，滤光器452作用为改变从第一光源420和第二光源430到达检测器440的光量之间的平衡。如果第一光源420显著强于第二光源430，则这是有益的。在其它实施方案中，第二光源430可以发射红光，并且二向色滤光器452可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。
189.用于在微流体装置的生长腔室内保持细胞活力的另外的系统组件。为了促进细胞群落的生长和/或扩增，可以通过系统的另外的组件来提供有助于保持功能性细胞的环境条件。例如，这种另外的组件可以提供营养物、细胞生长信号传导物质、ph调节、气体交换、
温度控制和从细胞去除废产物。
190.微流体装置的经条件化的表面。在一些实施方案中，条件化微流体装置的至少一个表面，以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。在一些实施方案中，基本上所有的内表面都被条件化。经条件化的表面可以是有助于微流体装置内成功的细胞孵育的元件之一。适当的经条件化的表面的识别可能需要平衡多种操作要求。首先，经条件化的表面可以提供接触表面，其用于保护细胞不接触可以用于制造这类微流体装置的材料。不希望受理论束缚，经条件化的表面可以被水合水包围，其提供与细胞的水性的而非金属性的接触层。第二，经条件化的表面可以提供接触表面，通过该接触表面，至少一种生物细胞在孵育期间可以被充分地支持，而基本上不抑制细胞在孵育完成后从生长腔室被移除的能力。例如，许多细胞要求接触表面具有某种程度的亲水性，以便充分地贴附以有活力和/或生长。或者，一些细胞可能要求接触表面具有一定程度的疏水性，以便生长并表现出期望的活力水平。此外，一些细胞可能要求在接触表面内存在所选的蛋白质或肽基序，以便引发活力/生长响应。第三，至少一个表面的条件化可以允许微流体装置中所用的动力基本上在正常工作功率范围内起作用。例如，如果采用光致动的动力，则经条件化的表面可以基本上允许光通过经条件化的表面，使得光致动的动力基本上不被抑制。
191.至少一个经条件化的表面可以包括生长腔室的表面或液流区域的表面，或其组合。在一些实施方案中，多个生长腔室中的每一个均具有至少一个经条件化的表面。在其他实施方案中，多个液流区域中的每一个均具有至少一个经条件化的表面。在一些实施方案中，多个生长腔室中的每一个和多个液流区域中的每一个的至少一个表面是经条件化的表面。
192.包括聚合物的经条件化的表面。至少一个经条件化的表面可以包括聚合物。聚合物可以共价或非共价地连接到至少一个表面。聚合物可以具有多种结构基序，包括嵌段聚合物(和共聚物)；星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)，所有这些均适于用于本文。
193.聚合物可以包括含亚烷基醚部分的聚合物。大量的含亚烷基醚的聚合物可以适于用在本文所述的微流体装置中。含亚烷基醚的聚合物的一个非限制性示例性类型是两性非离子嵌段共聚物，其包括不同比例的和在聚合物链中不同位置的聚氧乙烯(peo) 和聚氧丙烯(ppo)子单元的嵌段。聚合物(basf)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量mw的范围为约 2000da至约20kda。在一些实施方案中，peo-ppo嵌段共聚物可以具有大于约10 (例如12-18)的亲水-亲油平衡(hlb)。具体的可用于产生经条件化的表面的聚合物包括l44、l64、p85和f127(包括f127nf)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(peg mw《100,000da)或者聚氧乙烯(peo，mw》100,000)。在一些实施方案中，peg的mw可以为约1000da、5000da、10,000da或20,000da。
194.在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括含羧酸部分的聚合物。羧酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚乳酸 (pla)。
195.在一些其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括含氨基甲酸酯部分的聚合物，例如但不限于聚氨酯。
196.在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括含磺酸部分的聚合物。磺酸
子单元可以是含烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚苯乙烯磺酸(pssa)或聚茴香脑磺酸。这些后面的示例性聚合物是聚电解质，并且可以改变表面的特性以辅助/阻止贴附。
197.在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括含磷酸酯部分的聚合物，该磷酸酯部分或者在聚合物骨架的末端或者从聚合物骨架悬垂。
198.在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括含糖部分的聚合物。在一个非限制性实例中，多糖(例如衍生自海藻或真菌多糖的那些，例如黄原胶或葡聚糖)可以适于形成经聚合物条件化的表面，其可以辅助或防止细胞贴附。例如，大小为约3 kda的葡聚糖聚合物可以用于在微流体装置内提供经条件化的表面。
199.在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括含核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可以具有核糖核酸部分或脱氧核糖核酸部分。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或者可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸酯部分类似物，例如但不限于7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分。含核酸的聚合物可以包括聚电解质，其可以辅助或防止贴附。
200.在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括含氨基酸部分的聚合物。含氨基酸部分的聚合物可以包括含天然氨基酸的聚合物或含非天然氨基酸的聚合物，其均可以包括肽、多肽或蛋白质。在一个非限制性实例中，蛋白质可以是牛血清白蛋白 (bsa)。在一些实施方案中，可以在经条件化的表面提供细胞外基质(ecm)蛋白质，用于获得优化的细胞贴附以促进细胞生长。可以被包括在经条件化的表面中的细胞基质蛋白质可以包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含rgd的肽(如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的至少一个经条件化的表面内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物质。
201.在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括含胺部分的聚合物。多氨基聚合物可以包括天然的多氨基聚合物或合成的多氨基聚合物。天然聚胺的实例包括精胺、亚精胺和腐胺。
202.在一些实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中超过一种的聚合物。在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括超过一种聚合物的混合物，其中每一种均具有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到经条件化的表面中。
203.共价连接的经条件化的表面。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面包括共价连接的被配置为支持微流体装置内的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。共价连接的部分可以包括连接基团，其中连接基团共价连接至微流体装置的表面。连接基团还连接至被配置为支持微流体装置内的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接基团所连接的表面可以包括微流体装置的衬底的表面，在微流体装置包括dep配置的实施方案中，其可以包括硅和/或二氧化硅。在一些实施方案中，共价连接的经条件化的表面包括微流体装置的所有内表面。
204.对于具有经条件化的表面的微流体装置，图9中示出示意性表现形式。在图9中可以看到，微流体装置900具有朝向微流体装置的封闭区域902的第一dep衬底904 和第二dep
衬底906，其可以包括至少一个生长腔室和/或液流区域。装置900可以被另外配置为类似于微流体装置100、200、240、290、400、500a-e或600中任一种。封闭区域902可以是生物细胞被保持或被输入或被输出的区域。(第二dep衬底906 的)内表面910和(第一dep衬底904的)内表面912被经条件化的表面916所修饰，该经条件化的表面916可以是任何支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在该实施方案中，经条件化的表面经由硅氧基连接基团914共价连接至内表面的氧化物官能团。
205.在一些实施方案中，被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的共价连接的部分可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
206.被配置为支持微流体装置内的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的共价连接的部分可以是本文所述的任何聚合物，并且可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、糖部分、磺酸部分、磷酸酯部分、氨基酸部分、核酸部分或氨基部分的一种或多种聚合物。
207.在其他实施方案中，被配置为支持一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的共价连接的部分可以包括非聚合部分，例如烷基部分、氟代烷基部分(包括但不限于全氟代烷基)、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。
208.在一些实施方案中，共价连接的部分可以是烷基基团。烷基基团可以包括形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳原子的直链)的碳原子。因此，烷基基团可以是非支链烷基。在一些实施方案中，烷基基团可以包括取代的烷基基团(例如，烷基基团中的一些碳可以被氟化或全氟化)。烷基基团可以包含与未取代的碳的直链连接的经取代的(例如，氟化的或全氟化的)碳的直链。例如，烷基基团可以包括与第二节段节段(其可以包括未取代的烷基基团)结合的第一节段(其可以包括全氟代烷基基团)。第一和第二节段可以直接或间接(例如，通过醚链接)结合。烷基基团的第一节段可以位于连接基团的远端，且烷基基团的第二节段可以位于连接基团附近。在其他实施方案中，烷基基团可以包括支链烷基基团，并且可以进一步具有一个或多个中断烷基基团的烷基骨架的亚芳基基团。在一些实施方案中，烷基的支链的或亚芳基中断的部分或者氟化的烷基基团位于远离与表面的共价链接的点。
209.在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一种氨基酸，其可以包括超过一种氨基酸。共价连接的部分可以包括肽或蛋白质。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括氨基酸，其可以提供两性离子性表面以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
210.共价连接的部分可以包括一种或多种糖类。共价连接的糖类可以是单糖、二糖或多糖。共价连接的糖类可以被修饰，以引入反应性配对部分，其允许偶联或制定与表面的连
接。示例性的反应性配对部分可以包括醛、炔或卤代部分。可以以随机的方式来修饰多糖，其中可以修饰每个糖单体或者仅修饰多糖中一部分的糖单体，以提供反应性配对部分，其可以直接或间接偶联至表面。一个实例可以包括葡聚糖多糖，其可以经由非支链的连接部分间接偶联至表面。
211.共价连接的部分可以包括一个或多个氨基基团。氨基基团可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许对微流体装置内以及任选地对生长腔室内的环境进行ph修饰的结构。
212.共价连接的部分可以包括一种或多种羧酸、膦酸、氨基磺酸或磺酸部分。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括一种或多种核酸部分，其可以具有被设计为从微流体装置内的生物细胞捕获核酸的单个核苷酸的序列。捕获核酸可以具有与来自生物细胞的核酸互补的核苷酸序列并且可以通过杂交来捕获核酸。
213.经条件化的表面可以仅由一类部分构成或者可以包括超过一种不同类型的部分。例如，经氟代烷基条件化的表面(包括全氟代烷基)可以具有多个共价连接的部分，其均相同，例如具有相同的与表面的共价连接并且具有相同数目的包含支持生长和/或活力和/或可移植性的氟代烷基部分的氟代亚甲基单元。或者，经条件化的表面可以具有超过一种与表面连接的部分。例如，经条件化的表面可以包括具有特定数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基基团，并且还可以包括与表面连接的另一组基团，其具有与烷基或氟代烷基链连接的带电荷部分，该烷基或氟代烷基链具有更大数目的亚甲基或氟代亚甲基单元。在一些实施方案中，具有超过一种被连接的部分的经条件化的表面可以被设计为使得第一组被连接的配体(其具有更大数目的骨架原子并从而具有从共价连接到表面的更大的长度)可以在经条件化的表面处提供呈现更大的部分的能力，而第二组被连接的配体(其具有不同的、空间上要求更低的末端同时具有更少的骨架原子)能够有助于使整个衬底表面官能化，以防止与硅或氧化铝衬底本身的贴附或接触。在另一个实例中，与表面连接的部分可以提供两性离子性表面，其在表面上以随机的方式呈现交替的电荷。
214.经条件化的表面性质。在一些实施方案中，共价连接的部分在共价连接至微流体装置的表面(例如，dep配置的衬底表面)时可以形成单层。在一些实施方案中，由共价连接的部分所形成的经条件化的表面可以具有小于10nm(例如，小于5nm或约 1.5至3.0nm)的厚度。在其他实施方案中，由共价连接的部分所形成的经条件化的表面可以具有约10nm至约50nm的厚度。在一些实施方案中，经条件化的表面不要求完美形成的单层以适当地在dep配置内的操作中起作用。
215.在各种实施方案中，微流体装置的经条件化的表面可以提供期望的电性质。不期望受理论的限制，影响经条件化的表面的耐用性的一个因素是固有的电荷俘获。不同的表面条件化材料可以俘获电子，这可以导致材料的分解。经条件化的表面中的缺陷可能导致电荷俘获以及经条件化的表面的分解。
216.除了经条件化的表面的组成之外，其他因素(例如疏水性材料的物理厚度)可能影响dep力。各种因素可能改变经条件化的表面的物理厚度，例如在衬底上形成经条件化的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、泛涂和静电涂布)。经条件化的表面的物理厚度和均匀性可以使用椭圆率计来测量。
217.除了其电性质之外，经条件化的表面还可以具有在用于生物分子时有益的性质。
例如，相对于烷基封端的链，含有氟代的(或全氟代的)碳链的经条件化的表面可以在降低表面结垢方面提供益处。如本文所使用的，表面污垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物材料(例如蛋白质及其降解产物、核酸和各自的降解产物，等等)的永久性或半永久性沉积。
218.可用于dep配置中的经条件化的表面的各种性质包括在下表中。能够看到，对于条目1至7(其均为本文所述的共价连接的经条件化的表面)，通过椭圆率计测量的厚度均比条目8(通过非共价旋涂而形成的cytop表面)的更薄(在整个表中，n/a表示数据不可得)。发现结垢比形成方式更取决于表面的化学性质，因为氟代的表面通常比经烷基(烃)条件化的表面更少结垢。
219.表1.通过对表面进行共价修饰而制备的各种经条件化的表面的性质与非共价形成的表面cytop比较。
220.[0221][0222]
cytop结构：
[0223]
旋涂的，非共价。
[0224]
与表面的连接基团。形成经条件化的表面的共价连接的部分经由连接基团连接至表面。连接基团可以是硅氧基连接基团，其通过含硅氧烷的试剂与衬底表面的氧化物 (其可以由硅或铝氧化物形成)的反应而形成。在一些其他实施方案中，连接基团可以是膦酸酯，其通过含膦酸的试剂与硅或铝衬底表面的氧化物的反应而形成。
[0225]
多部分经条件化的表面。共价连接的经条件化的表面可以由表面条件化试剂形成，该表面条件化试剂被配置为已经含有提供经条件化的表面的部分(例如，烷基硅氧烷试剂或氟取代的烷基硅氧烷试剂，其可以包括全氟代烷基硅氧烷试剂)，如下文所述。或者，经条件化的表面可以通过将支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分与本身共价连接至表面的表面修饰配体偶联而形成。
[0226]
用于经条件化的表面的结构和制备方法。在一些实施方案中，共价连接至介电电泳衬底的表面的氧化物的经条件化的表面具有式1的结构：
[0227][0228][0229]
经条件化的表面可以共价连接至介电电泳衬底的表面的氧化物。介电电泳衬底可以是硅或氧化铝，且氧化物可以作为衬底的原始化学结构的一部分而存在或者可以如下文所述地引入。经条件化的表面可以经由连接基团lg连接至氧化物，该连接基团 lg可以是硅
烷氧基或膦酸酯基团，其由硅氧烷或膦酸基团与氧化物的反应而形成
[0230]
被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。烷基或氟代烷基部分可以具有等于或大于10个碳的骨架链长度。在一些实施方案中，烷基或氟代烷基部分可以具有约10、12、14、16、18、20或22个碳的骨架链长度。
[0231]
连接基团lg可以直接或间接连接至在微流体装置内提供支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。当连接基团lg直接连接至该部分时，任选的连接部分l 不存在，且n为0。当连接基团lg间接连接至该部分时，连接部分l存在，且n为1。连接部分l可以具有线性部分，其中线性部分的骨架可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合的非氢原子，其受本领域中已知的化学键合的限制。在一些非限制性实例中，其可以被一个或多个选自醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的部分的任意组合所中断。此外，连接部分l可以具有一个或多个使连接部分的骨架中断的亚芳基、亚杂芳基或杂环基团。在一些实施方案中，连接部分l的骨架可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分l的骨架可以包括约5个原子至约 200个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子均为碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
[0232]
表面条件化试剂。当在一步法中向衬底的表面添加被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合并且从而提供经条件化的表面的部分时，可以使用式6的表面条件化试剂以引入经条件化的表面。
[0233]
表面条件化试剂可以具有式6的结构：
[0234]
部分-(l)
n-lg
[0235]
式6
[0236]
在式6的表面条件化试剂中，表面条件化试剂可以包括连接基团lg，其可以是硅氧烷或膦酸基团。连接基团lg可以直接或间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。lg可以直接(n＝0)连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分或者经由与连接部分l的第一末端的连接而间接 (n＝1)连接至该部分。连接部分l还可以包括线性部分，其中线性部分的骨架可以具有1至200个非氢原子，所述非氢原子选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。线性部分的骨架还可以包括一个或多个亚芳基部分。被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分(“部分”)可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦
酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以包括烷基或全氟代烷基部分。烷基或全氟代烷基部分可以具有大于10个碳的骨架链长度。表面条件化试剂的被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以包括糖部分，其可以是葡聚糖。在其他实施方案中，表面条件化试剂的被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以包括亚烷基醚部分。亚烷基醚部分可以是聚乙二醇。表面条件化试剂还可以包括可裂解部分，其可以位于连接部分l内部或者可以是表面条件化试剂的被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分的一部分。可裂解部分可以被配置为允许破坏经条件化的表面，从而促进培养后的一个或多个生物细胞的可移植性。
[0237]
