一种基于需钠弧菌生产左旋多巴的方法

1.本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种基于需钠弧菌生产左旋多巴的方法。


背景技术：

2.左旋多巴(3,4
‑
dihydroxylphenylalanine,l
‑
dopa)属于苯丙氨酸类化合物，是l
‑
酪氨酸的一种类似物，作为多巴胺的前体，左旋多巴可以通过血脑屏障，被氨基酸脱羧酶转化为多巴胺，目前治疗帕金森综合症最为常用的有效药物之一。
3.左旋多巴的制备方法主要有化学合成、天然植物中提取、生物酶催化及微生物发酵。化学合成法生产左旋多巴也由于环境污染严重、工艺复杂和转换率低等缺点大大限制其应用；从天然植物中提取左旋多巴的方法由于产量低、生产率低和成本高而无法满足市场需求。
4.目前已经有几种生物催化剂被应用于全细胞催化法生产左旋多巴，其中酪氨酸酶、对羟基苯乙酸酯3
‑
羟化酶(phah)和酪氨酸苯酚裂解酶的研究相对深入。酪氨酸酶是一种氧化还原酶，同时具有甲酚酶和儿茶酚酶的活性。左旋多巴可以通过其儿茶酚酶的活性进一步转化为多巴醌，因此需要大量的还原剂来保护左旋多巴不被氧化，大量使用还原剂大大增加了下游分离和提取的成本和困难，导致工业上的应用受到限制。phah也被报道用于生产左旋多巴，phah可以在还原型辅酶i(nadh)和氧气存在的情况下将l
‑
酪氨酸转化为左旋多巴。与酪氨酸酶类似，这一反应中需要昂贵的nadh作为辅助因子，这使得工业生产的成本更高。从微生物中分离出来的酪氨酸酚裂解酶(tpls)被用来生产左旋多巴，克服了其他生物催化剂的主要缺点，获得了显著的效果，激发了人们对不同tpls综合研究的兴趣。
5.需钠弧菌(v.natrigens)是一种非致病性的革兰氏阴性海洋细菌，是迄今为止生长最快的微生物，具有倍增时间短，底物谱广泛、底物吸收速率高等优点。配备t7表达系统的需钠弧菌具有较好的可溶性蛋白表达能力。此外，使用需钠弧菌进行蛋白表达时不需要精确控制诱导时间。
6.因此，本领域的技术人员致力于开发一种基于需钠弧菌生产左旋多巴的方法。


技术实现要素：

7.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种基于需钠弧菌生产左旋多巴的方法，以缩短细胞培养等过程的时间，简化操作，避免左旋多巴不被氧化，降低了生物催化剂的成本。
8.本发明的目的是通过以下方式实现的：
9.一种基于需钠弧菌生产左旋多巴的方法，其特征在于包括设计合成重组质粒pet
‑
28a(+)
‑
fntpl，将重组质粒导入具有t7聚合酶表达系统的商业菌株需钠弧菌(vmax)中获得重组需钠弧菌(vmax
‑
1)进行活化培养，将活化后的重组需钠弧菌接种到培养基中，37℃下诱导培养，离心收菌，使用缓冲液重悬菌体，加入到反应体系中进行全细胞催化反应，所述反应体系包括：磷酸盐缓冲液、亚硫酸钠、edta
‑
2na、磷酸吡哆醛、邻苯二酚、丙酮酸钠、醋酸
铵，反应过程中通过补加反应底物邻苯二酚、丙酮酸钠、醋酸铵维持生产效率。
10.优选地，所述诱导培养时长是2
‑
5h。
11.更优选地，所述诱导培养时长是4h。
12.优选地，所述催化反应温度是10
‑
40℃。
13.更优选地，催化反应温度为20℃。
14.优选地，所述反应体系中磷酸盐缓冲液ph值为7
‑
10。
15.更优选地，磷酸盐缓冲液ph值为8。
16.优选地，所述反应体系包括磷酸盐缓冲液，2g/l亚硫酸钠，1g/l edta
‑
2na，1mm磷酸吡哆醛，5
‑
15g/l邻苯二酚，5g/l
‑
15g/l丙酮酸钠,25
‑
125g/l醋酸铵。
17.更优选地，所述反应体系包括7.5g/l邻苯二酚,10g/l丙酮酸钠,50g/l醋酸铵。
18.优选地，催化反应的底物补料策略采取反应前半程每小时补加7g/l邻苯二酚、7g/l丙酮酸钠和5.6g/l醋酸铵的策略，后半程每小时补加3.5g/l邻苯二酚、3.5g/l丙酮酸钠和2.8g/l醋酸铵。
19.与现有技术比较，本发明采用的新型宿主vmax
‑
1的有益效果如下：
20.1)有效地缩短细胞培养等过程的时间，简化操作；
21.2)快速地进行蛋白表达，有利于生物催化剂的快速生产，降低了生物催化剂的成本；
22.3)快速的催化生成目标产物，催化速率明显提高。
23.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
24.图1是本发明的重组菌株需钠弧菌vmax
‑
1与大肠杆菌bl21
‑
1蛋白表达水平，催化功能验证的对比图以及诱导时长对蛋白表达量影响的曲线图；
25.图2是本发明的重组需钠弧菌vmax
‑
