工程化免疫细胞的制作方法

1.本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及表达双靶点嵌合抗原受体的工程化免疫细胞，及其在治疗疾病中的用途。


背景技术：

2.近几年，癌症免疫治疗技术发展迅速，尤其是嵌合抗原受体t细胞(car-t)相关的免疫疗法，作为一种新型的过继性免疫治疗技术，已经在多种实体肿瘤和血液肿瘤的治疗中显示出非常显著的临床疗效。
3.然而，car-t细胞在临床应用中仍然面临很大的挑战，其中困难之一就在于免疫排斥。当外源性的car-t细胞进入患者体内时，会激活患者体内的免疫系统，引起免疫细胞例如t细胞、nk细胞等的杀伤，进而影响car-t细胞的存活和持久性，最终影响car-t细胞的治疗效果。
4.因此，本发明旨在提供一种同时靶向肿瘤抗原和cd5的双靶点工程化细胞，其一方面可以通过靶向肿瘤抗原对肿瘤细胞进行杀伤，另一方面也可以通过靶向t细胞标志物cd5对患者体内t细胞进行一定程度的杀伤，进而降低免疫排斥的风险。


技术实现要素：

5.在一个方面，本发明提供一种同时靶向cd5和肿瘤抗原的工程化免疫细胞，其包含靶向cd5的抗体和靶向肿瘤抗原的抗体。
6.在一个实施方案中，所述靶向cd5的抗体和所述靶向肿瘤抗原的抗体位于同一嵌合抗原受体中。在该实施方案中，所述靶向cd5的抗体和所述靶向肿瘤抗原的抗体通过接头连接，优选地，所述接头包含(g4s)n，其中n为1、2、3、4、5或6，或者所述接头包含氨基酸序列(eaaak)n或由其组成，其中n为1、2、3、4、5或6。
7.在另一个实施方案中，所述靶向cd5的抗体和所述靶向肿瘤抗原的抗体位于两个不同的嵌合抗原受体中。在该实施方案中，所述两个不同的嵌合抗原受体可以位于同一载体(例如，通过2a肽连接)或位于不同载体中。
8.在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。
9.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζ亚基、cd3ε亚基、cd3γ亚基、cd3δ亚基、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。
10.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的初级信号传导结构域选自以下蛋白的胞内区：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。
11.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还包含一个或多个共刺激结构域，其选自以下蛋白质的胞内区：cd94、ltb、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、
tlr10、card11、cd2、cd7、cd8、cd18、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd270(hvem)、cd272(btla)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、cd357(gitr)、dap10、dap12、lat、nkg2c、slp76、pd-1、light、trim、zap70以及它们的组合。
12.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的抗体选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fd
′
、fv、scfv、sdfv、单域抗体和纳米抗体；优选选自scfv、单域抗体和纳米抗体。
13.在一个实施方案中，本发明的肿瘤抗原选自：cd2、cd3、cd4、cd7、cd8、cd14、cd15、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd24、cd25、cd30、cd33、cd37、cd38、cd40、cd40l、cd44、cd46、cd47、cd52、cd54、cd56、cd70、cd73、cd80、cd97、cd123、cd126、cd138、cd171、cd 179a、dr4、dr5、tac、tem1/cd248、vegf、gucy2c、egp40、egp-2、egp-4、cd133、ifnar1、dll3、kappa轻链、tim3、tshr、cd19、baff-r、cll-1、egfrviii、tegfr、gd2、gd3、bcma、tn抗原、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、il-llra、il-22ra、il-2、间皮素、psca、prss21、vegfr2、lewisy、pdgfr-β、ssea-4、afp、folate受体α、erbb2(her2/neu)、erbb3、erbb4、muc1、muc16、egfr、cs1、ncam、claudin18.2、c-met、prostase、pap、elf2m、ephrin b2、igf-i受体、caix、lmp2、gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、fucosyl gml、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、o-乙酰基-gd2、folate受体β、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、alk、多聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-la、mage-a1、mage-a3、mage-a6、豆荚蛋白、hpv e6、e7、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie 2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、psa、存活蛋白和端粒酶、pcta-l/galectin 8、melana/martl、ras突变体、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、tmprss2 ets融合基因、na17、pax3、雄激素受体、孕酮受体、cyclin bl、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b 1、boris、sart3、pax5、oy-tes 1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5、igll1、pd1、pdl1、pdl2、tgfβ、april、nkg2d、nkg2d配体，和/或病原体特异性抗原、生物素化分子、由hiv、hcv、hbv和/或其他病原体表达的分子；和/或新表位或新抗原。