在一些实施方案中，可以在多步法中向衬底的表面添加支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。当该部分以分步的方式与表面偶联时，连接部分l还可以部分
[0238]
包括如式2所示的偶联基团。
[0239][0240]
在一些实施方案中，偶联基团cg表示由反应性部分r
x
与被配置为与其反应的部分即反应性配对部分r
px
之间的反应所得到的部分。例如，一种典型的cg可以包括羧酰氨基基团，其是氨基基团与羧酸衍生物(例如活化的酯、酸氯等)的反应的结果。cg 可以包括亚三唑基、羧酰氨基、硫代酰氨基、肟、巯基、二硫化物、醚或烯基基团，或者可以由反应性部分与其相应的反应性配对部分的反应形成的任何其他适当的基团。偶联基团cg可以位于与该部分所连接的连接部分l的第二末端处。在一些其他实施方案中，偶联基团cg可以使连接部分l的骨架中断。在一些实施方案中，偶联基团 cg是亚三唑基，其是炔基和叠氮化物基团之间反应的结果，二者均可以是本领域中已知用于click偶联反应中的反应性部分或反应性配对部分。亚三唑基还可以被进一步取代。例如，由具有二苯并环辛炔基反应性配对部分r
px
的条件化修饰试剂与表面修饰配体的叠氮基反应性部分r
x
的反应可以得到二苯并环辛炔基稠合的亚三唑基部分，这在以下内容中进行更详细的描述。多种二苯并环辛炔基修饰的分子是本领域中已知的，且可以被合成，以并入被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0241]
当在多步法中形成经条件化的表面时，可以通过条件化修饰试剂(式5)与具有式 3的结构的具有与其共价连接的表面修饰配体的衬底的反应来引入支持细胞生长、活力、可
移植性或其任意组合的部分。
[0242][0243]
式3的中间修饰的表面具有与其连接的表面修饰配体，其具有化学式-lg-(l”)j-r
x
，其连接至衬底的氧化物，且与上文对于式1的经条件化的表面所述类似地形成。dep 衬底的表面如上文所述，且包括衬底上原始存在的或者向其中引入的氧化物。连接基团lg如上文所述。连接部分l”可以存在(j＝1)或不存在(j＝0)。连接部分l”可以具有线性部分，其中线性部分的骨架可以包括1至100个非氢原子，所述非氢原子选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。在一些非限制性实例中，其可以被醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的任意组合所中断。此外，连接部分l”可以具有一个或多个使连接部分的骨架中断的亚芳基、亚杂芳基或杂环基团。在一些实施方案中，连接部分l”的骨架可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分l”的骨架可以包括约5个原子至约100个原子；约10个原子至约80个原子、约10个原子至约50个原子或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子均为碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
[0244]
反应性部分r
x
存在于表面修饰配体的远离该表面修饰配体与表面的共价连接的末端。反应性部分r
x
是任何适当的可用于偶联反应以引入支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分的反应性部分。在一些实施方案中，反应性部分r
x
可以是叠氮基、氨基、溴代、巯基、活化的酯、琥珀酰亚氨基或炔基部分。
[0245]
条件化修饰试剂。条件化修饰试剂(式5)被配置为供给支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0246]
部分-(l
′
)
m-r
px
[0247]
式5
[0248]
通过反应性配对部分r
px
与反应性部分r
x
的反应而将条件化修饰试剂的被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分连接至表面修饰配体。反应性配对部分r
px
是任何适当的被配置为与相应的反应性部分r
x
反应的反应性基团。在一个非限制性实例中，一个适当的反应性配对部分r
px
可以是炔，且反应性部分r
x
可以是叠氮化物。或者，反应性配对部分r
px
可以是叠氮化物部分，且相应的反应性部分r
x
可以是炔。在其他实施方案中，反应性配对部分r
px
可以是活性酯官能团，且反应性部分 r
x
可以是氨基基团。在其他实施方案中，反应性配对部分r
px
可以是醛，且反应性部分 r
x
可以是氨基。其他反应性部分-反应性配对部分的组合是可能的，并且这些实例无论如何不是限制性的。
[0249]
式5的条件化修饰试剂的被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的
部分可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
[0250]
式5的条件化修饰试剂的提供增强的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以直接(l’，其中m＝0)或间接连接至反应性配对部分r
px
。当反应性配对部分r
px
间接连接至提供增强的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分时，反应性配对部分r
px
可以连接至连接部分l’(m＝1)。反应性配对部分r
px
可以连接至连接部分l’的第一末端，且提供增强的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以连接至连接部分l’的第二末端。连接部分l’可以具有线性部分，其中线性部分的骨架包括1至100个非氢原子，所述非氢原子选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。在一些非限制性实例中，其可以被醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的任意组合所中断。此外，连接部分l’可以具有一个或多个使连接部分l’的骨架中断的亚芳基、亚杂芳基或杂环基团。在一些实施方案中，连接部分l’的骨架可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分l’的骨架可以包括约5个原子至约100个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50 个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子均为碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
[0251]
当条件化修饰试剂(式5)与具有表面修饰配体(式3)的表面反应时，形成式2 的具有经条件化的表面的衬底。然后，连接部分l’和连接部分l”是连接部分l的正式部分，且反应性配对部分r
px
与反应性部分r
x
的反应得到式2的偶联基团cg。
[0252]
表面修饰试剂。表面修饰试剂是具有结构lg-(l”)
j-r
x
(式4)的化合物。连接基团 lg共价连接至介电电泳衬底表面的氧化物。介电电泳衬底可以是硅或氧化铝，且氧化物可以作为衬底的原始化学结构的一部分而存在或者可以如本文所述地引入。连接基团lg可以是硅烷氧基或膦酸酯基团，其由硅氧烷或膦酸基团与衬底表面上的氧化物的反应而形成。反应性部分r
x
如上文所述。反应性部分r
x
可以直接(l”，j＝0)连接至连接基团lg或者经由连接部分l”(j＝1)而间接连接至连接基团lg。连接基团lg 可以连接至连接部分l”的第一末端，且反应性部分r
x
可以连接至连接部分l”的第二末端，一旦表面修饰配体已被如式3所示地连接至表面，其会远离衬底的表面。
[0253]
[0254]
连接部分l”可以具有线性部分，其中线性部分的骨架包括1至100个非氢原子，所述非氢原子选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合。在一些非限制性实例中，其可以被醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的任意组合所中断。此外，连接部分l”可以具有一个或多个使连接部分l”的骨架中断的亚芳基、亚杂芳基或杂环基团。在一些实施方案中，连接部分l”的骨架可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分l”的骨架可以包括约5个原子至约100个原子；约10个原子至约80个原子、约10个原子至约50个原子或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子均为碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全是碳，且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
[0255]
可裂解部分。在各种实施方案中，支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分、连接部分l、连接部分l’、连接部分l”或偶联基团cg中的任一种还可以包括可裂解部分，如下文所述。可裂解部分可以被配置为允许破坏微流体装置的经条件化的表面，这促进一个或多个生物细胞的可移植性。在一些实施方案中，一个或多个生物细胞的可移植性是期望的，以便能够在培养细胞一段时间后移动细胞，并且尤其是能够将细胞从微流体装置输出。
[0256]
衬底的组合物。因此，提供了一种组合物，其包括具有介电电泳(dep)配置和表面的衬底；以及共价连接至衬底表面的氧化物部分的经条件化的表面。衬底上的经条件化的表面可以具有式1或式2的结构：
[0257][0258]
其中lg是连接基团；l是连接部分，其可以存在(n＝1)或不存在(n＝0)；所述部分是在微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分；且cg 是偶联基团，如本文所定义的。
[0259]
经条件化的表面可以包括共价连接至表面的氧化物部分的连接基团lg。连接基团可以进一步连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接基团可以是硅氧基连接基团。在其他实施方案中，连接基团可以是膦酸酯。连接基团可以直接或间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接基团可以经由与连接部分的第一末端的连接而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接部分还可以包括线性部分，其中线性部分的骨架可以具有1至200个非氢原子，所述非氢原子选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合，如上文所述。线性部分的骨架还可以包括一个或多个亚芳基部分。
[0260]
连接部分可以具有如上文所定义的偶联基团cg。偶联基团cg可以包括亚三唑基部
分。亚三唑基部分可以中断连接部分的线性部分或者可以在第二末端处连接至连接部分的线性部分。连接部分的第二末端可以远离衬底的表面。被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以包括以下中的一种或多种：烷基或氟代烷基 (其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。在一些实施方案中，在经条件化的表面中并入不同部分的混合物，例如但不限于提供两性离子性经条件化的表面的阴离子性和阳离子性官能团的混合物。经条件化的表面可以包括烷基或全氟代烷基部分。烷基或全氟代烷基部分可以具有大于10个碳的骨架链长度。经条件化的表面可以包括糖部分，且可以是葡聚糖。在其他实施方案中，经条件化的表面可以包括亚烷基醚部分。亚烷基醚部分可以是聚乙二醇。经条件化的表面还可以包括可裂解部分。可裂解部分可以被配置为允许破坏经条件化的表面，从而促进一个或多个生物细胞的可移植性。
[0261]
提供了另一种组合物，其包括具有介电电泳(dep)配置和表面的衬底，和共价连接至衬底表面的氧化物部分的表面修饰配体。具有表面修饰配体的表面可以具有式3 的结构：
[0262][0263]
其中lg是连接基团；l”是任选的连接部分，j为0或1。连接部分l”当j＝1时存在且当j＝0时不存在；且r
x
是反应性部分，如本文所述。
[0264]
表面修饰配体的反应性部分可以是叠氮基、氨基、溴代、巯基、活化的酯、琥珀酰亚氨基或炔基部分。表面修饰配体可以经由连接基团共价连接至氧化物部分。连接基团可以是硅烷氧基部分。在其他实施方案中，连接基团可以是膦酸酯。连接基团可以经由连接部分间接连接至表面修饰配体的反应性部分。连接基团可以连接至连接部分的第一末端且反应性部分可以连接至连接部分的第二末端。连接部分l”可以包括线性部分，其中线性部分的骨架包括1至100个非氢原子，所述非氢原子选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合。连接部分l”的骨架可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分l”的骨架可以包括约5个原子至约50个原子。在一些实施方案中，连接部分l”的骨架可以包括所有碳原子。线性部分的骨架可以包括一个或多个亚芳基部分。连接部分l”可以包括亚三唑基部分。亚三唑基部分可以中断连接部分l”或者可以连接在连接部分l”的末端处。表面修饰配体可以包括可裂解部分。可裂解部分可以被配置为允许破坏微流体装置的经条件化的表面，从而促
进一个或多个生物细胞的可移植性。
[0265]
制备方法。在一些实施方案中，通过使用化学气相沉积将经条件化的表面或表面修饰配体沉积在微流体装置的内表面上。通过分子的气相沉积，经条件化的表面/表面修饰配体可以实现紧密堆积的单层，其中包含经条件化的表面/表面修饰配体的分子共价连接至任一微流体装置(100、200、240、290、400、500a-e、600)的内表面的分子。为了实现期望的堆积密度，可以将包含例如烷基封端的硅氧烷的分子在至少110℃(例如，至少120℃、130℃、140℃、150℃、160℃等)的温度下气相沉积至少15小时(例如，至少20、25、30、35、40、45或更多小时)的一段时间。这种气相沉积通常在真空下和在水源(例如水合的硫酸盐(如mgso4·
7h2o))的存在下进行。通常，增加气相沉积的温度和持续时间产生经条件化的表面/表面修饰配体的改善的特征。在一些实施方案中，经条件化的表面或表面修饰配体可以通过在液相中反应而引入。
[0266]
为了制备微流体表面，可以用氧等离子体处理来处理盖、微流体管路材料和电极活化衬底，其可以去除各种杂质，同时引入氧化的表面(例如，表面处的氧化物，其可以如本文所述地被共价修饰)。氧等离子体清洁器可以例如在真空条件下在100w下操作60秒。或者，可以使用液相处理，其包括诸如过氧化氢的氧化剂以氧化该表面。例如，盐酸与过氧化氢的混合物或者硫酸与过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其可以具有约3:1至约7:1范围的硫酸与过氧化氢比例)。
[0267]
可以通过例如预清洁盖、微流体管路材料和电极活化衬底而任选地改进气相沉积过程。例如，这样的预清洁可以包括溶剂浴，例如丙酮浴、乙醇浴或其组合。溶剂浴可以包括超声处理。
[0268]
在一些实施方案中，在已经装配微流体装置以形成定义微流体管路的外壳之后，使用气相沉积来涂覆微流体装置的内表面。
[0269]
当具有表面修饰配体的衬底进一步与条件化修饰试剂反应以制备具有经条件化的表面的衬底时，反应可以通过使用任何适当的会溶解试剂且不会破坏微流体管路材料或具有表面修饰配体的表面的溶剂原位进行。在一些实施方案中，溶剂是水性溶液。
[0270]
制备经条件化的表面或包括表面修饰配体的表面的方法。因此，提供了一种制备具有介电电泳(dep)配置的微流体装置的经修饰的表面的方法，其包括以下步骤：提供微流体装置的衬底的表面，其中该衬底包括dep配置；使表面的氧化物与修饰试剂反应，从而将衬底的表面转化成经修饰的表面。在一些实施方案中，衬底的表面可以被等离子体清洁，以在表面上提供氧化物。在一些实施方案中，可以在装配微流体装置之前对表面进行等离子体清洁。在其他实施方案中，可以在装配微流体装置之后对表面进行等离子体清洁。
[0271]
一种方法，其中使表面的氧化物与修饰试剂反应的步骤通过使表面暴露于包含修饰试剂的液体来进行。在一些实施方案中，使表面的氧化物反应的步骤可以通过使表面暴露于在减压下含有修饰试剂的蒸汽来进行。
[0272]
在一些实施方案中，修饰试剂可以包括表面条件化试剂，其具有：第一部分，其被配置为与表面发生共价反应；和第二部分，其被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合，从而将表面修饰成被条件化为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的表面。
[0273]
表面条件化试剂可以具有式6的结构：
[0274]
部分-(l)
n-lg
[0275]
式6
[0276]
第一部分可以包括连接基团lg，其可以是硅氧烷或膦酸基团。连接基团lg可以直接或间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。第一部分可以直接(n＝0)连接至第二部分或者经由与连接部分l的第一末端的连接而间接(n＝1)连接至第二部分，该第二部分是被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接部分l还可以包括线性部分，其中线性部分的骨架可以具有 1至200个非氢原子，该非氢原子选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合。线性部分的骨架还可以包括一个或多个亚芳基部分。表面条件化试剂的第二部分(“部分”) 可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团 (包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。表面条件化试剂的第二部分可以包括烷基或全氟代烷基部分。烷基或全氟代烷基部分可以具有大于10个碳的骨架链长度。表面条件化试剂的第二部分可以包括糖部分，且可以是葡聚糖。在其他实施方案中，表面条件化试剂的第二部分可以包括亚烷基醚部分。亚烷基醚部分可以是聚乙二醇。表面条件化试剂还可以包括可裂解部分，其可以位于连接部分l内或者可以是表面条件化试剂的第二部分的一部分。可裂解部分可以被配置为允许破坏经条件化的表面，从而促进一个或多个生物细胞的可移植性。
[0277]
在各种实施方案中，修饰试剂可以包括表面修饰试剂，其具有如上文所定义的式4 的结构，其中表面修饰试剂包括第一部分lg，其被配置为与表面反应；和第二部分r
x
，其可以被修饰或不被修饰以包括反应性部分，包括叠氮基、氨基、溴代、巯基、活化的酯、琥珀酰亚氨基或炔基部分，从而将表面转化成如上文所述的具有式3结构的包含表面修饰配体的表面。在一些实施方案中，表面修饰试剂的第一部分(其被配置为与表面的氧化物反应)可以是硅氧烷或膦酸。
[0278]
在一些实施方案中，该方法包括使包含表面修饰配体(式3)的表面与条件化修饰试剂反应的步骤，该条件化修饰试剂包括第一部分，其被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合；和第二部分r
px
，其被配置为与表面修饰配体的反应性部分反应；从而提供被条件化以支持生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的表面，其具有如上文所述的式2的结构。条件化修饰试剂可以具有式5的结构。在一些实施方案中，条件化修饰试剂的第一部分包含亚烷基氧化物部分、氨基酸部分、糖部分、阴离子部分、阳离子部分和两性离子部分中的至少一种。
[0279]
在各种实施方案中，表面条件化试剂、表面修饰试剂或条件化修饰试剂中的任一种还可以包括如本文所述的可裂解部分。
[0280]
含有其他组分的经条件化的表面。不同于聚合物或通过共价连接的部分所形成的经条件化的表面或者是除此之外(in addition to)，经条件化的表面可以另外包括其他组分，包括生物相容性金属离子(例如，钙、钠、钾或镁)、抗氧化剂、表面活性剂和/或必需的营
养物。非限制性示例性列举包括维生素，例如b7、α-生育酚、α-生育酚乙酸盐、维生素a及其乙酸盐；蛋白质，例如bsa、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶；小分子，例如皮质酮、d-半乳糖、乙醇胺盐酸盐、还原的谷胱甘肽、l
‑ꢀ
肉毒碱盐酸盐、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺二盐酸盐和三碘甲腺原氨酸；以及盐，包括但不限于亚硒酸钠、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙和/或磷酸镁。抗氧化剂可以包括但不限于类胡萝卜素、肉桂酸及衍生物、阿魏酸、多酚例如黄酮类、醌及衍生物(包括米托蒽醌-q)、n-乙酰基半胱氨酸以及抗氧化维生素例如抗坏血酸、维生素e等等。经条件化的表面可以包括培养基补充物，例如补充剂，其含有抗氧化剂和许多上文列出的其他组分。补充剂是可从thermofisher scientific以无血清的形式商购的 (50x)(目录号17504044)。
[0281]
在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括哺乳动物血清的一种或多种组分。在一些实施方案中，哺乳动物血清是胎牛血清(fbs)或胎牛血清(fcs)。经条件化的表面可以包括哺乳动物血清的特定组分，例如特定量和类型的通常见于血清中的蛋白质，其可以从无血清培养基或成分明确的培养基以定义的量和类型来提供。
[0282]
在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面不包括哺乳动物血清。在各种实施方案中，至少一个经条件化的表面可以不包括任何钛、镍或铁金属离子。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以不包括任何显著浓度的钛、镍或铁金属离子。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以不包括任何金、铝或钨金属离子。