1的全细胞催化体系不同参数的优化图；
26.图3是本发明的重组需钠弧菌vmax
‑
1的全细胞催化补料实验生产左旋多巴的过程中产物与底物随时间变化的曲线图。
具体实施方式
27.以下实施例和试验例的目的是更好的阐述本发明，并不是对本发明的限制，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
28.实施例1
29.1.构建重组需钠弧菌vmax
‑130.1)从ncbi数据库中下载目标基因tpl的序列，并进行密码子的优化，进行基因合成；
31.2)将合成的基因克隆扩增，使用限制性内切酶ncoi and xhoi对目的基因进行酶切，得到酶切后的片段；
32.3)将载体pet
‑
28a(+)以同样的酶切位点ncoi and xhoi进行酶切，得到线性化载体，再通过t4连接酶将线性化载体和酶切后的片段连接，得到重组质粒pet
‑
28a(+)
‑
fntpl；
33.4)将重组质粒pet
‑
28a(+)
‑
fntpl导入到需钠弧菌中，获得对应的重组菌株vmax
‑
1。
34.2.重组需钠弧菌vmax
‑
1蛋白表达
35.1)将菌株vmax
‑
1甘油管从
‑
80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5ml lb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm培养进行活化；
36.2)将活化后的菌液以1％的接种量分别接种到30ml lb3培养基中，37℃，200rpm培养进行二次活化；
37.3)将活化后vmax
‑
1菌液以1％的接种量接种到1l lb3培养基中，37℃，200rpm培养，待od
600
达到0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.5mm，在37℃下诱导4小时，再以4000rpm、20min进行离心收菌；；
38.4)用磷酸盐缓冲液洗菌，6000rpm、15min进行离心收菌，去上清，重复此步骤2至3遍；
39.5)用一定体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体，将重悬的菌液加入到50ml反应体系中并稀释至od
600
等于20，反应体系包括磷酸盐缓冲液，7.5g/l邻苯二酚，10g/l丙酮酸钠，50g/l醋酸铵，2g/l亚硫酸钠，1g/l edta
‑
2na,1mm磷酸吡哆醛，催化反应在20℃，ph＝8.0，200rpm的条件下反应，每隔一段时间进行取样，为维持底物浓度在最佳水平，前期采取了每小时补加7g/l邻苯二酚、7g/l丙酮酸钠和5.6g/l醋酸铵的策略，后期由于催化速率的下降，将补料策略调整为每小时补加3.5g/l邻苯二酚、3.5g/l丙酮酸钠和2.8g/l醋酸铵，催化反应持续10小时后，加入等体积的4m的盐酸终止反应。
40.试验例1、重组需钠弧菌vmax
‑
1与大肠杆菌bl21
‑
1蛋白表达能力的表征与比较其步骤为：
41.1)重组需钠弧菌与大肠杆菌的构建
42.从ncbi数据库中下载目标基因tpl的序列，并进行密码子的优化，再送至公司进行基因合成；将合成的基因克隆扩增，并使用限制性内切酶ncoi and xhoi对目的基因进行酶切，得到酶切后的片段；将载体pet
‑
28a(+)以同样的酶切位点ncoi and xhoi进行酶切，得到线性化载体，再通过t4连接酶将线性化载体和酶切后的片段连接，得到重组质粒pet
‑
28a(+)
‑
fntpl；将重组质粒pet
‑
28a(+)
‑
fntpl分别导入到需钠弧菌和大肠杆菌中，以获得对应的重组菌株。
43.最终，得到了重组需钠弧菌和大肠杆菌，分别命名为vmax
‑
1和bl21
‑
1。
44.2)将菌株vmax
‑
1和重组大肠杆菌bl21
‑
1的甘油管从
‑
80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5ml lb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)和5ml lb培养基(1％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm培养进行活化；
45.3)将活化后的菌液以1％的接种量分别接种到30ml lb3和lb培养基中，37℃，200rpm培养进行二次活化；
46.4)将活化后vmax
‑
1菌液以1％的接种量接种到1l lb3培养基中，37℃，200rpm培养，待od
600