优选地，所述肿瘤抗原选自cd7、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd123、cd138、cd171、muc1、afp、folate受体α、cea、psca、psma、her2、egfr、il13ra2、gd2、nkg2d、claudin18.2、ror1、egfrviii、cs1、bcma、gprc5d和间皮素，更优选选自cd19、claudin18.2和bcma。
14.在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞是b细胞、t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞或nkt细胞。
15.在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞衍生自干细胞。
16.在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞的内源性cd5的表达被抑制或沉默。
17.在一个实施方案中，本发明的r/cd3基因的表达被抑制或沉默，所述tcr/cd3基因选自trac、trbc、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ和它们的组合。
18.在一个实施方案中，本发明的所述工程化免疫细胞进一步包含至少一种mhc-ii类相关基因的表达被抑制或沉默，所述mhc-ii类相关基因选自：hla-dpa、hla-dq、hla-dra、rfx5、rfxap、rfxank、ciita和它们的组合。
19.在一个方面，本发明还提供一种载体，其包含编码靶向cd5和肿瘤抗原的嵌合抗原受体的核酸序列，其中所述嵌合抗原受体的抗原结合区包含靶向cd5的抗体和靶向肿瘤抗
原的抗体。
20.在一个方面，本发明还一种载体系统，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含编码靶向cd5的嵌合抗原受体的第一核酸序列和编码靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列位于相同或不同的载体。
21.还在另一个方面，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的工程化免疫细胞或组合物，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。
22.发明详述
23.除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。
24.嵌合抗原受体
25.如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括抗原结合区(例如抗体或其抗原结合部分)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域)，各个结构域之间通过接头连接。car能够利用抗体的抗原结合特性以非mhc限制性的方式将t细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。非mhc限制性的抗原识别给予表达car的免疫细胞与抗原处理无关的识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。
26.在一个实施方案中，本发明提供一种同时靶向cd5和肿瘤抗原的工程化免疫细胞，其包含靶向cd5的抗体和靶向肿瘤抗原的抗体，其中所述靶向cd5的抗体和所述靶向肿瘤抗原的抗体位于同一嵌合抗原受体(“串联”)或位于两个不同的嵌合抗原受体(“并联”)中。因此，在本文中，“串联”是指靶向cd5的抗体和靶向肿瘤抗原的抗体位于同一个嵌合抗原受体结构中，构成其中的抗原结合区。换言之，在“串联”的情况下，工程化免疫细胞表达一个同时靶向cd5和肿瘤抗原的嵌合抗原受体，其包含：(1)抗原结合区，包含靶向cd5的抗体和靶向肿瘤抗原的抗体；(2)跨膜结构域；和(3)胞内信号传导结构域。本领域技术人员知晓，在串联形式下，靶向cd5的抗体和靶向肿瘤抗原的抗体可以以任何顺序连接。并且，当两个抗体均为scfv时，还可以以例如以下顺序连接(从n端至c端)：vl1-vl2-接头-vh2-vh1、vl2-vl1-接头-vh1-vh2。
27.在本文中，“并联”是指靶向cd5的抗体和靶向肿瘤抗原的抗体位于两个不同的嵌合抗原受体结构，其可以位于同一载体(例如，通过2a肽将两个嵌合抗原受体结构连接，使其分别表达)，或位于不同载体(例如，每个载体包含一个靶向cd5或肿瘤抗原的嵌合抗原受体结构，然后将两个载体一起导入免疫细胞)。换言之，在“并联”的情况下，工程化免疫细胞表达两个嵌合抗原受体，其分别靶向cd5和肿瘤抗原。即，该工程化免疫细胞包含：(1)靶向cd5的第一嵌合抗原受体，包含靶向cd5的抗体、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；和(2)靶向肿瘤抗原的第二嵌合抗原受体，包含靶向肿瘤抗原的抗体、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。任选地，所述第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体位于同一载体或不同载体。
28.如本文所用，术语“抗体”具有本领域技术人员所理解的最广泛的含义，并且包括单克隆抗体(包含完整抗体)、多克隆抗体、多价抗体、和能够表现期望的生物活性的携带一个或多个cdr序列的抗体片段或合成多肽。本发明所述抗体可为任何种类(例如igg、ige、igm、igd、iga等)或亚类(例如igg1、igg2、igg2a、igg3、igg4、iga1、iga2等)。本发明的抗体也包含重组抗体、人抗体、人源化抗体、驼源抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其抗原结合部分。