[0283]
试剂处理以减少贴附。试剂的混合物。随着细胞在微流体装置内培养，细胞活跃地分泌蛋白质和其他生物分子并被动地渗出类似的生物分子，其可以贴附在微流体装置内的表面上。培养物中的细胞可能彼此贴附或者贴附至经条件化的表面，并且变得难以从生长腔室移除，以便从微流体装置输出。此外，在某些情况下，可能期望将与培养细胞相同或不同类型的另外的细胞带入微流体装置中。这些新递送的细胞也可能变得贴附至表面，在微流体环境中积累污垢，并在以后的时间点造成从装置移除的困难。
[0284]
用蛋白酶例如胰蛋白酶或(具有蛋白水解和溶胶原活性的酶混合物， innovative cell technologies)处理不一定能提供足够的效率，以便(对于一个非限制性实例来说)允许将贴附的细胞从微流体装置中输出。可以以混合物的形式使用一种或多种提供抗贴附性质的蛋白质和/或肽，以在这两种情况下减少这种贴附。可以使用具有对抗多种细胞贴附机理之一的活性的生物分子或小分子。一些可以被抑制的细胞贴附机理可以是活性激动蛋白丝形成和相关的过程，其可以被诸如细胞松弛素b(newengland biosciences，目录号：m0303s，其是微丝延伸的小分子抑制剂)的化合物的使用所靶向。特定的受体驱动的贴附过程，例如但不限于对整合素受体介导的与纤连蛋白(其可以在结垢的表面上发现)的贴附的抑制，可以被例如含rgd的肽的使用所靶向。另一类结垢物质，即，由死细胞释放的核酸，可能吸引细胞结合，其可以被会使结垢的核酸断裂的核酸内切酶的使用所靶向。一种特定的核酸内切酶，脱氧核糖核酸酶1 (dnase 1，sigma aldrich，目录号ampd1-1kt)还与肌动蛋白结合，从而提供对贴附的双重活性阻断。在一些实施方案中，可以使用所有三种阻断剂的混合物以防止/减少细胞贴附。
[0285]
一般性处理方案。培养后：对于已经在微流体装置内生长2、3、4天或更多天的细胞，可以使如下文所述的三种抗贴附试剂的混合物或者单一的抗贴附试剂流入微流体装置，并在输出细胞之前允许其扩散进入生长腔室约20min、30min、40min、50min 或60min的
时间段。
[0286]
预处理：对于待输入到微流体装置中的细胞，可以将细胞在含有该混合物或单一抗贴附试剂的培养基中预孵育约30min，然后输入到微流体芯片中。在不进一步添加试剂的情况下，抑制持续1、2、3或更多个小时的时间。
[0287]
rgd肽(mw.614.6，santa cruz biotechnology，目录号sc-201176)可以在培养基或输入前的孵育介质中以约0.1mm至约20mm的浓度存在。在一些实施方案中，rgd 三肽存在的浓度可以为约0.1、0.5、0.7、1.0、3.0、5.0、6.0、8.0、10.0mm或该范围内的任何值。细胞松弛素b可以在输入前的孵育介质中以约0.01μm至约50μm或约0.01、0.05、0.1、2、4、6、8、10、20、30、50μm或该范围内的任何值的浓度存在。 dnase 1可以以约0.001u/μl至约10u/μl或约0.001、0.005、0.01、0.05、1.0、5.0、 10u/μl或该范围内的任何值的浓度存在。
[0288]
在一些实施方案中，可以在微流体装置中培养细胞之前或之后使用单一试剂来减少贴附。例如，可以以5mg/ml的浓度使用rgd三肽，或者用于预孵育，或者可以在输出前作为微流体装置内的处理而流入。
[0289]
可以使用的另一种抑制剂是四肽纤连蛋白抑制剂(arg-gly-asp-ser-oh，mw.433.4， santa cruz biotechnology，目录号：sc-202156))。纤连蛋白抑制剂可以以约1.75μg/ml (4μm)的浓度使用。
[0290]
类似于使用蛋白质或小分子试剂来减少或防止贴附，可以使用抗细胞外贴附相关的蛋白质的抗体在微流体装置内实现输出和可移植性。一个非限制性实例是抗-b1整合素：克隆m-106.(santa cruz biotechnology，目录号：sc-8978)。
[0291]
含有可裂解部分的经条件化的表面。在一些实施方案中，经条件化的表面可以具有并入到经条件化的表面的共价或非共价连接的分子中的可裂解部分。经条件化的表面可以包括肽基序，例如rgd，其具有如上所述的功能；或者其可以具有促进细胞生长或为细胞增殖提供接触信号的另一肽基序。在其他实施方案中，经条件化的表面为细胞提供非特异性支持，并且可以发挥简单地从微流体装置的硅或氧化铝表面缓冲细胞的作用。在一段时间的细胞培养完成后，可能期望破坏经条件化的表面，以促进微流体装置的生长腔室内扩增的细胞群的输出。当细胞显示贴附行为时，这可能是有用的。经条件化的表面可以被破坏，部分或完全移除，这通过并入其他肽基序而完成，该其他肽基序是不被目标细胞高度分泌的蛋白酶的底物。在一个非限制性实例中，可以将 enlyqs肽基序(glu-asn-leu-tyr-gln-ser)以预先设计的间隔并入到经条件化的表面中。该基序是tev蛋白酶(烟草蚀刻病毒半胱氨酸蛋白酶，sigma aldrich，目录号t4455) 的底物，其是高度序列特异性的，并且因此可用于高度受控的裂解。在培养阶段完成后，可以使tev蛋白酶流入到微流体装置中并允许其扩散进入生长腔室的分离区域。然后破坏经条件化的表面，这有助于微流体装置内细胞的输出。因此，如本领域技术人员可以设计的，可以设计多种其他蛋白水解基序并将其并入到经条件化的表面中，以被适当的特异性蛋白酶所裂解。
[0292]
流体培养基。对于前文关于具有通道和一个或多个生长腔室的微流体装置的讨论，流体培养基(例如，第一培养基和/或第二培养基)可以是能够使细胞保持在基本存活状态的任何流体。存活状态会取决于生物微物体和被进行的培养实验。
[0293]
第一和/或第二流体培养基可以提供细胞活力所必需的流体和溶解的气体组分，并且还可以通过使用缓冲的流体培养基或ph监测或这两者而使ph保持在期望的范围。
[0294]
若细胞是哺乳动物细胞，则第一流体培养基和/或第二流体培养基可以包括哺乳动物血清或本领域已知的成分明确的无血清培养基，其能够提供必需的营养物、激素、生长因子或细胞生长信号。与上文的经条件化的表面类似，第一流体培养基和/或第二流体培养基可以包括胎牛血清(fbs)或胎牛血清(fcs)。或者，第一流体培养基和/或第二流体培养基可以不包括任何动物来源的血清但可以包括成分明确的培养基，其可以包括任何或所有的生理学相关的金属离子(包括但不限于钠、钾、钙、镁和/或锌)、抗氧化剂、表面活性剂和/或必需的营养物。成分明确的培养基可以是无血清的，但仍含有一些蛋白质，其中蛋白质具有定义的量和类型。无血清培养基中组分的非限制性示例性列举包括维生素，例如b7、α-生育酚、α-生育酚乙酸盐、维生素a及其乙酸盐；蛋白质，例如bsa、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶；小分子，例如皮质酮、d-半乳糖、乙醇胺盐酸盐、还原的谷胱甘肽、l-肉毒碱盐酸盐、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺二盐酸盐和三碘甲腺原氨酸；以及盐，包括但不限于亚硒酸钠、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙和/或磷酸镁。流体培养基可以含有上文对于经条件化的表面所述的任何抗氧化剂。
[0295]
流体培养基可以经过0.22微米过滤器单元(vwr，目录号73520-986)无菌过滤。
[0296]
在一些实施方案中，适当的培养基可以包括以下任何培养基，或者可以完全由以下任何培养基组成：达尔伯克氏改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium) (thermofisher scientific，目录号11960-051)；freestyle
tm
培养基(invitrogen， thermofisher scientific，目录号11960-051)；rpmi-1640(thermofisherscientific，目录号11875-127)；杂交瘤-sfm(thermofisher scientific，目录号12045
‑ꢀ
076)；培养基e(stem cell，目录号3805)；1x cd cho培养基(thermofisher scientific，目录号10743-011)；伊思柯夫改良培养基(iscove’s modified dulbecco’s medium) (thermofisher scientific，目录号12440-061)；或cd dg44培养基(thermofisherscientific，目录号10743-011)。
[0297]
培养基可以另外包括胎牛血清(fbs，得自thermofisher scientifi)、热灭活的胎牛血清；或胎牛血清(fcs，sigma-aldrich，目录号f2442、f6176、f4135及其他)。fbs存在的浓度可以为约1％至约20％v/v；约1％至约15％v/v、约1％至约10％ v/v或约1％至约5％v/v，或任意范围内的任意数值。培养基可以另外包括人ab血清 (sigma-aldrich，目录号s2146)，且其存在的浓度可以为约1％至约20％v/v；约1％至约15％v/v、约1％至约10％v/v或约1％至约5％v/v，或任意范围内的任意数值。
[0298]
培养基可以另外包括青霉素-链霉素(thermofisher scientific，目录号15140-163)。青霉素-链霉素存在的浓度可以为约0.01％至约10％v/v；约0.1％至约10％v/v；约0.01％至约5％v/v；约0.1％至约5％v/v；约0.1％至约3％v/v；约0.1％至约2％v/v；约0.1％至约1％v/v；或任意范围内的任意值。在其他实施方案中，培养基可以包括遗传霉素 (thermofisher scientific，目录号101310-035)。遗传霉素存在的浓度可以为约0.5μ g/ml；约1.0μg/ml；约5.0μg/ml；约10.0μg/ml；约15μg/ml；约20μg/ml；约30μg/ml；约50μg/ml；约70μg/ml；约100μg/ml；或这些范围内的任意值。
[0299]
培养基可以包括缓冲剂。缓冲剂可以是good’s缓冲液中的一种。缓冲剂可以是但不限于4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(hepes)(thermofisher scientific，目录号15630
‑ꢀ
080)。缓冲剂存在的浓度可以为约1mm；约3mm；约5mm；约7mm；约9mm；约10mm；约12mm；约
15mm；约20mm；约40mm；约60mm；约100mm；或这些范围内的任意值。
[0300]
培养基可以另外包括谷氨酰胺的二肽代替物glutamax
tm
(thermofisherscientfic，目录号35050-079)。谷氨酰胺的代替物存在的浓度可以为约0.2mm；约0.5 mm；约0.7mm；约1.0mm；约1.2mm；约1.5mm；约1.7mm；约2.0mm；约2.5 mm；约3.0mm；约4.0mm；约7.0mm或约10.0mm，或这些范围内的任意值。培养基可以包括mem非必需氨基酸(thermofisher scientific，目录号10370-088)。mem 非必需氨基酸存在的量可以为约0.2mm；约0.5mm；约0.7mm；约1.0mm；约1.2 mm；约1.5mm；约1.7mm；约2.0mm；约2.5mm；约3.0mm；约4.0mm；约7.0 mm或约10.0mm，或这些范围内的任意值。
[0301]
培养基可以另外包括葡萄糖(thermofisher scientific，目录号15023-021)。葡萄糖存在的浓度可以为约0.1g/l；约0.1g/l；约0.1g/l；约0.3g/l；约0.5g/l；约0.8g/l；约1.0g/l；约1.5g/l；约2.0g/l；约2.5g/l；约3.0g/l；约3.5g/l；约4.0g/l；约 5.0g/l；约7.0g/l；约10.0g/l；或这些范围内的任意值。
[0302]
培养基可以另外包括巯基乙醇(thermofisher scientific，目录号31350-010)。巯基乙醇存在的浓度可以为约0.001％至约1.5％v/v；约0.005％至约1.0％v/v；约0.01％至约1.0％v/v；约0.15％至约1.0％v/v；约0.2％至约1％v/v；或这些范围内的任意值。
[0303]
培养基可以包括opi培养基添加物，包括草酰乙酸盐、丙酮酸盐和胰岛素(sigma
‑ꢀ
aldrich，目录号o-5003)。opi培养基添加物存在的浓度可以为约0.001％至约1.5％v/v；约0.005％至约1.0％v/v；约0.01％至约1.0％v/v；约0.15％至约1.0％v/v；约0.2％至约1％v/v；或这些范围内的任意值。培养基可以含有b-27补充物(50x)，其是无血清的(thermofisher scientific，目录号17504-163)。b-27补充物存在的浓度可以为约0.01％至约10.5％v/v；约0.05％至约5.0％v/v；约0.1％至约5.0％v/v；约0.5％至约5％v/v；或这些范围内的任意值。
[0304]
如本文所述，培养基或用于培养基的添加物可以包括一种或多种可用于获得经条件化的表面的聚合物，并且可以包括l44、l64、p85、f68和f127 (包括f127nf)。聚合物在培养基存在的浓度可以为约0.001％v/v至约10％ v/v；约0.01％v/v至约5％v/v；约0.01％v/v至约1％v/v或约0.05％至约1％v/v。对于可以以试剂盒的形式提供的培养基添加物，浓度可以是最终培养基浓度的1x、5x、 10x、100x或约100x。
[0305]
培养基可以包括il 6(sigma-aldrich，目录号srp3096-20ug)。il 6存在的浓度可以是约1nm；约5nm、约10nm、约15nm、约20nm、约25nm、约30nm、约 40nm、约50nm或者这些范围内的任何值。
[0306]
培养基可以另外包括丙酮酸钠(thermofisher scientific，目录号11360-070)。谷氨酰胺的代替物存在的浓度可以为约0.1mm；约0.02mm；约0.04mm；约0.06mm；约0.08mm；约0.1mm；约0.5mm；约0.7mm；约1.0mm；约1.2mm；约1.5mm；约1.7mm；约2.0mm；约2.5mm；约3.0mm；约4.0mm；约7.0mm或约10.0mm，或这些范围内的任意值。
[0307]
气态环境。系统提供用于细胞活力的气体混合物，包括但不限于氧和二氧化碳。这两种气体均溶解在流体培养基中，并且可以被细胞使用，从而随时间改变生长腔室的分离区域中的流体培养基的气体含量。特别地，二氧化碳含量可以随时间变化，这影响微流体装置中流体培养基的ph。在一些实验条件中，可以使用非最佳的氧分压。
[0308]
温度控制。在一些实施方案中，通过控制至少一个经条件化的表面的温度来条件
化生长腔室和/或液流区域的至少一个经条件化的表面。系统可以包括可以控制和调整微流体装置的生长腔室和/或液流区域的至少一个经条件化的表面的温度的组件。系统可以包括peltier加热、电阻加热，或任何其他适当的用于向微流体装置提供温度调整的方法。系统还可以包括传感器和/或反馈组件，以将热输入控制在预定的范围内。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面的温度为至少约25℃、26℃、27℃、28℃、 29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或约40℃，并且在该温度下稳定。在一些实施方案中，至少一个表面的温度高于约25℃。在其他实施方案中，至少一个表面的温度在约30
°‑
40℃；约35℃至约38℃；或约36℃至约37℃的范围内。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面的温度为至少约30℃。
[0309]
在孵育期间提供灌注的流控制器。流控制器可以在孵育期间在液流区域中灌注第一流体培养基，如上文所述，以向生长腔室中的细胞提供营养物并携带废物离开生长腔室，其中营养物的交换和废物的移除经由灌注而实质发生。控制器可以是与微流体装置分离的组件，或者可以作为微流体装置的一部分而并入。流控制器可以被配置为在液流区域中非连续地灌注培养基。流控制器可以被配置为以周期性的方式或不规则的方式灌注培养基。
[0310]
在一些其他实施方案中，控制器可以被配置为约每4h、3h、2h、60min、57min、 55min、53min、50min、47min、45min、43min、40min、37min、35min、33min、 30min、27min、25min、23min、20min、17min、15min、13min、10min、7min或 5min一次在液流区域中灌注流体培养基。在一些实施方案中，控制器可以被配置为约每5min至约每20min一次灌注流体培养基。在其他实施方案中，控制器可以被配置为约每15min至约每45min一次灌注流体培养基。在其他实施方案中，控制器可以被配置为每30min至约每60min一次灌注流体培养基。在其他实施方案中，控制器可以被配置为每45min至约每90min一次灌注流体培养基。在一些其他实施方案中，控制器可以被配置为每60min至约120min一次灌注流体培养基。或者，控制器可以被配置为每2h至每6h一次灌注流体培养基。
[0311]
在一些实施方案中，控制器226可以被配置为灌注培养基持续一段时间，该时间可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70秒。在其他实施方案中，控制器可以被配置为灌注培养基约1min、1.2min、1.4min、1.5min、1.6 min、1.8min、2.0min、2.2min、2.4min、2.5min、2.6min、2.8min、3.0min、3.2min、 3.4min、3.5min、3.6min、3.8min或4.0min。
[0312]
在各种实施方案中，控制器可以被配置为灌注培养基约5秒至约4min、约10秒至约3.5min、约15秒至约3min、约15秒至约2min、约25秒至约90秒约30秒至约75秒、约40秒至约2.0min、约60秒至约2.5min、约90秒至约3.0min或1.8min 至约4min。
[0313]
流控制器(未示出)可以被配置为在液流区域中灌注第一流体培养基，其速率远远高于将组分从生长腔室的分离区域向液流通道灌注的平均速率。例如，流体在液流区域流动的速率可以为约0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、 3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0μl/sec，任一速率均为扫过生长腔室的连接区域(但不会扫过生长腔室的分离区域)的速度速率。控制器可以能够提供第一流体培养基的速率，其是流体培养基速度的非扫过速率，即任何适当的低于v
max
(即，微流体装置的最大速度，其避免微流体装置由于过高的压力而破裂并限制组分在生长腔室中的第二流体培养
转移到微流体装置500b中，如图5b所示。透气性块518被并入到外壳102的上表面中，并形成其一部分。外壳102的上表面的由透气性块518所形成的部分可以在微流体装置500b的生长腔室的上游。微流体装置500b被容纳在腔室516内，该腔室提供气体环境(例如，5％二氧化碳)，该气体环境被交换到微流体装置500b中的流体培养基中。腔室516可以另外向微流体装置500b提供温度和/或湿度方面的条件化。泵连接管路504、外壳102或底座104都不是透气性的，并且通过透气性块518的交换可以作为微流体装置500b的“肺”起作用，并适当地条件化微流体装置500b内的培养基。在该实施方案中，在加载到泵514之前，流体培养基202可以在另一个元件中另外条件化，并且因此也可以含有例如来自饲养细胞培养物的分泌物质。
[0320]
在另一个实施方案中，透气性块被集成到微流体装置500c的外壳102的上表面中，形成透气性部分518
′
，如图5c所示。流体培养基可以如上文对于图5b的实施方案所述地被条件化和引入，并且还可以包括从饲养细胞群分泌的物质。微流体装置 500c可以被容纳在腔室516中，该腔室含有气体环境，例如空气中5％二氧化碳。气体环境可以跨越透气性部分518
′
(其可以是外壳102的上表面中的一个部分或者多个部分)交换。腔室516可以进一步条件化装置500c至适当的温度和湿度。在该实施方案中，泵连接管路504、外壳102(不同于透气性块518
′
)和底座104可以是不透气的。在一些实施方案中，至少一个透气性部分518
′
位于微流体装置500c的生长腔室的上方。在另一个实施方案中，至少一个透气性部分518
′
位于微流体装置500c的液流区域134的上方。在其他实施方案中，透气性部分518
′
可以位于至少一个生长腔室和至少一个液流区域134二者的上方。
[0321]
在其他实施方案中，可以在将培养基引入到微流体装置500d之前使用透气性管线 504
′
来条件化(例如，平衡)流体培养基，如图5d所示。可以选择透气性管线504
′
的长度以提供足够的表面积，以允许外壳516内有效的气体交换和平衡，该外壳可以含有气体环境，例如，在非限制性实例中，空气中5％二氧化碳。516的环境可以进一步条件化透气性泵连接管路504
′
内培养基的温度和/或湿度。可以用于透气性连接管路的透气性材料的一个非限制性实例是af。在引入到泵组件514中之前，流体培养基可以通过与饲养细胞群接触而被条件化，并且结果是可以含有可以优化微流体装置500d中被培养的细胞的生长和/或活力的被分泌的物质。在前的用饲养细胞群的条件化可以在腔室516内发生，或者可以在具有其自身的用于温度、湿度、ph和/或气体环境中任一项的环境控制的另一个培养组件中进行。在实施方案中，微流体装置 500d的外壳102和底座104可以是不透气的。
[0322]
在系统的储液器、培养基条件化和引入组件的另一个实施方案中，培养基可以在能够被置于适当的气体环境中的储液器502
′
中进行条件化，如图5e所示。储液器502
′
不必要是微流体装置或任何特定类型的培养组件。通过提供来自气体环境源524的连接进料526而将储液器502