达到0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.5mm，在37℃下诱导4小时，再以4000rpm、20min进行离心收菌；将活化后的bl21
‑
1菌液以1％的接种量接种到1l lb培养基中，37℃，200rpm培养，待od
600
达到0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.5mm，在37℃下诱导4小时或者在16℃下诱导16至20小时，再以4000rpm、20min进行离心收菌；
47.5)均用磷酸盐缓冲液洗菌，6000rpm、15min进行离心收菌，去上清，重复此步骤2至3遍；
48.6)均用一定体积的磷酸盐缓冲液重悬至菌浓相同，然后利用高压破碎机进行菌悬液的破碎，将破碎后的细胞裂解液在12000rpm下离心30min；分别取一定体积的裂解液、上清以及沉淀去跑sds
‑
page；
49.7)将跑好之后的蛋白胶进行染色和脱色，最后分析蛋白条带。
50.结果如图1所示，菌株vmax
‑
1在37℃的温度下诱导4小时后，大部分蛋白都在上清中表达，并且其蛋白表达量的水平与大肠杆菌在16℃的温度下诱导16至20小时的水平相当；而菌株bl21
‑
1在37℃的温度下诱导则大部分蛋白都形成了包涵体，表明了需钠弧菌拥有在高温下快速表达蛋白的能力。
51.通过测定两株重组菌株在相同条件下生成的左旋多巴的产量，来比较两株菌株的催化能力，菌株vmax
‑
1生成的左旋多巴的产量要高出菌株bl21
‑
1两倍，表明了菌株vmax
‑
1的催化速率要快于bl21
‑
1，体现出需钠弧菌在全细胞催化方面具有催化速率快的特点。
52.试验例2、诱导时长对蛋白表达量的影响
53.其步骤为：
54.1.重组需钠弧菌构建：具体操作步骤参照实验例1。
55.2.重组需钠弧菌vmax
‑
1蛋白表达
56.1)将菌株vmax
‑
1甘油管从
‑
80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5ml lb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm培养进行活化；
57.2)将活化后的菌液以1％的接种量分别接种到30ml lb3培养基中，37℃，200rpm培养进行二次活化；
58.3)将活化后vmax
‑
1菌液以1％的接种量接种到1l lb3培养基中，37℃，200rpm培养，待od
600
达到0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.5mm，在37℃下诱导0
‑
6小时，再以4000rpm、20min进行离心收菌；；
59.4)用磷酸盐缓冲液洗菌，6000rpm、15min进行离心收菌，去上清，重复此步骤2至3遍；
60.5)用一定体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体，将重悬的菌液加入到50ml反应体系中并稀释至od
600
等于20，反应体系包括磷酸盐缓冲液，5g/l邻苯二酚，8g/l丙酮酸钠，50g/l醋酸铵，2g/l亚硫酸钠，1g/l edta
‑
2na,1mm磷酸吡哆醛，催化反应在30℃、ph＝8.0、200rpm的条件下反应1小时后，加入等体积的4m的盐酸终止反应。
61.结果表明，在37℃条件下诱导4小时后，其可溶性蛋白表达的水平达到最高；而随着诱导时间的延长，所形成的包涵体逐渐增多，因此选择37℃下诱导4小时为最佳诱导时长。
62.试验例3、全细胞催化反应体系最佳初始底物浓度的测定
63.其步骤为：
64.1.重组需钠弧菌构建：具体操作步骤参照实验例1。
65.2.重组需钠弧菌vmax
‑
1蛋白表达
66.1)将菌株vmax
‑
1甘油管从
‑
80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5ml lb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm培养进行活化；
67.2)将活化后的菌液以1％的接种量分别接种到30ml lb3培养基中，37℃，200rpm培养进行二次活化；
68.3)将活化后vmax
‑
1菌液以1％的接种量接种到1l lb3培养基中，37℃，200rpm培养，待od
600
达到0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.5mm，在37℃下诱导4小时，再以4000rpm、20min进行离心收菌；；
69.4)用磷酸盐缓冲液洗菌，6000rpm、15min进行离心收菌，去上清，重复此步骤2至3遍；