29.如本文所用，“抗体片段”或“抗原结合部分”是指完整抗体的一部分，一般包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。本发明中的抗体片段的实例包括但不限于：fab、fab'、f(ab')2、fd片段、fd
′
、fv片段、scfv、二硫键-连接的fv(sdfv)、抗体的重链可变区(vh)或轻链可变区(vl)、线性抗体、具有两个抗原结合位点的“双体”、单域抗体、纳米抗体、所述抗原的天然配体或其功能性片段等。因此，本发明的“抗体”涵盖如上定义的抗体的抗体片段或抗原结合部分。
30.通常，完整抗体包括通过二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链，每条轻链通过二硫键被连至各自的重链，呈“y”形结构。每条重链包含重链可变区(vh)和重链恒定区，其中重链可变区包含三个互补决定区(cdr)：cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，重链恒定区包含三个恒定结构域：ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区，其中轻链可变区包含三个cdr：cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，轻链恒定区包含一个恒定结构域cl。在重链/轻链可变区中，cdr被更保守的框架区(fr)隔开。重链/轻链的可变区负责与抗原的识别和结合，恒定区则可以介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分。
31.在一个实施方案中，本发明的抗体选自完整抗体、fab、fab'、f(ab')2、fd、fd
′
、fv、scfv、sdfv、单域抗体和纳米抗体，优选选自fab、fab'、f(ab')2、scfv、单域抗体和纳米抗体，更优选选自scfv、单域抗体和纳米抗体。
32.在一个实施方案中，本发明的靶向cd5的抗体可以源自本领域已知的任何抗体，例如oehler et al,1998,j.exp.med.,187(7):1019-1028中公开的5d7、wo2010022737a1中公开的1d8、3i21、4h10、8j23、5o4、4h2、5g2、8g8、6m4、2e3、4e24、4f10、7j9、7p9、8e24、6l18、7h7、1e7、8j21、8m9、1p21、2h11、3m22、5m6、5h8、7i19、1a20、8e15、8c10、3p16、4f3、5m24、5o24、7b16、1e8、2h16，以及源自这些抗体的嵌合抗体、人源化抗体等，其中上述文献的全部内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，靶向cd5的抗体包含如seq id no：1所示的vl-cdr1、如seq id no：2所示的vl-cdr2、如seq id no：3所示的vl-cdr3、如seq id no：4所示的vh-cdr1、如seq id no：5所示的vh-cdr2和如seq id no：6所示的vh-cdr3。在一个实施方案中，靶向cd5的抗体包含与seq id no：7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区和与seq id no：8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区。优选地，靶向cd5的抗体与seq id no：9具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
33.在一个实施方案中，本发明的靶向肿瘤抗原的抗体是靶向cd19的抗体，其可以源自或是本领域已知的任何抗体，例如hb12a、hb12b、hd37、b43、fmc63、4g7(cn105535967a)，hi19a(cn1775808a)，21d4、21d4a、47g4、27f3、3c10、5g7、13f1、46e8(cn101233156a)，mab381、mab396(wo2011147834)，以及源自这些抗体的嵌合抗体、人源化抗体等；其中上述文献的全部内容通过引用并入本文。在一个优选的实施方案中，本发明的靶向cd19的抗体包含包含如seq id no：10所示的vl-cdr1、如seq id no：11所示的vl-cdr2、如seq id no：12所示的vl-cdr3、如seq id no：13所示的vh-cdr1、如seq id no：14所示的vh-cdr2和如seq id no：15所示的vh-cdr3。在一个实施方案中，靶向cd5的抗体包含与seq id no：16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可
变区和与seq id no：17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区。优选地，靶向cd5的抗体与seq id no：18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
34.在一个实施方案中，本发明的靶向肿瘤抗原的抗体是靶向bcma的抗体，其可以源自或是本领域已知的任何抗体，例如a7d12.2、c11d5.3、c12a3.2、c13f12.1(wo2010104949)；320199、319883、319952、320262、319966、320111(wo2019164891)；sg1116(cn112409482a)；m1(wo2021018168)；2a1、29c12、11f12、1e1、30e1、32b5、33c 7、32h3、33d4、35d2、37b2、40d7(us10220090b2)；fs-21495、pc-21497、aj-21508、nm-21517、ts-21522、ry-21527、pp-21528、rd-21530(us10689450b2)；15b2gl、i09、l15、m02、n22、p10(us10988546b2)；sct-aa01、sct-aa02、sct-aa03、sct-aa04、sct-aa05、sct-aa06、sct-aa07、sct-aa08、sct-aa09、sct-aa10、sct-aa11、sct-aa12、sct-aa13、sct-aa14、sct-aa15、sct-aa16、sct-aa17、sct-aa18、sct-aa19(wo2020073917)；et140-42、et140-47、et140-30、et140-22、et140-7、et140-3、et140-51、et140-17、et140-13、et140-57、et140-15、et140-38、et140-46、et140-54、et140-40、et140-37、et140-24(us10947314b2)、cn112028996a中公开的那些，以及源自这些抗体的嵌合抗体、人源化抗体等，其中上述文献的全部内容通过引用并入本文。