′
置于适当的气体环境(例如，空气中5％二氧化碳)中。储液器502
′
内的流体培养基具有与由源524所提供的气体环境的气体交换，并且从而被条件化。储液器502
′
的流体培养基还可以含有饲养细胞的培养物，以提供被分泌的物质，其可以优化微流体装置500e中被培养的细胞的生长和/或活力。被条件化的流体培养基可以经由转移连接管路522(其连接至泵514上的阀门520)而从储液器502
′
转移，并且可以被泵514经由连接管路504注射到微流体装置500e的通道134中。被注射到微流体装置500e中的流体培养基形成流体流212。在穿过液流通道134之后，用过的流体培养基202
′
经由输出管路508离开微流体装置
500e。在该实施方案中，转移连接管路522、连接管路504、阀门520、泵514、外壳102和底座104可以均为不透气的。在一些实施方案中，将源524连接至储液器502
′
的连接管路526可以是基本上不透气的。在其他实施方案中，连接管路526不必要是基本上不透气的，但可以是相对不透气的。
[0323]
在图5e所示的系统的一些实施方案中，气体(未示出)可以连续流动或者可以被脉冲，例如周期性地替换(未示出)，从源524输入，其可以是空气中5％二氧化碳。在其他实施方案中，从源524输入的气体可以是100％二氧化碳。当使用100％二氧化碳气体时，少量二氧化碳气体可以被注射到储液器502
′
的顶部空间(未示出)中，以保持顶部空间为5％二氧化碳混合物。在一些实施方案中，当将气体注射到储液器502
′
的顶部空间中时，储液器502
′
还可以包括风扇(未示出)，以将注射的空气与顶部空间(未示出)中已经存在的其他气体组分(未示出)混合。在一些实施方案中，其中气体的输入是脉冲的，微流体装置500e的盖子102可以具有并入或连接于其中的二氧化碳传感器(未示出)。在一些实施方案中，可以从源524输入100％二氧化碳气体，以与可商购的空气中5％二氧化碳的气体混合物相比节约成本。在其他实施方案中，可以将100％二氧化碳气体引入到源524中并在其中与空气混合以制备5％二氧化碳混合物。
[0324]
在任一上述实施方案中，腔室516可以进一步被加湿，使得腔室的气体环境不改变微流体装置和/或储液器中的流体培养基的渗透压。
[0325]
在另一个实施方案中，向生长腔室中被培养的细胞提供适当的气体交换的另一种方法可以通过微流体装置的液流区域提供气体流(未示出)。适当的气体(例如，5％二氧化碳)可以被直接泵送或脉冲通过液流通道。因为生长腔室的分离区域被设计为大部分未扫过的体积，位于其中的细胞不被经过液流通道(扫过区域)移动的空气或气泡所扰动。这会在液流通道中的气体和生长腔室内部的流体培养基之间提供非常快速的气体交换，因为与例如50ml锥形管内的扩散距离相比，该扩散距离非常小。然后在任何所选的时间量之后，气体可以被流体培养基替换。气体流可以以任何期望的频率重复，以保持溶解的气体组分处于稳定的浓度，这也对流体培养基的ph有影响。或者，可以使用少于最佳的气体组成或重复次数，以扰动细胞的环境。
[0326]
总之，有多种组件和配置可以用于向本文所述的微流体装置的生长腔室中的细胞提供经条件化的培养基。任一微流体装置100、200、240、290或400可以与图5a-5e 的任一实施方案一起使用。系统和试剂盒可以包括连接管路，其被配置为连接至微流体装置的入口和/或出口。连接管路还可以被配置为连接至储液器和/或泵组件。
[0327]
因此，提供了一种用于培养一个或多个生物细胞的微流体装置，其包括：液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其包含至少一个表面，该至少一个表面被条件化为在微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合，其中该至少一个生长腔室包括分离区域和连接区域，该分离区域与连接区域为流体性连接，且连接区域包括到液流区域的近端开口。在各种实施方案中，微流体装置的分离区域可以被配置为含有第二流体培养基。当液流区域和至少一个生长腔室分别被第一和第二流体培养基基本充满时，第二流体培养基的组分可以扩散进入第一流体培养基和/或第一流体培养基的组分可以扩散进入第二流体培养基；并且第一培养基基本上不流入分离区域。在各种实施方案中，至少一个经条件化的表面可以被条件化为支持微流体装置内的一个或多个
生物细胞的可移植性。在一些实施方案中，经条件化的表面的部分可以被配置为支持微流体装置内的生物细胞的可移植性。
[0328]
在一些实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括含亚烷基醚部分的聚合物。在其他实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括含羧酸部分、磺酸部分、核酸部分或膦酸部分的聚合物。在其他实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括含糖部分的聚合物。在一些实施方案中，含糖部分的聚合物可以是葡聚糖。在一些其他实施方案中，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括含氨基酸部分的聚合物。
[0329]
或者，微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括哺乳动物血清的一种或多种组分。哺乳动物血清的组分可以是用于培养基的补充物。在一些实施方案中，哺乳动物血清可以是胎牛血清(fbs)或胎牛血清(fcs)。
[0330]
在微流体装置的各种实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括糖部分。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括亚烷基醚部分。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括氨基酸部分。在一些其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括烷基或全氟代烷基部分。在一些实施方案中，烷基或全氟代烷基部分可以具有大于10个碳的骨架链长度。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括这样的部分：其可以是烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
[0331]
在微流体装置的各种实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括共价连接至微流体装置的表面的连接基团，且连接基团可以连接至被配置为在微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，连接基团可以是硅氧基连接基团。在其他实施方案中，连接基团可以是膦酸酯连接基团。在一些实施方案中，连接基团可以间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，经条件化的表面的部分可以被配置为支持微流体装置内的生物细胞的可移植性。在其他实施方案中，连接基团可以直接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在其他实施方案中，连接基团可以经由连接部分而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在各种实施方案中，连接部分可以包括亚三唑基部分。
[0332]
在微流体装置的各种实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括两性离子。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括膦酸部分或羧酸部分。在其他实施方案中，经条件化的表面可以包括阴离子。在一些其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括氨基或胍部分。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括阳离子。
[0333]
在微流体装置的各种实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括至少一种细胞贴附阻断分子。至少一种细胞贴附阻断分子可以破坏激动蛋白丝形成、阻断整合素受体
或减少细胞与dna污染的表面的结合。至少一种细胞贴附阻断分子可以是细胞松弛素b、含rgd的肽或dnase 1蛋白。在其他实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以包括多于一类细胞贴附阻断分子的组合。
[0334]
在微流体装置的各种实施方案中，至少一个经条件化的表面被配置为被加热到至少约30℃的温度。至少一个经条件化的表面可以被配置为在至少约30℃的温度下稳定。
[0335]
在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置还可以包括微流体通道，该微流体通道包含液流区域的至少一部分。在一些实施方案中，至少一个生长腔室连接区域可以直接开口进入微流体通道。在一些实施方案中，微流体装置的至少一个生长腔室的分离区域可以具有足以支持细胞扩增至约100个细胞范围的尺寸。在一些实施方案中，至少一个生长腔室中可以保持不超过1
×
102个生物细胞。在一些实施方案中，至少一个生长腔室的体积可以小于或等于约2
×
106立方微米。在其他实施方案中，至少一个生长腔室中可以保持不超过1
×
102个生物细胞，且至少一个生长腔室的体积可以小于或等于约1
×
107立方微米。
[0336]
在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置还可以包括至少一个入口端口，其被配置为向液流区域中输入第一或第二流体培养基；和至少一个出口端口，其被配置为在第一培养基离开液流区域时接受该第一培养基。
[0337]
在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置还可以包括具有介电电泳(dep)配置的衬底，其被配置为向生长腔室中引入一个或多个生物细胞或者将一个或多个生物细胞移动离开生长腔室。dep配置可以是光致动的。
[0338]
在微流体装置的各种实施方案中，微流体装置还可以包括至少一个生长腔室或其分离区域上方的可变形盖子区域，从而压下可变形盖子区域施加足以将生物细胞从分离区域输出到液流区域中的力。在一些实施方案中，微流体装置可以包括盖子，其中盖子的至少一部分是透气性的，从而向位于微流体装置中的流体培养基提供气体分子的源。在一些实施方案中，盖子的透气性部分可以位于至少一个生长腔室的上方。在一些实施方案中，盖子的透气性部分可以位于液流区域的上方。在一些实施方案中，微流体装置还可以包括至少一个生长腔室或其分离区域上方的可变形盖子区域，从而压下可变形盖子区域施加足以将生物细胞从分离区域输出到液流区域中的力。
[0339]
在微流体装置的各种实施方案中，经条件化的表面可以包括可裂解部分。可裂解部分可以被配置为允许破坏经条件化的表面，从而促进培养后的一个或多个生物细胞的可移植性。
[0340]
在微流体装置的各种实施方案中，至少一个生长腔室可以包括多个生长腔室。
[0341]
在微流体装置的各种实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括多个生物细胞。在一些实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括一个或多个哺乳动物细胞。在一些实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括一个或多个杂交瘤细胞。在一些实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括一个或多个淋巴细胞或白细胞。在其他实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞，或其组合。在各种实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括一个或多个贴壁细胞。在一些实施方案中，生长腔室中的一个或多个生物细胞可以是单个细胞或者集落可以是生物细胞的克隆集落。
[0342]
ph传感器。系统还可以包括至少一个传感器，其连接至微流体装置600的至少一个入口端口124和/或至少一个出口端口124
′
，如图6所示。装置600可选地可以是装置100、
200、240、290、400或500a-e中的任一个。传感器可以被配置为在第一流体培养基进入微流体装置600时检测其ph。或者，传感器可以被配置为在第一流体培养基离开微流体装置600时检测其ph。传感器可以被并入到微流体装置中，或者其可以是能够被连接至微流体装置的入口端口124和/或出口端口124
′
或者与其串联的分离的组件。
[0343]
在一些实施方案中，ph传感器是光传感器。光传感器可以提供相对于基于电极的台式装置的优势，因为基于电极的装置可能包括大体积的探针，使得很难或者不可能测量少(μl)量流体的ph。类似地，串联的流过式溶液由于微电极的性质而可能具有非常长的稳定时间(5至15分钟)，并且可能在每次使用之前要求大量的校准操作。此外，电极可能快速劣化，因此要求更多的维护。
[0344]
光传感器可以是集成的无电极装置，其包括用于照明的led和用于可见颜色检测的集成的比色计传感器。比色计传感器可以是对颜色敏感的光电晶体管。比色计传感器可以在可见光波长范围(例如，约390nm至约700nm)内检测。被ph依赖性染料 (例如但不限于酚红)染色的培养基可以提供即时的和无接触的光信号。使用这种光传感器的光学无电极测量方法既不要求与培养基接触也不要求由使用者进行校准。可以校正光学测量以移除温度依赖性。此外，光传感器的使用使传感器结垢的风险最小化，从而减少了维护或替换。光源(led)和颜色传感器的小型化也使得其可以适用于测试非常少量的液体(《1μl)以及集成到便携式或手持式仪器中。系统可以包括由用于led和光电晶体管传感器的控制/监测装置180控制的驱动电子器件，并且如果ph 的检测确定ph在期望的范围之外，可以进一步提供由控制模块172控制的报警组件。此外，由于颜色检测的稳定时间很快(亚秒级)，所以有可能将该传感器插入到反馈回路中，以通过调整培养基周围的气体环境中的二氧化碳含量来调节培养基的ph。或者，控制模块172或控制/检测装置180可以进一步提供组件以调整进入的流体培养基的 ph，以通过添加缓冲剂和/或酸性或碱性培养基组分而将ph改正回期望的范围。
[0345]
在一些实施方案中，传感器610连接至邻近微流体装置的至少一个入口124的流体培养基入口管线606。管线606可以是透明的、基本透明的或半透明的。led 614照射管线606和管线606内的经染色的流体培养基202a
′
。集成的比色计传感器612可以监测进入的流体培养基的ph；确定对于特定的培养实验，ph的值在期望的范围内；并且如果ph在期望的范围之外就报警。
[0346]
在一些实施方案中，传感器610
′
连接至邻近微流体装置的至少一个出口124
′
的流体培养基出口管线608。管线608可以是透明的、基本透明的或半透明的。led 614
′
照射管线608和管线606内的经染色的外流的流体培养基202a
″
。集成的比色计传感器612
′
可以监测进入的流体培养基的ph；确定对于特定的培养实验，ph的值在期望的范围内；并且如果ph在期望的范围之外就报警。
[0347]
细胞。能够用于本发明的系统和方法中的细胞可以是任何类型的细胞。例如，细胞可以是胚胎、卵母细胞或精子、干细胞、祖细胞或从组织分离的细胞、血细胞、杂交瘤、经培养的细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、被感染的细胞、转染的和/或转化的细胞 (细胞系(包括但不限于中国仓鼠卵巢(cho)细胞)、报告细胞，等等。细胞可以是哺乳动物细胞，或者细胞可以是非哺乳动物细胞。细胞可以包括被寄生物种(例如，利什曼虫(leishmania)或恶性疟原虫(plasmodium falciparum))感染的细菌、真菌、原生动物或哺乳动物细胞。在一些
实施方案中，哺乳动物细胞可以是人、鼠、猪或者任何其他受关注的哺乳动物。
[0348]
在一些实施方案中，细胞可以来自在培养物中活跃生长的细胞群或者得自新鲜的组织样品(例如，通过分离固体组织样品，例如活组织检查或细针穿刺)、血液、唾液、尿液或其他体液。或者，一个或多个生物细胞可以来自先前冷冻的其他样品的培养物。
[0349]
在一些实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括一种或多种杂交瘤细胞。在其他实施方案中，一个或多个生物细胞可以包括一种或多种淋巴细胞或白细胞。在一些实施方案中，细胞是b细胞、t细胞、nk细胞、树突细胞、巨噬细胞或其他免疫细胞类型，或其前体，例如祖细胞或造血干细胞。
[0350]
在各种实施方案中，一个或多个生物细胞是一个人或多个贴壁细胞。当一个或多个贴壁细胞被引入到微流体装置中时，可以提供另外的条件化处理以便为贴壁细胞提供允许持续的活力和/或细胞增殖的适当的可溶性或非可溶性环境因子(例如，一个或多个细胞外基质组分)。
[0351]
取决于实验的特定目标，可以将仅一个细胞或多个细胞引入到微流体装置中用于培养或/或克隆。当将仅一个细胞引入到系统的生长腔室中并根据本文所述的方法进行孵育时，所得到的扩增的群是初始引入到生长腔室中的细胞的克隆集落。
[0352]
方法。提供了一种用于在系统中培养至少一个生物细胞的方法，该系统包括具有至少一个生长腔室和液流区域的微流体装置。在也具有液流区域的微流体装置的生长腔室中培养一个(或多个细胞)可以允许以所选的时间段特异性地引入营养物、生长因子或其他细胞信号传导物质，以达到对细胞生长、活力或可移植性参数的控制。将至少一个生物细胞引入到具有至少一个经条件化的表面的至少一个生长腔室中，其中经条件化的表面支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。在一些实施方案中，经条件化的表面支持微流体装置内的细胞可移植性。在一些实施方案中，可移植性包括防止细胞贴附至微流体装置。在其他实施方案中，可移植性包括向贴壁细胞提供经条件化的表面，该经条件化的表面会支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合，同时还允许细胞在微流体装置内培养一段时间后被移动。至少一个经条件化的表面可以是本文所述的任何经条件化的表面。可以使用本文所述的多种不同的动力来实现至少一个生物细胞的引入，其中一些动力可以允许精确地控制将特定的生物细胞置于微流体装置上的特定位置，例如，置于预先选择的生长腔室中。由本文所述的方法可以实现的细胞放置/移除以及营养物/信号传导/环境刺激的精确控制是用大规模培养或其他微流体培养方法很难或不可能实现的。
[0353]
在放置后，随后将至少一个生物细胞孵育至少足够长的一段时间，以扩增至少一个生物细胞，从而产生生物细胞的集落。当将生物细胞进入到分离的生长腔室中时，所得到的扩增的集落可以被精确地识别，以进一步用作可分离的生物细胞的群。当将仅一个生物细胞引入到生长腔室并允许其扩增时，所得到的集落是生物细胞的克隆群。任何适当的细胞均可以用于该方法中，包括但不限于如上文所述的细胞。
[0354]
微流体装置可以是本文所述的微流体装置100、300、400、500a-e或600中的任一个，且微流体装置可以是具有本文所述的任一组件的系统的一部分。至少一个生长腔室可以包括多个生长腔室，且可以使用本文所述的任何适当数目的生长腔室。在该方法的一些实施方案中，微流体装置可以具有约500至约1500个生长腔室、约1000 至约2000个生长腔室、约1000至约3500个生长腔室、约2000至约5000个生长腔室、约3000至约7000个生长腔
室、约5000至约10000个生长腔室、约7500至约 15000个生长腔室、约10000至约17500个生长腔室或约12500至约20000个生长腔室。
[0355]
在培养一个或多个生物细胞的方法中，至少一个经条件化的表面可以是本文所述的任何经条件化的表面。经条件化的表面可以共价连接至微流体装置。在一些实施方案中，经条件化的表面可以包括共价连接至表面的连接基团，且连接基团还可以连接至被配置为在微流体装置内支持一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在一些实施方案中，可以在输入一个或多个生物细胞之前提供具有经条件化的表面的微流体装置。
[0356]
引入至少一个生物细胞。在一些实施方案中，向至少一个生长腔室中引入至少一个生物细胞可以包括使用介电电泳(dep)力，其强度足以移动至少一个生物细胞。可以使用电子镊子，例如光电镊子(oet)来产生dep力。在一些其他实施方案中，向至少一个生长腔室中引入一个或多个生物细胞可以包括使用流体流动和/或重力(例如，通过倾斜微流体装置，使得细胞滴入位于细胞下方的生长腔室中)。
[0357]
在一些实施方案中，经过进入微流体装置的液流区域(例如，液流通道)的入口端口124将至少一个生物细胞引入到微流体装置中。培养基在液流通道中的流可以将细胞携带至邻近朝向生长腔室的开口的位置。在位于邻近朝向生长腔室的开口处之后，可以随后使用本文所述的任何动力将生物细胞移动进入生长腔室，包括介电电泳或重力。介电电泳力可以包括电致动或光致动力，且dep力还可以由光电镊子(oet)提供。至少一个生物细胞可以经过液流通道被移动至至少一个生长腔室的连接区域的近端开口，其中连接区域向液流通道/区域直接开口并与其为流体性连接。至少一个生长腔室的连接区域还与至少一个生长腔室的分离区域为流体性连接。至少一个生物细胞可以进一步被移动经过连接区域并进入至少一个生长腔室的分离区域。至少一个生长腔室的分离区域可以具有足以支持细胞扩增的尺寸。然而，通常生长腔室的尺寸将这样的扩增会限制为培养物中不超过约1
×
103、5
×
102、4
×
102、3
×
102、2
×
102、1
×
102、50、25、15个或甚至少至10个细胞。在一些实施方案中，分离区域的尺寸可以为足以支持细胞扩增至培养物中不超过约1
×
102、50、25、15或10个细胞。已惊讶地发现，细胞孵育和/或扩增至约1
×
102细胞可以成功地在体积为不超过约1.0