70.5)用磷酸盐缓冲液重悬菌体，将重悬的菌液加入到50ml反应体系中并稀释至od
600
等于20，反应体系包括磷酸盐缓冲液，2g/l亚硫酸钠,1g/l edta
‑
2na,1mm磷酸吡哆醛，5g/l至15g/l邻苯二酚,5g/l至15g/l丙酮酸钠,25g/l至125g/l醋酸铵；催化反应在30℃、ph＝8.0、200rpm的条件下反应1小时后，加入等体积的4m的盐酸终止反应；通过测定不同浓度下的三种底物对应的左旋多巴的产量，以确定出最佳初始底物浓度。
71.最终，通过比较发现，最佳初始底物浓度分别是7.5g/l邻苯二酚,10g/l丙酮酸钠,50g/l醋酸铵。
72.试验例4、全细胞催化反应体系最佳温度的测定
73.其步骤为：
74.1.重组需钠弧菌构建：具体操作步骤参照实验例1。
75.2.重组需钠弧菌vmax
‑
1蛋白表达
76.1)将菌株vmax
‑
1甘油管从
‑
80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5ml lb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm培养进行活化；
77.2)将活化后的菌液以1％的接种量分别接种到30ml lb3培养基中，37℃，200rpm培养进行二次活化；
78.3)将活化后vmax
‑
1菌液以1％的接种量接种到1l lb3培养基中，37℃，200rpm培养，待od
600
达到0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.5mm，在37℃下诱导4小时，再以4000rpm、20min进行离心收菌；；
79.4)用磷酸盐缓冲液洗菌，6000rpm、15min进行离心收菌，去上清，重复此步骤2至3遍；
80.5)用磷酸盐缓冲液重悬菌体，将重悬的菌液加入到50ml反应体系中并稀释至od
600
等于20，反应体系包括磷酸盐缓冲液，7.5g/l邻苯二酚,10g/l丙酮酸钠,50g/l醋酸铵，2g/l亚硫酸钠,1g/l edta
‑
2na,1mm磷酸吡哆醛；催化反应在不同温度下，包括20℃、30℃、37℃和50℃，ph＝8.0、200rpm的条件下反应1小时后，加入等体积的4m的盐酸终止反应；通过测定不同温度下对应的左旋多巴的产量，以确定出不同温度下的催化速率的大小；
81.通过对不同温度下催化速率以及休止细胞催化的稳定性的综合比较，尽管37℃条件下的催化速率最高，但其稳定性不好，20℃下的稳定性为最佳，再考虑到其他因素对催化速率的影响，最终决定选择20℃为最佳催化反应温度。
82.试验例5、全细胞催化反应体系最佳ph的测定
83.其步骤为：
84.1.重组需钠弧菌构建：具体操作步骤参照实验例1。
85.2.重组需钠弧菌vmax
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1蛋白表达
86.1)将菌株vmax
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1甘油管从
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80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5ml lb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm培养进行活化；
87.2)将活化后的菌液以1％的接种量分别接种到30ml lb3培养基中，37℃，200rpm培养进行二次活化；
88.3)将活化后vmax
‑
1菌液以1％的接种量接种到1l lb3培养基中，37℃，200rpm培养，待od
600
达到0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.5mm，在37℃下诱导4小时，再以4000rpm、20min进行离心收菌；；
89.4)用磷酸盐缓冲液洗菌，6000rpm、15min进行离心收菌，去上清，重复此步骤2至3遍；
90.5)用一定体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体，将重悬的菌液加入到50ml反应体系中并稀释至od
600
等于20，反应体系包括磷酸盐缓冲液，7.5g/l邻苯二酚,10g/l丙酮酸钠,50g/l醋酸铵，2g/l亚硫酸钠,1g/l edta
‑