在一个优选的实施方案中，本发明的靶向bcma的抗体是纳米抗体，其包含如seq id no：19所示的cdr1、如seq id no：20所示的cdr2、如seq id no：21所示的cdr3。在一个实施方案中，本发明的靶向bcma的抗体与seq id no：22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
35.在一个实施方案中，本发明的靶向肿瘤抗原的抗体是靶向claudin18.2的抗体，其可以源自或是本领域已知的任何抗体，例如cn108047331a中公开的43-14a和35-22，ep2852409中公开的43a11、163e12、125e1、166e2、175d10、45c1，cn112912396a中公开的1d10、2f12、3f2、5f9、9f3、10b11、27b5、37b1、44a8、44f7，cn111434692a中公开的c18-6、c18-7、c18-15、c18-19、c18-20、c18-28、c18-32、c18-69，cn202110590801.8中公开的人源化纳米抗体，cn112574307a中公开的11m23、16k15、18b21、20l17、43b5、43l6、46j05、48g12、50c14、52e22、8k13，cn112707965a中公开的hbm1029，cn113166246a中公开的1e9.2、2c6.9、6b9.22、9c8.1、16a9.11、19g10.14、19h11.6，wo2020160560中公开的23个鼠源抗体和18个人源化抗体，wo2020200196中公开的mab1901和mab1902，wo2021008463中公开的18.2-a1(a1)、18.2-a2(a2)、18.2-a3(a3)、18.2-a4(a4)、18.2-a5(a5)和18.2-a6(a6)，wo2021032157中公开的7c12、11f12、12e9、26g6、59a9、18b10、12c12，以及源自这些抗体的嵌合抗体、人源化抗体等，其中上述文献的全部内容通过引用并入本文。在一个优选的实施方案中，本发明的靶向claudin18.2的抗体是纳米抗体，其包含如seq id no：23所示的cdr1、如seq id no：24所示的cdr2、如seq id no：25所示的cdr3。在一个实施方案中，本发明的靶向bcma的抗体与seq id no：26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
36.术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。
37.如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和pcr介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。
38.因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。
39.如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如blast(altschul等(1997)nucleic acids res.25：3389-3402)、blast2(altschul等(1990)j.mol.biol.215：403-410)、smith-waterman(smith等(1981)j.mol.biol.147：195-197)和clustalw。
40.如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞(例如淋巴细胞、nk细胞或nkt细胞)表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζ亚基、cd3ε亚基、cd3γ亚基、cd3δ亚基、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自cd8α链或cd28，其与seq id no:31或32所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
41.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于抗原结合区和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至抗原结合区的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为抗原结合区提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自cd8、cd4或cd28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含cd8α链、cd28、fcγriiiα受体、igg4或igg1的铰链区部分，更优选来自cd8α、cd28或igg4的铰链，其与seq id no:39、40或41所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％
或100％的序列同一性。
42.如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分，其包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。胞内信号传导结构域负责在抗原结合区结合抗原以后的细胞内的信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达car的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