×
107立方微米、 6
×
106立方微米、2
×
106立方微米、1.5
×
106立方微米或1.0
×
106立方微米的分离区域中进行。在一些其他实施方案中，细胞孵育和/或扩展至约1
×
102细胞可以成功地在体积为不超过约4
×
105立方微米的分离区域中进行。取决于细胞类型，生物细胞的大小可以有很大变化，从直径为约1微米且体积为约1立方微米的细菌、直径为约7-8微米且体积为约100立方微米的小的人细胞(例如红血细胞)、直径为约40微米(非汇合的)且体积为约2000立方微米的永生细胞系(例如hela)、直径为约25微米高至约60微米且体积为约4700立方微米至约100,000立方微米的巨核细胞或直径为约120 微米且体积为约900,000立方微米的人卵母细胞。因此，体积为约4
×
105立方微米的生长腔室可以允许将非常少的较大变化的巨核细胞(体积为约1
×
105立方微米)扩增至高达少于总共5个细胞。或者，相同的小生长腔室(体积为约4
×
105立方微米)可以允许将细菌细胞(体积为约1立方微米)扩增至高达约400,000个细菌细胞。
[0358]
该方法还可以包括将第一流体培养基引入到微流体装置的液流区域的微流体通道中。在一些实施方案中，第一流体培养基的引入是在引入至少一个生物细胞之前进行的。
当在引入至少一个生物细胞之前引入第一流体培养基时，可以选择流速，使得第一流体培养基以例如任何适当的流速从微流体装置的液流通道流入生长腔室。或者，如果微流体装置中已经装填有含有过量的一种或多种条件化试剂的培养基，则第一流体培养基以这样的流速流入微流体通道中：该流速使得第一流体培养基替换液流区域中任何剩余的含有过量的条件化试剂的培养基。
[0359]
当在将至少一个生物细胞引入到生长腔室中之后引入第一流体培养基的流时，第一流体培养基的流速可以被选择为不扫过分离区域，其不会从分离区域中置换至少一个生物细胞。围绕至少一个生长腔室的分离区域中的至少一个生物细胞的流体培养基是第二流体培养基，其可以与第一流体培养基相同或不同。在一些实施方案中，第二流体培养基可以与第一流体培养基相同，但在孵育步骤中，细胞废产物和耗尽的培养基组分可能使得第二流体培养基不同于第一流体培养基。
[0360]
孵育细胞。在本文所述的方法中，将至少一个生物细胞孵育至少足够长的一段时间，以扩增细胞以产生生物细胞的集落。该段时间可以被选择为约1天至约10天。在其他实施方案中，孵育期间可以被延长超过10天，且可以持续任何期望的时间段。由于生长腔室的分离区域中的细胞被提供有营养物，且通过流体培养基的灌注而移除废物，所以细胞可以无限生长。随着分离区域被扩增的细胞群充满，任何额外的扩增会导致扩增的生物细胞占据生长腔室的连接区域(其是生长腔室的扫过区域)。灌注的培养基可能将扩增的生物细胞扫出生长腔室的连接区域并随后扫出微流体装置。因此，取决于生物细胞的大小和生长腔室的分离区域的大小，生长腔室的分离区域中存在的细胞的数目可以被稳定在最大的数目。在细胞群中使细胞的最大数目稳定化的能力提供了相对于其他目前可得的细胞培养方法的优势，因为可以消除冗长的细胞群分瓶(split)。
[0361]
在一些实施方案中，孵育可以进行约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更长。孵育期间可以为约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3 天或约1天至约2天的范围。在其他实施方案中，孵育可以进行小于约5天、小于约4 天、小于约3天或小于约2天。在一些实施方案中，孵育可以进行小于约3天或小于约2天。在其他实施方案中，孵育可以进行约3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10 h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h或约23 h。
[0362]
在培养步骤期间，可以在整个培养步骤中的一个或多个时间点监控至少一个生长腔室和其中所含的任何细胞的图像。图像可以被存储在系统的处理组件的存储器中。
[0363]
灌注细胞。在孵育步骤期间，存在于生长腔室的分离区域内的第二流体培养基可以变得被耗尽营养物、生长因子或其他生长刺激物。第二流体培养基可能积累细胞废物产物。此外，随着至少一个生物细胞在孵育期间内继续生长，可能期望改变营养物、生长因子或其他生长刺激物，使其不同于孵育开始时第一或第二培养基的营养物、生长因子或其他生长刺激物。在如本文所述的微流体装置的生长腔室中的培养可以获得特异性的和选择性的能力，以引入和改变由至少一个生物细胞觉察到的化学梯度，其可以更紧密得多地接近体内条件。或者，将由至少一个生物细胞觉察到的化学梯度改变到目的性地非优化的一组条件，可以允许细胞在设计的条件下扩增，以研究疾病或治疗途径。因此，该方法可以包括在孵育步骤期间灌注第一流体培养基，其中经由微流体装置的至少一个入口124引入第一流体培养基，并且其中经由微流体装置的至少一个出口输出任选地含有来自第二流体培养
基的组分的第一流体培养基。
[0364]
第一流体培养基的组分的交换(从而提供新鲜的营养物、可溶性生长因子等等)和 /或围绕分离区域内的细胞的培养基的废物组分的交换基本上在扩散条件下发生在生长腔室的扫过和非扫过区域的界面处。已惊讶地发现，在基本上无流动的条件下获得有效的交换。因此，已惊讶地发现，成功的孵育不要求恒定的灌注。结果是，灌注可以是非连续的。在一些实施方案中，灌注是周期性的，并且在一些实施方案中，灌注是无规律的。灌注期间之间的中断可以是足够的持续时间，以允许分离区域中第二流体培养基的组分扩散进入液流通道/区域中的第一流体培养基中，和/或第一流体培养基的组分扩散进入第二流体培养基，均没有第一培养基显著流入分离区域。
[0365]
在另一个实施方案中，也可以采用低灌注速率以获得生长腔室的非扫过区域内外的流体培养基的组分的有效交换。
[0366]
因此，在微流体装置的至少一个生长腔室中灌注至少一个生物细胞的一个方法示于图7中，且包括灌注步骤7002，其中以第一灌注速率r1持续第一灌注时间d1使第一流体培养基经过微流体装置的液流区域流入与生长腔室为流体性连接的液流区域中。 r1可以被选择为如本文所述的非扫过流速。方法700还包括步骤7004，其中停止流体培养基的流动，持续第一灌注停止时间s1。步骤7002和7004重复w次，其中w可以是选自1至约1000的整数，此后灌注过程700完成。在一些实施方案中，w可以是 2至约1000的整数。
[0367]
在微流体装置的至少一个生长腔室中灌注至少一个生物细胞的另一个方法800示于图8中，其包括第一灌注循环，其包括步骤8002，其中以第一灌注速率r1持续第一灌注时间d1使流体培养基经过微流体装置的液流区域流入与生长腔室为流体性连接的液流区域中。r1可以被选择为如本文所述的非扫过流速。第一灌注循环包括步骤8004，其中停止流体培养基的流动，持续第一灌注停止时间s1。第一灌注循环可以重复w次，其中w是选自1至约1000的整数。在第一灌注循环的第w次重复完成之后，方法800 还包括第二灌注循环，其包括步骤8006，其中以第二灌注速率r2持续第二灌注时间d2使第一流体培养基流动，其中r2被选择为流的非扫过流速。方法800的第二灌注循环还包括步骤8008，其中停止流体培养基的流动，持续第二灌注停止时间s2。此后，方法返回至第一灌注循环的步骤8002和8004，并且组合的两个循环灌注过程重复v次，其中v是1至约5000的整数。可以选择w和v的组合以满足期望的孵育期间端点。
[0368]
在方法700或800的各种实施方案中，灌注速率r1可以是如上文对于流控制器配置所述的流体培养基的任何非扫过流速。在一些实施方案中，r1可以是约0.009、0.010、 0.020、0.030、0.040、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、 0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10、1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、2.00.2.10、2.20、2.40、2.50、 2.60、2.70、2.80、2.90或3.00μl/sec。
[0369]
在方法800的各种实施方案中，第二灌注速率r2可以是如上文对于流控制器配置所述的流体培养基的任何非扫过流速。在一些实施方案中，r2可以是0.009、0.010、 0.020、0.030、0.040、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、 1.10、1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、2.00、2.10、2.20、2.40、2.50、 2.60、2.70、2.80、2.90或3.00μ
l/sec。可以以任何组合来选择流速r1和/或r2。通常，灌注速率r2可以大于灌注速率r1，且可以是r1的约5x、10x、20x、30x、40x、50x、 60x、70x、80x、90x、100x或更高。在一些实施方案中，r2至少比r1快十倍。在其他实施方案中，r2至少比r1快二十倍。在另一个实施方案中，r2至少为r1的速率的100x。
[0370]
在方法700或800的各种实施方案，第一灌注时间d1可以是如上文对流控制器配置所述的任何适当的灌注持续时间。在各种实施方案中，d1可以是约5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140、150、 160、170或180秒。在其他实施方案中，d1可以是时间的范围，例如约10至约40秒，如上文所述。在一些实施方案中，d1可以是约30秒至约75秒。在其他实施方案中， d1可以是约100秒。在其他实施方案中，d1可以是约60秒至约150秒的范围。在其他实施方案中，d1可以是约20min、30min、40min、50min、60min、80min、90min、 110min、120min、140min、160min、180min、200min、220min、240min、250min、 260min、270min、290min或300min。在一些实施方案中，d1为约40min至约180 min。
[0371]
在方法700或800的各种实施方案中，第二灌注时间d2可以是如上文对流控制器配置所述的任何适当的灌注持续时间。在各种实施方案中，d2可以是约5秒、10秒、 15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、60秒、65秒、70 秒、80秒、90秒或约100秒。在其他实施方案中，d2可以是时间的范围，例如约5秒至约20秒，如上文所述。在其他实施方案中，d2可以是约30秒至约70秒。在其他实施方案中，d2可以是约60秒。
[0372]
在方法700或800的各种实施方案中，第一灌注时间d1可以与第二灌注时间d2相同或不同。可以以任何组合来选择d1和d2。在一些实施方案中，灌注持续时间d1和/或d2可以被选择为短于停止期间s1和/或s2。
[0373]
在方法700或800的各种实施方案中，第一灌注停止时间s1可以被选择为如上文对于流控制器配置的灌注时间段之间的间隔时间所述的任何适当的时间段。在一些实施方案中，s1可以是约0min、5min、约10min、约15min、约20min、约25min、约30min、约35min、约40min、约45min、约60min、约65min、约80min、约90 min、约100min、约120min、约150min、约180min、约210min、约240min、约270min或约300min。在各种实施方案中，s1可以是如上文对于流控制器配置所述的灌注之间的间隔的任何适当的时间范围，例如约20至约60min。在一些实施方案中， s1可以是约10min至约30min。在其他实施方案中，s1可以是约15min。在其他实施方案中，s1可以是约0秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、 80秒或约90秒。在一些实施方案中，s1是约0秒。
[0374]
在方法700或800的各种实施方案中，第二灌注停止时间s2可以被选择为如上文对于流控制器配置的灌注时间段之间的间隔时间所述的任何适当的时间段。在一些实施方案中，s2可以是约0min、5min、约6min、约7min、约8min、约9min、约10 min、约20min、约30min、约45min、约50min、约60、约90min、约120min、约 180min、约240min、约270min或约300min。在各种实施方案中，s2可以是如上文对于流控制器配置所述的灌注之间的间隔的任何适当的时间范围，例如约15至约45 min。在一些实施方案中，s2可以是约10min至约30min。在其他实施方案中，s2可以是约8min或9min。在其他实施方案中，s2是约0min。
[0375]
在方法700或800的各种实施方案中，可以从任何适当的值中独立地选择第一灌注停止时间s1和第二灌注停止时间s2。s1可以与s2相同或不同。
[0376]
在方法800或900的各种实施方案中，w次重复的数目可以被选择为与v次重复的数
目相同或不同。
[0377]
在方法700或800的各种实施方案中，w可以是约1、约4、约5、约6、约8、约 10、约12、约15、约18、约20、约24、约30、约36、约40、约45或约50。在一些实施方案中，w可以被选择为约1至约20。在一些实施方案中，w可以是1。
[0378]
在方法800的各种实施方案中，v可以是约5、约10、约20、约25、约30、约 35、约40、约50、约60、约80、约100、约120、约240、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约750、约900或约1000。在一些实施方案中，v可以被选择为约10至约120。在其他实施方案中，v可以是约5至约24。在一些实施方案中， v可以是约30至约50或者可以是约400至约500。
[0379]
在方法800的各种实施方案中，w次重复的数目可以被选择为与v次重复的数目相同或不同。
[0380]
在方法700或800的各种实施方案中，第一灌注步骤(由步骤7002/7004或 8002/8004表示)的总时间为约1h至约10h，且w是为1的整数。在各种实施方案中，第一灌注步骤的总时间为约9min至约15min。
[0381]
在方法800的各种实施方案中，第二灌注循环步骤(由步骤8006/8008表示)的总时间为约1min至约15min或约1min至约20min。
[0382]
在任一方法700或800中，灌注方法可以在生物细胞的整个孵育期间持续，例如持续约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10天或更长。
[0383]
在图8的方法800的另一个非限制性实施方案中，控制器可以被配置为在灌注步骤8002期间以更长的灌注期间d1在液流区域中灌注流体培养基。控制器可以以第一速率灌注流体培养基约45min、约60min、约75min、约90min、约105min、约120 min、约2.25h、约2.5h、约2.45h、约3.0h、约3.25h、约3.5h、约3.75h、约4.0 h、约4.25h、约4.5h、约4.75h、约5h或约6h。在第一灌注期间d1末尾，可以停止流体培养基的流，停止时间段为s1，其可以是约0秒、15秒、30秒、约45秒、约 1min、约1.25min、约1.5min、约2.0min、约3.0min、约4min、约5min或约6min。在一些实施方案中，第一流速r1可以被选择为约0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、 0.2、0.3、0.4或约0.5μl/sec。流体培养基的流可以被停止，灌注停止期间s1为小于约1分钟，或者s1可以是0秒。或者，s1可以是约30秒、约1.5min、约2.0min、约 2.5min或约3min。随后可以是第二灌注期间d2，其使用不同的灌注速率。在一些实施方案中，第二灌注速率可以高于第一灌注速率。在一些实施方案中，第二灌注速率r2可以选自约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、 3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、6.0、7.0、8.0或约9.0μl/sec。第二灌注期间d2可以为约1秒、约2秒、约3秒、约4秒、约5秒、约6秒、约10秒、约15 秒、约30秒、约45秒、约60秒、约65秒、约75秒、约80秒或约90秒。然后可以以第二灌注停止期间s2停止灌注，该第二灌注停止期间s2可以是约0秒、10秒、约 20秒、约30秒、约40秒、约50秒、约60秒、约1.5min、约1.75min、约2.0min、约2.5min、约2.75min、约3.0min或约4.0min。在一些实施方案中，d1可以是约2 h、约3h或约4h。在各种实施方案中，d1可以是约4h。在各种实施方案中，s1可以是0秒或小于约一分钟。第二灌注期间d2可以是约1秒至约6秒。在一些实施方案中，第二灌注停止期间s2可以是约40秒至约1.5min。
[0384]
因此，提供了用于在微流体装置的至少一个生长腔室中灌注至少一个生物细胞的方法，其包括以下步骤：使用第一灌注步骤灌注至少一个生物细胞，该第一灌注步骤包括：
可以发生在例如引入溶解的气体分子之前和/或期间。这种调节可以通过添加缓冲物质来实现。适当的缓冲物质的一个非限制性实例是hepes。其他缓冲物质可以存在于培养基中，并且可以取决于与不取决于二氧化碳的存在(例如碳酸缓冲体系)，且可以由本领域技术人员来选择。细胞生长所必需的盐、蛋白质、碳水化合物、脂类、维生素和其他小分子也可以形成第一流体培养基组合物的一部分。
[0389]
在一些实施方案中，在经由入口端口引入之前，用气体组分使第一流体培养基饱和可以在储液器中进行。在其他实施方案中，用气体组分使第一流体培养基饱和可以在储液器和入口之间的透气性连接管路中进行。在其他实施方案中，用气体组分使第一流体培养基饱和可以通过微流体装置的盖子的透气性部分来进行。在一些实施方案中，流体培养基的气体饱和还包括保持气体交换环境中的湿度，使得微流体装置内的流体培养基在孵育期间不改变其渗透压。
[0390]
第一流体培养基的组成还可以包括至少一种由饲养细胞培养物分泌的组分。分泌的饲养细胞组分可以包括生长因子、激素、细胞因子、小分子、蛋白多糖，等等。引入至少一种由饲养细胞培养物分泌的组分可以在进行用气体组分使第一流体培养基饱和的同一个储液器中进行，或者向第一流体培养基引入至少一种由饲养细胞培养物分泌的组分可以在饱和步骤之前进行。
[0391]
在一些其他实施方案中，第一培养基的组成还可以包括添加物，所述添加物被设计为提供改变的流体培养基，以测试细胞对添加物的响应。所述添加物可以例如增加或降低细胞活力或生长。
[0392]
在一些实施方案中，该方法可以包括在经由至少一个入口引入第一流体培养基时检测其ph。检测ph可以在直接接近入口的位置处进行。在一些实施方案中，该方法可以包括在第一流体培养基经由出口输出时检测该第一流体培养基的ph。检测ph可以在直接接近出口的位置处进行。用于检测ph的任一个或两个检测器可以是光传感器。在一些实施方案中，如果ph偏离可接受的范围，则检测器可以能够提供报警。在一些其他实施方案中，当检测器所测量的ph值偏离可接受的范围时，可以改变第一流体培养基的组成。
[0393]
在孵育步骤期间，可以监测至少一个生长腔室及其中所含的任何细胞的图像。
[0394]
输出至少一种生物细胞。在孵育步骤完成之后，可以将至少一个生物细胞或细胞集落从生长腔室或其分离区域输出。输出可以包括使用足够强的介电电泳(dep)力，以移动一个或多个生物细胞/细胞的集落。dep力可以是光致动的或电致动的。例如，微流体装置可以包括具有dep配置的衬底，例如光电镊子(oet)配置。在其他实施方案中，可以使用流体流和/或重力将至少一个生物细胞或细胞的集落从生长腔室或分离区域中输出。在其他实施方案中，可以在生长腔室或其分离区域上方的可变形盖子区域上使用压力而将至少一个生物细胞或细胞的集落从生长腔室或分离区域中输出，从而造成离开生长腔室或分离区域的流体的局部化的流。
[0395]
在将至少一个生物细胞或细胞的集落从生长腔室或分离区域中输出之后，随后可以将细胞从液流区域(例如，通道)输出离开微流体装置。在一些实施方案中，从液流区域输出细胞包括使用足够强的dep力，以移动一个或多个生物细胞/细胞的集落。可以如上文所述地产生dep力。在一些其他实施方案中，从液流区域输出细胞离开微流体装置包括使用流体流和/或重力以移动细胞。
[0396]
在输出步骤期间，可以监测至少一个生长腔室和其中所含的任何细胞的图像。
[0397]
条件化至少一个表面。在一些实施方案中，提供微流体装置，其具有处于经条件化的状态的至少一个生长腔室的至少一个表面。在其他实施方案中，至少一个生长腔室的表面在引入至少一个生物细胞之前被条件化，且可以作为培养一个或多个生物细胞的方法的一部分来进行。条件化该表面可以包括采用条件化试剂例如聚合物来处理表面。
[0398]
在一些实施方案中，提供了一种用于处理微流体装置(100、300、400、500a-e和 600)的至少一个生长腔室的至少一个表面的方法，包括以下步骤：使包括过量的条件化试剂的流体培养基流入液流通道(图1、2a-2f、3a-3b、4a-4c)；将微流体装置孵育所选的时间段；以及置换通道中的培养基。在其他实施方案中，用于装填微流体装置的方法包括以下步骤：使含有条件化试剂的装填溶液流入液流通道；将该装置孵育所选的时间段，从而条件化生长腔室的至少一个表面；以及用流体培养基置换通道中的溶液。装填溶液可以含有任何如本文所述的流体培养基。置换条件化溶液的流体培养基或具有过量的条件化试剂的流体培养基可以是本文所述的任何培养基并且可以另外含有细胞。
[0399]
在一些实施方案中，可以用包括亚烷基醚部分的聚合物条件化试剂来处理至少一个表面。具有亚烷基醚部分的聚合物条件化试剂可以包括任何适当的含亚烷基醚的聚合物，包括但不限于任何上文所述的含亚烷基醚的聚合物。在一个实施方案中，可以用两亲性非离子嵌段共聚物来处理生长腔室的表面，该共聚物在聚合物链内以不同的比例和位置包括聚乙烯氧化物(peo)和聚丙烯氧化物(ppo)子单元的嵌段(例如，聚合物)。可用于获得经条件化的表面的具体聚合物包括 l44、l64、p85、f68和f127(包括f127nf)。