2na,1mm磷酸吡哆醛；催化反应的条件为20℃、200rpm，通过不同的缓冲液调整ph值的范围从4.5至10.5，反应1小时后，加入等体积的4m的盐酸终止反应；通过测定不同ph条件下左旋多巴的产量，以确定出不同ph条件下的催化速率的大小。
91.通过对不同ph条件下左旋多巴产量的比较，如图2所示，发现在磷酸盐缓冲液ph＝8.0时，催化速率达到最高，即选择磷酸盐缓冲液ph＝8.0为最佳催化反应ph。
92.试验例6、全细胞催化反应体系补料策略的确定
93.1.重组需钠弧菌构建：具体操作步骤参照实验例1。
94.2.重组需钠弧菌vmax
‑
1蛋白表达
95.1)将菌株vmax
‑
1甘油管从
‑
80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5ml lb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm培养进行活化；
96.2)将活化后的菌液以1％的接种量分别接种到30ml lb3培养基中，37℃，200rpm培养进行二次活化；
97.3)将活化后vmax
‑
1菌液以1％的接种量接种到1l lb3培养基中，37℃，200rpm培养，待od
600
达到0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.5mm，在37℃下诱导4小时，再以4000rpm、20min进行离心收菌；；
98.4)用磷酸盐缓冲液洗菌，6000rpm、15min进行离心收菌，去上清，重复此步骤2至3遍；
99.5)用磷酸盐缓冲液重悬菌体，将重悬的菌液加入到50ml反应体系中并稀释至od
600
等于20，反应体系包括磷酸盐缓冲液，7.5g/l邻苯二酚,10g/l丙酮酸钠,50g/l醋酸铵，2g/l亚硫酸钠,1g/l edta
‑
2na,1mm磷酸吡哆醛；催化反应的条件为20℃、ph＝8.0、200rpm，每隔一段时间进行取样，加入等体积的4m的盐酸终止反应；通过测定不同时间点的底物邻苯二酚的剩余量以及产物左旋多巴的产量，以确定出连续补料催化的补料策略。
100.通过测定，该催化体系在1小时左右就消耗尽了邻苯二酚，为维持底物浓度在最佳水平，前期采取了每小时补加7g/l邻苯二酚、7g/l丙酮酸钠和5.6g/l醋酸铵的策略，后期由于催化速率的下降，将补料策略调整为每小时补加3.5g/l邻苯二酚、3.5g/l丙酮酸钠和2.8g/l醋酸铵。
101.试验例7、需钠弧菌全细胞催化连续补料实验
102.其步骤为：
103.1.重组需钠弧菌构建：具体操作步骤参照实验例1。
104.2.重组需钠弧菌vmax
‑
1蛋白表达
105.1)将菌株vmax
‑
1甘油管从
‑
80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5ml lb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm培养进行活化；
106.2)将活化后的菌液以1％的接种量分别接种到30ml lb3培养基中，37℃，200rpm培养进行二次活化；
107.3)将活化后vmax
‑
1菌液以1％的接种量接种到1l lb3培养基中，37℃，200rpm培养，待od
600
达到0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.5mm，在37℃下诱导4小时，再以4000rpm、20min进行离心收菌；；
108.4)用磷酸盐缓冲液洗菌，6000rpm、15min进行离心收菌，去上清，重复此步骤2至3遍；
109.5)用一定体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体，将重悬的菌液加入到1l生物反应器中并稀释至od
600
等于20，反应体系包括磷酸盐缓冲液，7.5g/l邻苯二酚,10g/l丙酮酸钠,50g/l醋酸铵，2g/l亚硫酸钠,1g/l edta
‑
2na,1mm磷酸吡哆醛；催化反应的条件为20℃、ph＝8.0、200rpm，每隔一段时间进行取样，加入等体积的4m的盐酸终止反应；测定不同时间点的底物邻苯二酚的剩余量以及产物左旋多巴的产量，以确定需钠弧菌全细胞催化补料实验的过程情况。
110.结果表明，如图3所示，利用需钠弧菌进行全细胞催化生产，催化反应一共持续了10小时，左旋多巴的浓度达到了54g/l左右，底物邻苯二酚的转化率达到了95％，反应前期的产率甚至超过了10g/l/h，是先前水平的两倍，展现出快速的催化速率；表明了需钠弧菌能够作为一种新型全细胞催化底盘的潜力。
111.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。