43.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的初级信号传导结构域可以是t细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。初级信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,itam)。本发明的初级信号传导结构域的非限制性施例包括但不限于fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的胞内区。在优选的实施方式中，本发明car的信号传导结构域可以包含cd3ζ胞内区，其与seq id no:35或36所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
44.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还包含一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在t细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导t细胞的共刺激反应(例如增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于1类mhc分子、btla和toll配体受体。本发明的共刺激结构域的非限制性施例包括但不限于以下蛋白质的胞内区：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd8、cd18、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd270(hvem)、cd272(btla)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、cd357(gitr)、dap10、dap12、lat、nkg2c、slp76、pd-1、light、trim、cd94、ltb以及zap70以及它们的组合。
45.在一个优选的实施方案中，所述共刺激结构域包含一个或多个选自以下蛋白质的胞内区：dap10、dap12、cd27、cd28、cd134、4-1bb或cd278。例如，在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1bb的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含cd28的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1bb的胞内区和cd28的胞内区。
46.在一个实施方案中，4-1bb的胞内区与seq id no:34所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，cd28的胞内区与seq id no:33所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
47.在一个实施方案中，本发明的car还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如t细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自cd8α、igg1、gm-csfrα、b2m等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发
明的信号肽来自b2m或cd8α，其与seq id no:37或38所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
48.在一些实施方案中，本发明的car还包含接头，其用于隔开任何本文中所述的结构域/区。例如，接头可位于信号肽与抗原结合区之间、抗体的vh与vl之间、抗原结合区与铰链区之间、铰链区与跨膜结构域之间、侧接共刺激结构域或在共刺激结构域的n-或c-区上、和/或在跨膜结构域与初级信号传导结构域之间。接头可以是长度为约6至约40个氨基酸、或长度为约6至约25个氨基酸的肽。本领域常用的接头序列包括例如seq id no：27和seq id no：28。
49.可容易地选择具有任何合适长度的接头，例如1个氨基酸(例如gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
50.示例性的接头包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(gs)n、(gsggs)n、(g4s)n和(gggs)n，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。示例性的接头包括但不限于ggsg、ggsgg、gsgsg、gsggg、gggsg、gsssg、(g4s)3等。
51.在另一些实施方案中，接头包含(eaaak)n，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
52.在一个实施方案中，本发明的car还可以包含开关结构，以调控car的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外的抗原结合区，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构分别连接抗原结合区和信号传导结构域，仅当开关结构互相结合(例如在诱导化合物的存在下)时，抗原结合区和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外的抗原结合区，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外的抗原结合区，使其成为一个“普通”的car结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。