[0400]
在其他实施方案中，可以用包括羧酸部分的聚合物条件化试剂来处理表面。上文讨论了适当的含羧酸的聚合物条件化试剂的非限制性实例，并且任何适当的含羧酸的聚合物条件化试剂均可以用于处理表面。
[0401]
在其他实施方案中，可以用含糖部分的聚合物条件化试剂来处理表面。上文讨论了适当的含糖的聚合物条件化试剂的非限制性实例，并且任何适当的含糖的聚合物条件化试剂均可以用于处理表面。
[0402]
在其他实施方案中，可以用含磺酸部分的聚合物条件化试剂来处理表面。上文讨论了适当的含磺酸的聚合物条件化试剂的非限制性实例，并且任何适当的含磺酸的聚合物条件化试剂均可以用于处理表面。
[0403]
在其他实施方案中，可以用含氨基酸部分的聚合物条件化试剂来处理表面。上文讨论了适当的含氨基酸的聚合物条件化试剂的非限制性实例，并且任何适当的含氨基酸的聚合物条件化试剂均可以用于处理表面。含氨基酸的聚合物条件化试剂可以包括蛋白质。在一些实施方案中，用蛋白质来处理表面，其中蛋白质可以包括哺乳动物血清中存在的或者是其一部分的组分。在其他实施方案中，用哺乳动物血清的组分来处理表面。在一些实施方案中，可以用细胞培养基补充物来处理表面，例如补充物 ((50x)，无血清的，得自thermofisher scientific，目录号17504044)。哺乳动物血清可以是胎牛血清(fbs)。或者，哺乳动物血清可以是胎牛血清(fcs)。
[0404]
在其他实施方案中，可以用含核酸部分的聚合物条件化试剂来处理表面。上文讨论了适当的含核酸的聚合物条件化试剂的非限制性实例，并且任何适当的含核酸的聚合物
条件化试剂均可以用于处理表面。
[0405]
在一些实施方案中，可以使用超过一种聚合物条件化试剂的混合物来处理生长腔室的表面。
[0406]
在一些其他实施方案中，条件化步骤可以包括用至少一种细胞贴附阻断分子来处理至少一个生长腔室的至少一个表面。在一些实施方案中，用至少一种细胞贴附阻断分子处理至少一个生长腔室的至少一个表面的步骤可以在从微流体装置中输出细胞之前进行。在一些实施方案中，条件化步骤可以包括用至少一种细胞贴附阻断分子预孵育细胞。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以作用来破坏激动蛋白丝形成。在一些实施方案中，细胞贴附阻断分子可以是细胞松弛素b。在其他实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以阻断整合素受体。在一些实施方案中，细胞贴附阻断分子可以包括含有rgd基序的肽。在一些其他实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以减少细胞与dna污染的表面的结合。可以减少细胞与dna污染的表面的结合的细胞贴附阻断分子可以包括dnase 1蛋白质。在其他实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以包括小分子纤连蛋白抑制剂。在其他实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以是抗体，例如抗b1整合素抗体。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以包括超过一类细胞贴附阻断分子的组合。
[0407]
在其他实施方案中，条件化包括将生长腔室的表面加热至约30℃的温度。在一些实施方案中，该方法包括将表面加热到至少约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、 31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或约40℃的温度。在一些实施方案中，该方法包括将表面加热到高于约25℃的温度。在其他实施方案中，该方法包括将表面加热到约30
°
至40℃；约35℃至约40℃；或约36℃至约38℃范围内的温度。在一些实施方案中，该方法包括将表面加热到至少约30℃的温度。在一些实施方案中，加热表面包括至少一个通过用聚合物处理而被条件化的表面。
[0408]
克隆群。本文所述的方法还包括其中仅将一个生物细胞引入到至少一个生长腔室中的方法。提供了用于在系统中克隆生物细胞的方法，该系统包括微流体装置，该微流体装置具有液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其包括分离区域和连接区域，分离区域与连接区域为流体性连接，且连接区域包括到液流区域的近端开口，该方法包括以下步骤：将生物细胞引入到至少一个生长腔室中，其中该至少一个生长腔室被配置为具有至少一个经条件化的表面，以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合；以及孵育生物细胞至少足够长的时间段，以扩增生物细胞以产生生物细胞的克隆群。在一些实施方案中，体系可以是本文所述的任何体系。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置。
[0409]
在用于克隆生物细胞的方法的一些实施方案中，至少一个经条件化的表面可以包括共价连接至表面的连接基团，且连接基团可以连接至被配置为在微流体装置内支持一个或多个生物细胞的细胞生长、活力或可移植性的部分。在一些实施方案中，连接基团可以包括硅氧基连接基团。在其他实施方案中，连接基团可以包括膦酸酯连接基团。在一些实施方案中，连接基团可以间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。在其他实施方案中，连接基团可以直接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接基团可以经由与连接部分的连接而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力或可移动性的部分。在一些实施方案中，连接基团可以经由与连接部分的第一
末端的连接而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力或可移动性的部分。在一些实施方案中，连接部分还可以包括线性部分，其中线性部分的骨架包含1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合的非氢原子。在一些实施方案中，线性部分的骨架可以包括一个或多个亚芳基部分。在其他实施方案中，连接部分可以包括亚三唑基部分。在一些实施方案中，亚三唑基部分可以中断连接部分的线性部分或者可以在第二末端连接至连接部分的线性部分。在各种实施方案中，被配置为支持细胞生长和/或活力和/或可移植性的部分可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。在一些实施方案中，至少一个经条件化的表面包含烷基或全氟代烷基部分。在其他实施方案中，至少一个经条件化的表面包含亚烷基醚部分或葡聚糖部分。
[0410]
在各种实施方案中，该方法还可以包括条件化至少一个生长腔室的至少一个表面的步骤。在一些实施方案中，条件化包括用在微流体装置内支持细胞可移植性的一种或多种试剂处理至少一个表面。在一些实施方案中，条件化可以包括用包括聚合物的条件化试剂处理至少一个生长腔室的至少一个表面。在一些实施方案中，聚合物可以包括亚烷基醚部分。在一些实施方案中，聚合物可以包括羧酸部分。在一些实施方案中，聚合物可以包括糖部分。在其他实施方案中，聚合物可以包括磺酸部分。在其他实施方案中，聚合物可以包括氨基酸部分。在其他实施方案中，聚合物可以包括核酸部分。在一些实施方案中，条件化可以包括用哺乳动物血清的一种或多种组分处理至少一个生长腔室的至少一个表面。在一些实施方案中，哺乳动物血清可以是胎牛血清(fbs) 或胎牛血清(fcs)。在各种实施方案中，条件化可以包括用至少一种细胞贴附阻断分子处理至少一个生长腔室的至少一个表面。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以包括含rgd的肽。在其他实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以是细胞松弛素b、抗整合素的抗体、纤连蛋白抑制剂或dnase 1蛋白质。在各种实施方案中，条件化可以包括用超过一类细胞贴附阻断分子的组合处理至少一个生长腔室的至少一个表面。
[0411]
在各种实施方案中，条件化可以包括将至少一个生长腔室的至少一个表面加热到约30℃的温度。
[0412]
在各种实施方案中，该方法还可以包括将第一流体培养基引入到微流体装置的液流区域的微流体通道中的步骤。在一些实施方案中，引入第一流体培养基可以在引入生物细胞之前进行。在一些实施方案中，将生物细胞引入到至少一个生长腔室中可以包括使用介电电泳(dep)力，其具有足以移动生物细胞的强度。在一些实施方案中， dep力可以是光致动的。在一些实施方案中，dep力可以通过光电镊子(oet)产生。在一些其他实施方案中，将生物细胞引入到至少一个生长腔室中可以包括使用流体流和/或重力。
[0413]
在一些实施方案中，将生物细胞引入到至少一个生长腔室中还可以包括将生物细胞引入到至少一个生长腔室的分离区域中。在一些实施方案中，至少一个生长腔室的分离
区域的尺寸可以足以支持细胞扩增至不超过1
×
102个细胞。在一些实施方案中，分离区域可以至少基本上填充有第二流体培养基。在一些实施方案中，液流区域可以流体性连接到至少一个生长腔室的连接区域的近端开口，并且进一步地，其中连接区域还可以流体性连接至生长腔室的分离区域。
[0414]
在各种实施方案中，该方法还可以包括在孵育步骤期间灌注第一流体培养基的步骤，其中第一流体培养基可以经由微流体装置的至少一个入口端口引入，并且其中任选地包含来自第二流体培养基的组分的第一流体培养基可以经由微流体装置的至少一个出口输出。在一些实施方案中，灌注可以是非连续的。在一些其他实施方案中，灌注可以是周期性的。在其他实施方案中，灌注可以是无规则的。在一些实施方案中，进行第一流体培养基的灌注的速率可以为足以允许分离区域中的第二流体培养基的组分扩散进入液流区域中的第一流体培养基和/或第一流体培养基的组分扩散进入分离区域中的第二流体培养基；并且第一培养基可以基本上不流入分离区域。在一些实施方案中，灌注第一流体培养基进行的持续时间可以是约45秒至约90秒、约每10min至约每30 min。在一些实施方案中，灌注第一流体培养基进行的持续时间可以是约2h至约4h。在一些实施方案中，孵育至少一个生物细胞的时间段可以是约1天至约10天。
[0415]
在一些实施方案中，第一流体培养基的组成可以包括液体和气体组分。在各种实施方案中，该方法还可以包括在将第一流体培养基引入到微流体装置中之前用溶解的气体分子使第一流体培养基饱和的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括使微流体装置与能够使第一流体培养基或第二流体培养基被溶解的气体分子饱和的气体环境接触的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括在引入溶解的气体分子后调节第一流体培养基的ph的步骤。在一些实施方案中，使第一流体培养基被气体组分饱和可以经由入口端口引入之前在储液器中进行、在储液器和入口端口之间的透气性连接器中进行或者经由微流体装置的盖子的透气性部分进行。在一些实施方案中，第一流体培养基的组成可以包括至少一种由饲养细胞培养物分泌的组分。
[0416]
在各种实施方案中，该方法还可以包括在经由至少一个出口输出第一流体培养基时检测其ph的步骤。在一些实施方案中，检测步骤可以在直接接近于该至少一个出口的位置处进行。在各种实施方案中，该方法还可以包括在经由至少一个入口端口引入第一流体培养基时检测其ph的步骤。在一些实施方案中，传感器可以是光传感器。在各种实施方案中，该方法还可以包括改变第一流体培养基的组成的步骤。
[0417]
在各种实施方案中，该方法还可以包括监测至少一个生长腔室和其中所含的任何细胞的图像的步骤。
[0418]
在各种实施方案中，生物细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，生物细胞可以是免疫细胞。在一些实施方案中，生物细胞可以是淋巴细胞或白细胞。在一些实施方案中，生物细胞可以是b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方案中，生物细胞可以是贴壁细胞。在一些实施方案中，生物细胞可以是杂交瘤细胞。
[0419]
在一些实施方案中，生物细胞可以是多个生物细胞且至少一个生长腔室是多个生长腔室。在各种实施方案中，该方法还可以包括将多个生物细胞中不超过一个移动进入多个生长腔室中每一个的步骤。
[0420]
在克隆生物细胞的方法的一些实施方案中，经条件化的表面还可以包括可裂解部
分。该方法可以包括在输出克隆群的一个或多个生物细胞离开生长腔室或其分离区域之前使可裂解部分裂解的步骤。
[0421]
在各种实施方案中，该方法还可以包括输出克隆群的一个或多个生物细胞离开生长腔室或其分离区域的步骤。在一些实施方案中，输出可以包括使用足够强的介电电泳(dep)力以移动一个或多个生物细胞。在一些实施方案中，dep力是光致动的。在一些实施方案中，dep力可以通过光电镊子(oet)产生。在一些实施方案中，输出可以包括使用流体流和/或重力。在一些实施方案中，输出可以包括在生长腔室或其分离区域上方的可变形盖子区域上使用压力。在各种实施方案中，该方法还可以包括从液流区域输出克隆群的一个或多个生物细胞离开微流体装置的步骤。在一些实施方案中，输出可以包括使用足够强的dep力以移动一个或多个生物细胞。在一些实施方案中， dep力是光致动的。在一些实施方案中，dep力可以通过光电镊子(oet)产生。在一些实施方案中，输出可以包括使用流体流和/或重力。
[0422]
试剂盒。可以提供试剂盒用于培养生物细胞，其中该试剂盒包括：微流体装置，该微流体装置具有液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室；以及表面条件化试剂。在该实施方案中，至少一个生长腔室未被预处理以条件化至少一个生长腔室的至少一个表面，且在引入细胞之前通过用表面条件化试剂处理来产生经条件化的表面。还提供了用于培养生物细胞的其他试剂盒，其中该试剂盒包括微流体装置，该微流体装置具有液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其包括分离区域和连接区域，其中分离区域与连接区域为流体性连接，且连接区域包括到液流区域的近端开口；并且进一步地，其中至少一个生长腔室包括被条件化为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的至少一个表面。还提供了用于培养生物细胞的其他试剂盒，其包括微流体装置，该微流体装置包括液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其包括分离区域和连接区域，其中分离区域与连接区域为流体性连接，且连接区域具有到液流区域的近端开口；其中至少一个生长腔室具有至少一个具有表面修饰配体的表面。或者，可以提供用于培养生物细胞的试剂盒，其中该试剂盒包括：微流体装置，该微流体装置具有液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其具有至少一个可以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的经条件化的表面；以及表面条件化试剂。任一试剂盒的微流体装置可以是微流体装置100、200、240、290、400、500a-e或600 中的任一个，并且具有上述的任一特征。
[0423]
任一试剂盒的微流体装置还可以包括微流体通道，该微流体通道包括液流区域的至少一部分，且该装置还可以包括生长腔室，该生长腔室具有直接开口进入微流体通道的连接区域。生长腔室还可以包括分离区域。分离区域可以流体性连接至连接区域并且可以被配置为含有第二流体培养基，其中当液流区域和至少一个生长腔室分别被第一和第二流体培养基基本上充满时，第二流体培养基的组分扩散进入第一流体培养基和/或第一流体培养基的组分扩散进入第二流体培养基；且第一培养基基本上不流入分离区域。
[0424]
在试剂盒的各种实施方案中，生长腔室可以被配置为类似于图1、2a-2f、3a-3b 和4a-4c的生长腔室124、126、128、130、244、246、248或436，其中生长腔室的分离区域的体积可以被配置为支持培养物中不超过约1
×
103、5
×
102、4
×
102、3
×
102、2
×ꢀ
102、1
×
102、50、25、15或10个细胞。在其他实施方案中，生长腔室的分离区域具有的体积可以支持至多约
10、50或1
×
102个细胞。上文所述的生长腔室的任何配置均可以用于试剂盒的微流体装置的生长腔室中。
[0425]
在任一试剂盒的各种实施方案中，生长腔室的大小可以被配置为可以保持不超过1
ꢀ×
102个生物细胞可以被保持，其中生长腔室的体积可以为不超过1
×
107立方微米。在其他实施方案中，其中可以保持不超过1
×
102个生物细胞，生长腔室的体积可以为不超过5
×
106立方微米。在其他实施方案中，可以保持不超过50个生物细胞，且生长腔室的体积可以为不超过1
×
106立方微米或者不超过5
×
105立方微米。在试剂盒中，微流体装置可以具有上文所述任何数目的生长腔室。
[0426]
任一试剂盒的微流体装置还可以包括至少一个入口端口，其被配置为将流体培养基(例如，第一或第二流体培养基)输入到液流区域中；和至少一个出口，其被配置为在流体培养基(例如，用过的第一流体培养基)离开液流区域时接受该流体培养基。
[0427]
任一试剂盒的微流体装置还可以包括衬底，其具有多个dep电极，其中衬底的表面形成生长腔室和液流区域的表面。多个dep电极可以被配置为产生足够强的介电电泳(dep)力，以移动一个或多个生物细胞(例如，克隆群)进入生长腔室或其分离区域或移动生物细胞培养物的一个或多个细胞离开生长腔室或其分离区域。dep电极以及因此产生的dep力可以是光致动的。这类光致动的dep电极可以是虚拟电极(例如，由于入射的光而具有增加的导电性的非晶硅衬底的区域)、光电晶体管或由相应的光电晶体管所开关的电极。或者，dep电极以及因此产生的dep力可以是电致动的。在一些其他实施方案中，微流体装置还可以包括具有多个晶体管的衬底，其中衬底的表面形成生长腔室和液流区域的表面。多个晶体管可以能够产生足够强的介电电泳 (dep)力以引入生物细胞或移动生物细胞培养物的一个或多个细胞离开生长腔室或其分离区域。多个晶体管中的每一个均可以是光致动的，且dep力可以通过光电镊子产生。
[0428]
任一试剂盒的微流体装置还可以包括至少一个生长腔室或其分离区域上方的可变形盖子区域，从而压下可变形盖子区域施加一个力，将一个或多个生物细胞(例如，克隆群)从生长区域输出到液流区域。
[0429]
任一试剂盒的微流体装置可以被配置为具有盖子，其是基本上不透气的。或者，盖子的所有部分均可以被配置为透气性的。盖子的透气性部分可以对二氧化碳、氧和氮中的至少一种是渗透性的。在一些实施方案中，盖子(或其一部分)可以对二氧化碳、氧或氮中超过一种的组合是渗透性的。
[0430]
任一试剂盒还可以包括储液器，其被配置为含有流体培养基。储液器可以流体性连接至本文所述的任一微流体装置。储液器可以被配置为使得储液器中存在的流体培养基被能够使流体培养基被溶解的气体分子饱和的气体环境接触。储液器还可以被配置为含有与流体培养基为流体性接触的饲养细胞的群。
[0431]
任一试剂盒可以包括至少一个连接管路，其被配置为连接至微流体装置的入口端口和/或出口端口。连接管路还可以被配置为连接至储液器或流控制器，例如泵组件。连接管路可以是透气性的。透气性连接管路可以对二氧化碳、氧和氮中的至少一种是渗透性的。在一些实施方案中，透气性管路可以对二氧化碳、氧或氮中超过一种的组合是渗透性的。
[0432]
任一试剂盒还可以包括传感器，其被配置为检测第一流体培养基的ph。传感器可以连接至(或者可连接至)微流体装置的入口端口或者与其连接的连接管路。或者，传感器
可以被集成至微流体装置。传感器可以连接在流体培养基进入微流体装置的点附近。试剂盒可以包括传感器，其被配置为在微流体装置的出口处检测流体培养基的ph。传感器可以连接至(或者可连接至)微流体装置的出口端口或者与其连接的连接管路。或者，传感器可以被集成至微流体装置。传感器可以连接在流体培养基离开微流体装置的点附近。传感器无论连接至微流体装置的入口和/或出口，均可以是光传感器。光传感器可以包括led和集成的比色计传感器，其可以任选地是对颜色敏感的光电晶体管。试剂盒还可以包括驱动电子组件，以控制ph传感器和从其接收输出。试剂盒还可以包括ph检测试剂。ph检测试剂可以是可以在可见光下检测的ph-敏感性染料。
[0433]
任一试剂盒还可以包括培养基，其具有能够增强在微流体装置上生物细胞活力的组分。这些组分可以是任何本领域中已知的适当的培养基组分，包括上文对流体培养基组分所述的任何组分。
[0434]
任一试剂盒还可以包括至少一种检测生物细胞或细胞群的状态的试剂。被配置为检测状态的试剂是本领域中公知的，且可以用于例如检测细胞是存活还是死亡；是否分泌目标物质，例如抗体、细胞因子或生长因子；或者是否具有目标细胞表面标记物。这类试剂可以在本文所述的试剂盒和方法中无限制地使用。
[0435]
对于本文所提供的任一试剂盒，试剂盒的组分可以在分离的容器中。对于试剂盒的以溶液形式提供的任一组分，组分可以以本发明的方法中所用的浓度的约1x、5x、 10x、100x或约1000x的浓度存在。
[0436]
对于这样的试剂盒：其中微流体装置的至少一个生长腔室未被预处理以条件化至少一个生长腔室的至少一个表面，且其中用表面条件化试剂处理来产生经条件化的表面；或者对于这样的试剂盒：其包括微流体装置，该微流体装置具有液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其具有至少一个可以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的经条件化的表面；以及表面条件化试剂，生长腔室的表面可以用表面条件化试剂预条件化。表面条件化试剂可以包括聚合物，其可以是上文所述的用作表面条件化试剂的任意一种或多种聚合物。在一些实施方案中，表面条件化试剂可以包括具有亚烷基醚部分、羧酸部分、磺酸部分、氨基酸部分、核酸部分、糖部分或其任意组合的聚合物。表面条件化试剂可以包括peo-ppo嵌段共聚物，例如聚合物(例如l44、l64、p85或f127)。在一些实施方案中，表面条件化试剂可以包括哺乳动物血清的一种或多种组分。哺乳动物血清可以是胎牛血清(fbs) 或胎牛血清(fcs)。
[0437]
或者，用于条件化生长腔室的表面的表面条件化试剂可以与微流体装置分离地包括在试剂盒中。在试剂盒的其他实施方案中，与表面条件化试剂(其与用于条件化生长腔室的表面的表面条件化试剂不同)一起包括预条件化的微流体装置。不同的表面条件化试剂可以是上文所述的任一种表面条件化试剂。在一些实施方案中，试剂盒中包括超过一种表面条件化试剂。
[0438]
在具有微流体装置的试剂盒的各种实施方案中，其中微流体装置的至少一个生长腔室未被预处理以条件化至少一个表面，试剂盒还可以包括适于培养一个或多个生物细胞的培养基。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括培养基添加物，其包含能够补充对生长腔室的表面的条件化的试剂。培养基添加物可以包括如上文所述的条件化试剂或者另一种增强至少一个生长腔室的至少一个表面支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的能力
的化学物质。这可以包括生长因子、激素、抗氧化剂或维生素，等等。
[0439]
试剂盒还可以包括流控制器，其被配置为灌注至少第一流体培养基，其可以是与微流体装置分离的组件，或者可以被并作微流体装置的一部分。控制器可以被配置为非连续地灌注流体培养基。因此，控制器可以被配置为以周期性的方式或不规则的方式灌注流体培养基。
[0440]
另一方面，提供了用于培养生物细胞的试剂盒，其包括微流体装置，该微流体装置具有液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其包括分离区域和连接区域，其中分离区域与连接区域为流体性连接，且连接区域包括到液流区域的近端开口；并且进一步地，其中至少一个生长腔室包括至少一个被条件化为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的表面。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置，并且可以具有本文所述的任一生长腔室。微流体装置可以具有衬底，该衬底具有本文所述的任何类型的dep配置。dep配置可以是光致动的。微流体装置的衬底可以具有表面，其包括本文所述的式1或式2的衬底组合物，并且具有上文所述的所有特征。
[0441][0442]
试剂盒的微流体装置的至少一个经条件化的表面可以包括糖部分、亚烷基醚部分、氨基酸部分、烷基部分、氟代烷基部分(其可以包括全氟代烷基部分)、阴离子部分、阳离子部分和/或两性离子部分。在一些实施方案中，微流体装置的经条件化的表面可以包括糖部分、亚烷基醚部分、烷基部分、氟代烷基部分或氨基酸部分。烷基或全氟代烷基部分可以具有大于10个碳的骨架链长度。在一些实施方案中，支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
[0443]
在试剂盒的一些实施方案中，经条件化的表面可以包括连接基团，其共价连接至微流体装置的表面，且连接基团可以连接至被配置为在微流体装置内支持一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接基团可以是硅氧基连接基团。或者，连接基团可以是膦酸酯连接基团。在试剂盒的一些实施方案中，经条件化的表面的连接基团可以直接连接被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0444]
在其他实施方案中，连接基团可以经由连接部分而间接连接至被配置为支持细胞
生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接基团可以经由与连接部分的第一末端的连接而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。连接部分还可以包括线性部分，其中线性部分的骨架包含1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合的非氢原子。在试剂盒的一些实施方案中，经条件化的表面的连接部分还可以包括亚三唑基部分。可裂解部分被配置为允许破坏经条件化的表面，从而促进生物细胞的可移植性。试剂盒还可以包括被配置为使经条件化的表面的可裂解部分裂解的试剂。
[0445]
在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒还可以包括表面条件化试剂。在一些实施方案中，表面条件化试剂可以包括聚合物，其包含亚烷基醚部分、羧酸部分、磺酸部分、膦酸部分、氨基酸部分、核酸部分或糖部分中的至少一种。在一些其他实施方案中，表面条件化试剂包含聚合物，其包含亚烷基醚部分、氨基酸部分或糖部分中的至少一种。在一些其他实施方案中，经条件化的表面可以包括可裂解部分。
[0446]
在试剂盒的其他实施方案中，表面条件化试剂包含至少一种细胞贴附阻断分子。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以破坏激动蛋白丝形成、阻断整合素受体或减少细胞与dna污染的表面的结合。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以是细胞松弛素b、含rgd的肽、dnase 1蛋白质、纤连蛋白抑制剂或抗整合素的抗体。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以包括超过一类细胞贴附阻断分子的组合。
[0447]
在试剂盒的各种实施方案中，表面条件化试剂可以包括哺乳动物血清的一种或多种组分。哺乳动物血清可以是胎牛血清(fbs)或胎牛血清(fcs)。在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒还可以包括适于培养一个或多个生物细胞的培养基。在一些实施方案中，试剂盒可以包括培养基添加物，其包括被配置为补充对生长腔室的至少一个表面的条件化的试剂。培养基添加物可以包括如上文所述的条件化试剂或者另一种增强至少一个生长腔室的至少一个表面支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的能力的化学物质。这可以包括生长因子、激素、抗氧化剂或维生素，等等。
[0448]
在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒可以包括至少一种检测一个或多个生物细胞的状态的试剂。
[0449]
另一方面，提供了用于培养生物细胞的试剂盒，其包括用于培养一个或多个生物细胞的微流体装置，该微流体装置包括液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，其包括分离区域和连接区域，其中分离区域与连接区域为流体性连接，且连接区域具有到液流区域的近端开口；且至少一个生长腔室具有至少一个具有表面修饰配体的表面。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置。表面可以包括具有介电电泳(dep)配置的衬底。dep配置可以是本文所述的任何dep配置。 dep配置可以是光致动的。衬底是任何具有本文所述的表面修饰配体的衬底，并且可以具有式3的结构，并且可以包括上文所述的所有特征：
[0450][0451]
在包括具有至少一个包括表面修饰配体的表面的微流体装置的试剂盒的各种实施方案中，表面修饰配体可以共价连接至衬底表面的氧化物部分。表面修饰配体可以包括反应性部分。表面修饰配体的反应性部分可以是叠氮基、氨基、溴代、巯基、活化的酯、琥珀酰亚氨基或炔基部分。表面修饰配体可以经由连接基团而共价连接至氧化物部分。在一些实施方案中，连接基团可以是硅烷氧基部分。在其他实施方案中，连接基团可以是膦酸酯部分。连接基团可以经由连接部分而间接连接至表面修饰配体的反应性部分。连接部分可以包括线性部分，其中线性部分的骨架包含1至100个非氢原子，所述非氢原子选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合。在一些实施方案中，表面修饰配体可以包括一个或多个可裂解部分。该一个或多个可裂解部分可以被配置为一旦形成就允许破坏微流体装置的经条件化的表面，从而促进一个或多个生物细胞在培养后的可移植性。
[0452]
在包括具有包括表面修饰配体的至少一个表面的微流体装置的试剂盒的一些实施方案中，试剂盒还可以包括条件化修饰试剂，其包括被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的第一部分；以及被配置为与表面修饰配体的反应性部分反应的第二部分，其可以具有式5的结构，并且具有本文所述的任一特征：
[0453]
部分-(l')
m-r
px
[0454]
式5
[0455]
第二部分可以被配置为将表面修饰配体转化成被配置为在与试剂盒的微流体装置的表面修饰配体的反应性部分反应之后在生长腔室内支持一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的经条件化的表面。第一部分可以包括亚烷基氧化物部分、糖部分；烷基部分、全氟代烷基部分、氨基酸部分、阴离子部分、阳离子部分或两性离子部分。在一些实施方案中，第一部分可以包括烷基或氟代烷基(其包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子性表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子性表面)；磺酸盐阴离子；羧酸甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。第二部分可以是氨基、羧酸、炔、叠氮化物、醛、溴代或巯基部分。在一些实施方案中，条件化修饰试剂的第一部分或连接部分l’(如上文对式5所述)可以包括可裂解部分。可裂解部分可以被配置为允许破坏经条件化的表面，从而促进生物细胞的可移植性。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括被配置为使经条件化的表面的可裂解部分裂解的试剂。
[0456]
在包括具有包括表面修饰配体的至少一个表面的微流体装置的试剂盒的一些实施方案中，试剂盒还可以包括表面条件化试剂。
[0457]
在包括具有包括表面修饰配体的至少一个表面的微流体装置的试剂盒的一些实施方案中，表面条件化试剂可以包括聚合物，其包含亚烷基醚部分、羧酸部分、磺酸部分、膦酸部分、氨基酸部分、核酸部分或糖部分中的至少一种。在一些其他实施方案中，表面条件化试剂包含聚合物，其包含亚烷基醚部分、氨基酸部分或糖部分中的至少一种。在一些其他实施方案中，经条件化的表面可以包括可裂解部分。
[0458]
在包括具有包括表面修饰配体的至少一个表面的微流体装置的试剂盒的一些实施方案中，表面条件化试剂包含至少一种细胞贴附阻断分子。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以破坏激动蛋白丝形成、阻断整合素受体或减少细胞与dna污染的表面的结合。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以是细胞松弛素 b、含rgd的肽、dnase 1蛋白质、纤连蛋白抑制剂或抗整合素的抗体。在一些实施方案中，至少一种细胞贴附阻断分子可以包括超过一类细胞贴附阻断分子的组合。
[0459]
在包括具有包括表面修饰配体的至少一个表面的微流体装置的试剂盒的一些实施方案中，表面条件化试剂可以包括哺乳动物血清的一种或多种组分。哺乳动物血清可以是胎牛血清(fbs)或胎牛血清(fcs)。
[0460]
在包括具有包括表面修饰配体的至少一个表面的微流体装置的试剂盒的一些实施方案中，试剂盒还可以包括适于培养一个或多个生物细胞的培养基。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括培养基添加物，其包括被配置为补充对生长腔室的至少一个表面的条件化的试剂。培养基添加物可以包括如上文所述的条件化试剂或者另一种增强至少一个生长腔室的至少一个表面支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的能力的化学物质。这可以包括生长因子、激素、抗氧化剂或维生素，等等。
[0461]
在包括具有包括表面修饰配体的至少一个表面的微流体装置的试剂盒的一些实施方案中，试剂盒还可以包括至少一种检测一个或多个生物细胞的状态的试剂。
[0462]
在本技术的一些方面，本技术还涉及如下项：
[0463]
项1.一种用于培养一个或多个生物细胞的微流体装置，包括：
[0464]
液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和
[0465]
至少一个生长腔室，其包含分离区域和连接区域，所述分离区域与所述连接区域为流体性连接，且所述连接区域包含到所述液流区域的近端开口，
[0466]
其中所述至少一个生长腔室还包括至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为在所述微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
[0467]
项2.如项1所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面被一种或多种在所述微流体装置内支持细胞可移植性的试剂所条件化。
[0468]
项3.如项1或2所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面被包括亚烷基醚部分的聚合物所条件化。
[0469]
项4.如任一前述项所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面被包括糖部分的聚合物所条件化。
[0470]
项5.如任一前述项所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面被包括氨基酸部分的聚合物所条件化。
[0471]
项6.如任一前述项所述的微流体装置，其中所述微流体装置的至少一个经条件化的表面被包括羧酸部分、磺酸部分、核酸部分或膦酸部分的聚合物所条件化。
[0472]
项7.如任一前述项所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面包括共价连接至所述微流体装置的表面的连接基团，并且其中所述连接基团连接至被配置为在所述微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0473]
项8.如项7所述的微流体装置，其中所述连接基团是硅氧基连接基团。
[0474]
项9.如项7或8所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面包括烷基或氟代烷基部分。
[0475]
项10.如项9所述的微流体装置，其中所述烷基或氟代烷基部分具有大于10个碳的骨架链长度。
[0476]
项11.如项7至10中任一项所述的微流体装置，其中所述连接基团经由连接部分而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0477]
项12.如项11所述的微流体装置，其中所述连接部分包含亚三唑基部分。
[0478]
项13.如任一前述项所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面包括糖部分。
[0479]
项14.如任一前述项所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面包括亚烷基醚部分。
[0480]
项15.如任一前述项所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面包括氨基酸部分。
[0481]
项16.如项7至15中任一项所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面包括两性离子。
[0482]
项17.如任一前述项所述的微流体装置，其中至少一个经条件化的表面包括至少一种细胞贴附阻断分子。
[0483]
项18.如项17所述的微流体装置，其中所述至少一种细胞贴附阻断分子是含rgd 的肽。
[0484]
项19.如项17或18所述的微流体装置，其中所述至少一种细胞贴附阻断分子是超过一种细胞贴附阻断分子的组合。
[0485]
项20.如任一前述项所述的微流体装置，其中经条件化的表面包括可裂解部分。
[0486]
项21.如任一前述项所述的微流体装置，其中所述微流体装置的至少一个经条件化的表面包括哺乳动物血清的一种或多种组分。
[0487]
项22.如任一前述项所述的微流体装置，其中所述微流体装置还包括具有介电电泳(dep)配置的衬底。
[0488]
项23.如项22所述的微流体装置，其中dep配置是光致动的。
[0489]
项24.如任一前述项所述的微流体装置，其中所述至少一个生长腔室包括至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为支持哺乳动物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
[0490]
项25.如任一前述项所述的微流体装置，其中所述至少一个生长腔室包括至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为支持免疫细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
[0491]
项26.如项25所述的微流体装置，其中所述免疫细胞是淋巴细胞或白细胞。
[0492]
项27.如项25所述的微流体装置，其中所述免疫细胞是b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞或树突细胞。
[0493]
项28.如项1至24中任一项所述的微流体装置，其中所述至少一个生长腔室包括至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为支持贴壁细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
[0494]
项29.如项1至24中任一项所述的微流体装置，其中所述至少一个生长腔室包括至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为支持杂交瘤细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
[0495]
项30.如任一前述项所述的微流体装置，其中所述至少一个生长腔室包括至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为支持单个细胞和相应的生物细胞的克隆集落的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
[0496]
项31.一种用于在微流体装置上培养一个或多个生物细胞的系统，所述系统包括：
[0497]
微流体装置，其包括：
[0498]
液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和
[0499]
至少一个生长腔室，其中所述生长腔室具有至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为在所述微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
[0500]
项32.如项31所述的系统，其中所述微流体装置是项1至30中任一项所述的微流体装置。
[0501]
项33.如项31或32所述的系统，其还包括流控制器，其被配置为灌注至少所述第一流体培养基。
[0502]
项34.如项33所述的系统，其中所述控制器被配置为非连续地灌注至少第一流体培养基。
[0503]
项35.如项31至34中任一项所述的系统，其中所述微流体装置还包括具有介电电泳(dep)配置的衬底，所述衬底被配置为将一个或多个生物细胞引入或移出所述生长腔室。
[0504]
项36.如项35所述的系统，其中dep配置是光致动的。
[0505]
项37.如项31至36中任一项所述的系统，其还包括储液器，所述储液器被配置为含有所述第一流体培养基，其中所述储液器与所述微流体装置为流体性连接。
[0506]
项38.如项37所述的系统，其中所述储液器被配置为被气体环境所接触，所述气体环境能够使所述第一流体培养基被溶解的气体分子所饱和。
[0507]
项39.如项31至38中任一项所述的系统，其还包括与所述微流体装置的至少一个入口端口连接的传感器，其中所述传感器被配置为检测所述第一流体培养基的ph。
[0508]
项40.如项31至39中任一项所述的系统，其还包括与至少一个出口连接的传感器，其中所述传感器被配置为在所述第一流体培养基离开所述微流体装置时检测所述第一流体培养基的ph。
[0509]
项41.如项39或40所述的系统，其中所述传感器是光传感器。
[0510]
项42.如项31至41中任一项所述的系统，其还包括检测器，所述检测器被配置为捕捉所述至少一个生长腔室和其中所含的任何生物细胞的图像。
[0511]
项43.一种组合物，其包括：
[0512]
具有介电电泳(dep)配置和表面的衬底；和
[0513]
共价连接至所述衬底的所述表面的氧化物部分的经条件化的表面。
[0514]
项44.如项43所述的组合物，其中所述经条件化的表面包括共价连接至所述表面的氧化物部分的连接基团，并且其中所述连接基团连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0515]
项45.如项44所述的组合物，其中所述连接基团是硅氧基连接基团。
[0516]
项46.如项44或45所述的组合物，其中所述连接基团间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0517]
项47.如项44至46中任一项所述的组合物，其中所述连接基团经由与连接部分的第一末端的连接而间接连接至被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0518]
项48.如项47所述的组合物，其中所述连接部分还包括线性部分，其中所述线性部分的骨架包括1至200个非氢原子，所述非氢原子选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任意组合。
[0519]
项项49.如项47至48中任一项所述的组合物，其中所述连接部分还包含亚三唑基部分。
[0520]
项50.如项43至49中任一项所述的组合物，其中被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分包括烷基、氟代烷基、单糖或多糖、醇、多元醇、亚烷基醚、聚电解质、氨基基团、羧酸、膦酸、磺酸盐阴离子、羧酸甜菜碱、磺基甜菜碱、氨基磺酸或氨基酸。
[0521]
项51.如项43至50中任一项所述的组合物，其中至少一个经条件化的表面包括氨基酸、烷基部分、全氟代烷基部分、葡聚糖部分和/或亚烷基醚部分。
[0522]
项52.如项43至51中任一项所述的组合物，其中所述经条件化的表面还包括一个或多个可裂解部分。
[0523]
项53.如项52所述的组合物，其中所述可裂解部分被配置为允许破坏所述经条件化的表面，从而促进培养后的一个或多个生物细胞的可移植性。
[0524]
项54.一种用于培养生物细胞的试剂盒，包括：
[0525]
微流体装置，其包括：
[0526]
液流区域，其被配置为含有第一流体培养基的流；和
[0527]
其中至少一个生长腔室还包括至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为在所述微流体装置内支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
[0528]
项55.如项54所述的试剂盒，其中所述微流体装置是项1-30中任一项所述的微流体装置。
[0529]
项56.如项54或55所述的试剂盒，其中所述微流体装置的至少一个经条件化的表面包括烷基部分、氟代烷基部分、单糖或多糖部分、醇部分、多元醇部分、亚烷基醚部分、聚电解质部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸酯部分、羧酸甜菜碱部分、磺基甜菜碱部分、氨基磺酸部分或氨基酸部分。
[0530]
项57.如项54至56中任一项所述的试剂盒，其中所述微流体装置的至少一个经条件化的表面包含糖部分、亚烷基醚部分、烷基部分、氟代烷基部分或氨基酸部分中的至少一种。
[0531]
项58.如项57所述的试剂盒，其中所述烷基或氟代烷基部分具有超过10个碳的骨架链长度。
[0532]
项59.如项54至58中任一项所述的试剂盒，其中至少一个经条件化的表面包括共价连接至所述微流体装置的表面的连接基团，并且其中所述连接基团连接至被配置为支持所述微流体装置内的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0533]
项60.如项59所述的试剂盒，其中所述连接基团是硅氧基连接基团。
[0534]
项61.如项59或60所述的试剂盒，其中所述连接基团间接连接至所述被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0535]
项62.如项61所述的试剂盒，其中所述连接基团经由连接部分间接连接至所述被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0536]
项63.如项54至62中任一项所述的试剂盒，其还包括表面条件化试剂。
[0537]
项64.如项63所述的试剂盒，其中所述表面条件化试剂包括聚合物，所述聚合物包含亚烷基醚部分、羧酸部分、磺酸部分、膦酸部分、氨基酸部分、核酸部分或糖部分中的至少一种。
[0538]
项65.如项63所述的试剂盒，其中所述表面条件化试剂包括至少一种细胞贴附阻断分子。
[0539]
项66.如项63所述的试剂盒，其中所述表面条件化试剂包括哺乳动物血清的一种或多种组分。
[0540]
项67.如项54至66中任一项所述的试剂盒，其还包括培养基添加物，所述培养基添加物包括被配置为对生长腔室的至少一个表面的条件化进行补充的试剂。
[0541]
项68.如项54至67中任一项所述的试剂盒，其中所述经条件化的表面包括可裂解部分。
[0542]
项69.如项68所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括被配置为使所述经条件化的表面的所述可裂解部分裂解的试剂。
[0543]
项70.一种在微流体装置中培养至少一个生物细胞的方法，所述微流体装置具有液流区域，所述液流区域被配置为含有第一流体培养基的流；和至少一个生长腔室，所述方法包括以下步骤：
[0544]
向所述至少一个生长腔室中引入所述至少一个生物细胞，其中所述至少一个生长腔室被配置为具有至少一个表面，所述至少一个表面被条件化为支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合；以及
[0545]
孵育所述至少一个生物细胞至少足够长的一段时间，以扩增所述至少一个生物细胞以产生生物细胞的集落。
[0546]
项71.如项70所述的方法，其中所述微流体装置是项1-30中任一项所述的微流体装置。
[0547]
项72.如项70至71中任一项所述的方法，其中至少一个经条件化的表面包括共价连接至所述表面的连接基团，并且其中所述连接基团连接至被配置为支持所述微流体装置内的所述一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的部分。
[0548]
项73.如项70至72中任一项所述的方法，其中至少一个经条件化的表面包括烷基
(atcc)(目录号ccl-243
tm
)，并且以悬浮细胞系的形式提供。通过接种1
×
103个活细胞/ml并在37℃下使用5％二氧化碳气体环境孵育而保持培养物。细胞以1
ꢀ×
106个细胞/ml或每2-3天进行分瓶。将细胞冷冻在5％二甲基亚砜(dmso)/95％完全生长培养基中。
[0569]
培养基：将伊思柯夫改良培养基(目录号30-2005)加10％胎牛血清(hyclone 目录号sh30071.2)组合以制备完全生长培养基。当在孵育期间灌注时，在引入到微流体装置中之前用空气中5％二氧化碳连续条件化完全生长培养基。
[0570]
装填溶液：含有0.1％f127(life目录号p6866)的完全生长培养基。
[0571]
系统和微流体装置：由berkeley lights,inc.制造。系统包括至少流控制器、温度控制器、流体培养基条件化和泵组件、用于光激活的dep配置的光源、微流体装置、安装台和照相机。本实验中所用的微流体装置的生长腔室的体积为大约1.4
×
105立方微米。液流通道的截面积为约4
×
103平方微米。微流体装置具有8个通道。
[0572]
培养准备：将微流体装置加载到系统上，并用100％二氧化碳在15psi下吹扫(purged) 5min。在二氧化碳吹扫之后，立即将装填溶液以5μl/sec灌注通过微流体装置8min。然后使完全生长培养基以5μl/sec流经微流体装置5min。
[0573]
培养条件：使微流体装置的温度保持在37℃。在整个培养实验期间以0.001μl/sec 的恒定流速灌注培养基。
[0574]
使用重力将单个k562细胞加载到微流体装置的一个生长腔室中。示出了加载细胞后t＝0h时生长腔室的照片(参见图10a)。箭头1002指向单个细胞在生长腔室中的位置。
[0575]
在16h的培养完成后，细胞扩增至2个细胞的群，如在该时间点所拍摄的照片中所示(参见图10b)。箭头1004指向这两个细胞在生长腔室中的位置。
[0576]
在34h的培养完成后，细胞群增加到总共4个细胞，如在图10c的照片中所示。箭头1006和1008各自指向位于生长腔室内的两群两个细胞。
[0577]
在54小时的培养完成后，k562细胞的群增加到总共8个细胞，如图10d的照片中所示。箭头1010和1012指向生长腔室内的细胞群两侧的细胞。
[0578]
在70小时的培养完成后，k562细胞的群增加到总共16个细胞，如图10e的照片中所示。箭头1014、1016和1018指向该群的细胞。在微流体装置的生长腔室中提供了k562克隆扩增群。
[0579]
实施例2.okt3杂交瘤细胞的培养和生长。
[0580]
材料：okt3细胞，鼠骨髓瘤杂交瘤细胞系，得自atcc(目录号crl
‑ꢀ
8001
tm
)。细胞以悬浮细胞系的形式提供。通过接种约1
×
105至约2
×
105个活细胞/ml 并在37℃下使用空气中5％二氧化碳作为气体环境孵育而保持培养物。细胞每2-3天分瓶。对okt3细胞数目和活力进行计数并将细胞密度调节至5
×
105/ml，用于加载至微流体装置。
[0581]
培养基：将500ml伊思柯夫改良培养基(目录号30-2005)、200ml胎牛血清(目录号30-2020)和1ml青霉素-链霉素(life目录号15140
‑ꢀ
122)组合以制备培养基。将完全培养基经过0.22μm过滤器过滤，并避光保存在4℃，直至使用。
[0582]
当在孵育期间灌注时，在引入到微流体装置中之前用空气中5％二氧化碳连续条件化培养基。
[0583]
装填溶液：含有0.1％f127(life目录号p6866)。的培养基。
[0584]
系统和微流体装置：由berkeley lights,inc.制造。系统包括至少流控制器、温度控制器、流体培养基条件化和泵组件、用于光激活的dep配置的光源和投影仪、微流体装置、安装台和照相机。本实验中所用的微流体装置的生长腔室的体积为大约1.5
×
106立方微米。液流通道的截面积为约8
×
103平方微米，且微流体装置上存在总共六个通道。
[0585]
培养准备：将微流体装置加载到系统上，并用100％二氧化碳在15psi下吹扫5min。在二氧化碳吹扫之后，立即将装填溶液以8μl/sec灌注通过微流体装置，直至2.5ml的总体积被灌注通过微流体装置。然后使培养基以8μl/sec流经微流体装置，直至总共1 ml的培养基被灌注通过微流体装置。在引入细胞之前，所制备的微流体装置示于图11a 的照片中。一排四个生长腔室沿着照片的底部延伸。
[0586]
培养条件：使微流体装置的温度保持在37℃。在整个培养实验期间使用变化的灌注方法灌注培养基，该方法包括初始的以0.01μl/sec灌注4h的时间段，然后是以 8μl/sec持续约3秒的短的高速灌注，然后是大约少于1分钟的短的灌注停止阶段。这种包括交替的灌注速率和停止的循环在整个培养实验期间持续。
[0587]
使用重力将单个okt3细胞引入到生长腔室中。图11b中示出t＝0时具有一个细胞的生长腔室的照片，其中箭头1102从左侧指向第二腔室，尤其是指向腔室内的单个细胞，其中细胞所驻留的区域进一步被圆圈所包围。
[0588]
图12a-12c示出培养实验中在后时间点时微流体装置的照片，并表明细胞扩增形成克隆群。图12a的照片是完成一天的培养时拍摄的，并且箭头1202从左侧指向第二腔室中的一群约四个细胞，引入单个okt3细胞的点。图12b是完成2天的培养之后拍摄的照片，并且箭头1204从左侧指向第二腔室中进一步增多的细胞群。图12c是完成3天的培养之后拍摄的照片，并且箭头1206显示从培养单个okt3细胞而得到的众多扩增的okt3细胞。
[0589]
图13a-13c示出完成三天的培养之后(即，12c的时间点之后)微流体装置的照片，并表明使用由光电镊子产生的介电电泳力输出所选的扩增的okt 3细胞。在图13a 中，引发介电电泳力的光的图案(即，箭头1302所指的光阱)被显示为细胞周围的白色盒子。通过光致动的介电电泳力，将细胞从生长腔室的底部向液流通道移动。图13b 的照片示出扩增的okt 3细胞进一步移动进入液流区域。细胞仍然被捕获在光阱中，并且被强制随着光阱而移动(箭头1304)。图13c的照片显示扩增的细胞一旦被完全移动到液流区域中之后的释放(箭头1306)。通过使用光致动的dep力、重力或流体流，这些细胞被输出离开微流体装置用于进一步研究或扩增。
[0590]
该实验表明了通过使用本文所述的装置和方法所提供的选择性、精确性和灵活性。
[0591]
实施例3.使用无血清培养基条件化微流体装置的表面以移除贴壁细胞。
[0592]
系统和微流体装置：与实施例1中相同，生长腔室的体积为约7
×
105立方微米。
[0593]
装填方案：使250微升100％二氧化碳以12μl/sec的流速流入。随后使250微升含有0.1％f27(life目录号p6866)的pbs以12μl/sec流入。装填的最终步骤包括250微升pbs以12μl/sec流入。随后是培养基的引入。
[0594]
灌注方案：灌注方法是以下两种方法中的一种：
[0595]
1.以0.01μl/sec灌注2h；以2μl/sec灌注64秒；并重复。
[0596]
2.以0.02μl/sec灌注100秒；停止流500秒；以2μl/sec灌注64秒；并重复。
[0597]
培养基。无血清培养基(thermofisher scientific，目录号12045-096)。
[0598]
系统和微流体装置。通过在36℃下用条件化培养基添加物补充物(2％v/v) 将贴壁细胞(其可以是例如jimt1细胞，其可商购自addexbio，目录号c000605)在无血清培养基中预孵育30min来证明培养后从微流体装置的液流通道移除贴壁细胞的能力。在预孵育后，将贴壁细胞引入到液流通道中，停止流，并将贴壁细胞培养2h至约24h的时间段。在测定结束后，以5μl/sec的流速引入无血清培养基的流。约750微升的流经过微流体装置，代表约150x微流体装置体积，所有贴附的jimt1细胞均被输出离开液流通道并离开微流体装置。该实验显示，可以含有诸如可商购的b27的补充物组分的无血清培养基可以在并入贴附性报告细胞的测定过程期间防止贴附，并允许从微流体装置输出贴壁细胞。
[0599]
实施例4.使用条件化混合物条件化微流体装置的表面移除贴壁细胞。
[0600]
贴壁细胞：如上文对实施例3所述。
[0601]
培养基。无血清的培养基(thermofisher scientific，目录号12045-076)，具有添加的组分，包括但不限于fbs(可商购自thermofisher scientific，目录号16000-036)和青霉素-链霉素(thermofisher scientific，目录号15140-163)。
[0602]
条件化混合物：细胞松弛素b(sigma aldrich，目录号c2743-200ul)；dnasei(newengland biosciences，目录号：m0303s)；和rgd三肽(santa cruz biotechnology，目录号：sc-201176)。
[0603]
贴壁细胞制备：用条件化混合物来调整培养基，使得最终浓度为：4μm细胞松弛素b；0.1单位/μl dnasei；和1mm rgd三肽。在输入到微流体装置中之前，将贴壁细胞在36℃下孵育30min。
[0604]
系统和微流体装置。如上文所述，其中生长腔室的体积为约7
×
105立方微米。
[0605]
通过预孵育用条件化混合物预孵育的贴壁细胞群证明培养后从微流体装置的液流通道移除贴壁细胞(例如，jimt1细胞)的能力。值得注意的是，条件化混合物的使用允许在微流体环境中使用含血清的培养基，例如该实施例中使用的培养基，同时仍然提供贴壁细胞的移除。
[0606]
将预孵育的贴壁细胞引入到微流体装置的液流通道中，并将贴壁细胞孵育2h至约 24h的时间段。在测定结束后，以5μl/sec的流速引入培养基的流。约750微升的流经过微流体装置，代表约150x微流体装置体积，所有贴壁细胞均被输出离开液流通道并离开微流体装置。该实验显示，条件化混合物可以防止贴附并允许输出贴壁细胞。
[0607]
实施例5.制备具有经条件化的表面的微流体装置。
[0608]
对于所有的制备：微流体装置：如上文对实施例1所述，由berkeley lights,inc.生产，并以收到的形式使用。在所有情况下，在合成经条件化的表面之前，将具有带图案的聚硅氧烷的硅衬底和ito/玻璃衬底(pps)在nordson asymtek等离子体清洁器(100w 功率，50s)中进行氧等离子体清洁。
[0609]
a.经全氟代烷基甲硅烷氧基条件化的表面。
[0610]
材料：十七氟-1,1,2,2-四氢癸基三甲氧基硅烷得自gelest(目录号sih5841.5)并以获得的形式使用。mgso4·
7h2o(acros)以获得的形式使用。
[0611]
制备方法。通过在升高的温度和降低的压力下使装配的微流体装置暴露于十七氟
‑ꢀ
1,1,2,2-四氢癸基三甲氧基硅烷和水蒸气而对其进行化学修饰。将300微升十七氟
‑ꢀ
1,1,2,2-四氢癸基三甲氧基硅烷和0.5g mgso4·
7h2o(水源)添加至清洁、干燥的6”玻璃真空干燥器底部的分离的铝蒸发皿中。将微流体装置支持在硅烷试剂和水合物盐(水源)上方的多孔板上。在室温下将干燥器泵至750mtorr并密封。然后将干燥器置于 110℃烘箱中24h。然后将具有经全氟代烷基条件化的表面的微流体装置从干燥器中移除并使用。
[0612]
在一些实验中，在将微流体装置安装至印刷线路板之前对其进行化学修饰。
[0613]
b.经葡聚糖条件化的表面。
[0614]
材料。从11-溴代十一烷基三甲氧基硅烷(gelest)通过用叠氮化钠置换溴化物部分来合成11-叠氮基十一烷基三甲氧基硅烷。在典型的反应中，将4.00g 11-溴代十一烷基三甲氧基硅烷(gelest)添加到在60ml干燥二甲基甲酰胺(dmf)(acros)中含有2.00g叠氮化钠(sigma-aldrich)的溶液中。将溶液在室温下在氮气中搅拌24h。然后，将溶液过滤，并将滤液用干燥的戊烷(acros)萃取。通过旋转蒸发将11-叠氮基十一烷基三甲氧基硅烷粗产物浓缩并通过两次连续的真空蒸馏来纯化。
[0615]
二苯并环辛炔(dbco)-修饰的葡聚糖(mw～3000da)购自nanocs并以获得的形式使用。
[0616]
制备方法。表面修饰配体的引入。通过在升高的温度和降低的压力下使装配的微流体装置的表面暴露于11-叠氮基十一烷基三甲氧基硅烷和水蒸气而对其进行化学修饰。将300微升11-叠氮基十一烷基三甲氧基硅烷和0.5g mgso4·
7h2o(水源)添加至清洁、干燥的6”玻璃真空干燥器底部的分离的铝蒸发皿中。将微流体装置支持在硅烷和水合物盐(水源)上方的多孔板上。在室温下将干燥器泵至750mtorr并密封。然后将干燥器置于110℃烘箱中24h。然后将具有表面修饰配体11-叠氮基十一烷基硅烷氧基部分的微流体芯片从干燥器中移除。在一些实验中，在将微流体装置安装至印刷线路板之前对其进行化学修饰。
[0617]
经葡聚糖条件化的表面的引入。在气相沉积之后，通过使至少250微升含有166 μm dbco-葡聚糖的水溶液流经具有表面修饰叠氮化物配体的微流体装置而使叠氮化物封端的微流体装置表面与dbco-葡聚糖反应。使反应在室温下进行至少1h。然后通过使至少250微升di水流经芯片来淋洗芯片。
[0618]
c.经聚乙二醇(peg)条件化的表面。
[0619]
材料。如上文所述地合成11-叠氮基十一烷基三甲氧基硅烷。炔修饰的peg(mw ～5000da)购自jenkem并以收到的形式使用。抗坏血酸钠和硫酸铜五水合物购自 sigma-aldrich，并以收到的形式使用。(3[三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺)thpta铜催化的click试剂(glen research)。
[0620]
制备方法。表面修饰配体的引入。如上文所述地制备具有11-叠氮基十一烷基硅烷氧基表面修饰配体的微流体芯片。
[0621]
引入经peg条件化的表面。通过使至少250微升含有333μm炔修饰的peg、500 μm硫酸铜、500μm thpta配体和5mm抗坏血酸钠的水溶液流经具有11-叠氮基十一烷基硅烷氧基表面修饰配体的微流体装置，而使微流体装置的叠氮化物封端的表面与炔修饰的peg反应。使反应在室温下进行至少1小时。然后通过使至少250微升去离子水流经装置来淋洗具有经peg条件化的表面的微流体装置。
[0622]
d.具有与表面的膦酸酯连接基团的烷基修饰的表面。
[0623]
材料。十八烷基膦酸购自sigma aldrich且以收到的形式使用。丙酮和乙醇购自 sigma aldrich。
[0624]
制备方法。在35℃下使微流体装置的表面暴露于十八烷基膦酸在干燥乙醇中的10 mm溶液48小时。在沉积之后，将得到的具有经膦酸酯连接基团连接的经烷基条件化的表面的微流体装置用乙醇和di水充分淋洗。
[0625]
实施例6：在经条件化的微流体表面上培养和输出t淋巴细胞。
[0626]
材料。cd3+细胞得自allcells inc.并与抗-cd3/抗-cd28磁珠( thermofisher scientific，目录号11453d)以1珠/1细胞的比例混合。将混合物在37℃下在5％co2孵育箱中、在与培养实验本身相同的培养基中孵育5小时。在孵育之后，将t细胞/珠混合物重悬浮备用。
[0627]
培养基。rpmi-1640(thermofisher scientific，目录号11875-127)、10％ fbs、2％人ab血清(50u/ml il2；r&d system)。
[0628]
装填操作：如上文对实施例3所述。
[0629]
灌注方案：如上文对实施例3所述。
[0630]
系统和微流体装置：如上文对实施例3所述。生长腔室的体积为约7
×
105立方微米。
[0631]
经条件化的表面。微流体装置具有如上文所述制备的经共价连接的葡聚糖条件化的表面。
[0632]
通过使重悬浮液流动通过流体入口并进入微流体通道而将t细胞加珠悬浮液引入到微流体装置中。使流停止，并通过使芯片倾斜并允许重力将t细胞/珠拉入生长腔室中而将t细胞/珠随机加载到生长腔室中。
[0633]
在将t细胞/珠加载到生长腔室中之后，将培养基经过纳流体芯片的微流体通道灌注4天的时间段。图14a显示t细胞在微流体装置的生长腔室的经葡聚糖条件化的表面上的生长。相对于类似的微流体装置的非经条件化的表面，t细胞在经葡聚糖条件化的表面上的生长得到改善(数据未示出)。
[0634]
然后通过重力(例如，倾斜微流体装置)将t细胞从生长腔室去除。图14b显示了在20分钟的期间结束时从生长腔室去除的程度，表明优异的将扩增的t细胞输出到液流通道中的能力，这相对于将t细胞从类似的微流体装置的非经条件化的表面去除而得到改善。然后将t细胞从微流体装置输出(未示出)。
[0635]
本文示出的实施例是示例性的，并且不以任何方式限制整个说明书中描述的方法和设备的范围。