53.在一个实施方案中，本发明的car还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时(例如产生严重的毒副作用时)清除car细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如cd20表位、rqr8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除car细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)，该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是icaspase-9，可以通过化学诱导药物如ap1903、ap20187等诱导icaspase-9发生二聚化，从而激活下游的caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。
54.载体和载体系统
55.本发明还提供一种载体，其包含编码靶向cd5和肿瘤抗原的嵌合抗原受体的核酸序列，其中所述嵌合抗原受体的抗原结合区包含靶向cd5的抗体和靶向肿瘤抗原的抗体。
56.本发明还提供一种载体系统，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含编码靶向cd5的嵌合抗原受体的第一核酸序列和编码靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的第二核酸序列，所述第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或不同载体。
57.一个实施方案中，编码靶向cd5的第一嵌合抗原受体多肽的第一核酸序列和编码靶向肿瘤抗原的第二嵌合抗原受体的第二核酸序列位于同一载体。例如，可以通过在两个核酸序列之间插入编码2a肽的核酸，使得两个嵌合抗原受体结构可以独立表达而互不影响。如本文所用，术语“2a肽”是一种cis-水解酶作用元件(chysels)，最初在口蹄疫病毒(fmdv)中发现。2a肽的平均长度为18～22氨基酸。在蛋白翻译时，2a肽可以通过核糖体跳跃从自身最后2个氨基酸c末端断裂。具体地，甘氨酸和脯氨酸之间的肽链结合群在2a位点是受损的，能引发核糖体跳跃而从第2个密码子开始翻译，从而使1个转录单元里的2个蛋白独立表达。这种2a肽介导的剪切广泛存在于真核动物细胞中。利用2a肽较高的剪切效率及促使上下游基因平衡表达的能力，可以改进异源多聚蛋白(如细胞表面受体、细胞因子、免疫球蛋白等)的表达效率。常规2a肽包含：p2a、t2a、e2a、f2a等。在另一个实施方案中，编码靶向cd5的第一嵌合抗原受体多肽的第一核酸序列和编码靶向肿瘤抗原的第二嵌合抗原受体的第二核酸序列位于不同载体。
58.如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。
59.载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的fc融合多肽或嵌合受体多肽的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mrna的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于线性核酸分子(例如dna或rna)、质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(rsv、多瘤病毒和腺相关病毒(aav)等)、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括bac和yac)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的dna序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，mcs)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾(polya)、3’utr、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。
60.工程化免疫细胞
61.本发明还提供一种工程化免疫细胞，其包含如上所述的载体或载体系统，或如上所述的嵌合抗原受体。
62.本发明还提供一种组合物，其包含：(1)表达第一嵌合抗原受体的第一工程化免疫细胞群，所述第一嵌合抗原受体包含靶向cd5的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和(2)表达第二嵌合抗原受体的第二工程化免疫细胞群，所述第二嵌合抗原受体包含靶向肿瘤抗原的抗体、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在该实施方案中，第一工程化免疫细胞群和第二工程化免疫细胞群可以同时或顺次向受试者施用。
63.如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导adcc和/或cdc)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是b细胞、t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞和/或nkt细胞，或者是衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等的免疫细胞。优选地，免疫细胞是t细胞。t细胞可以是任何t
细胞，如体外培养的t细胞，例如原代t细胞，或者来自体外培养的t细胞系例如jurkat、supt1等的t细胞，或获得自受试者的t细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。t细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。t细胞也可以被浓缩或纯化。t细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，cd4+cd8+t细胞、cd4+辅助t细胞(例如th1和th2细胞)、cd8+t细胞(例如，细胞毒性t细胞)、cd4-cd8-t细胞、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞、αβ-t细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人t细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如ficoll分离受试者的血液获得t细胞。采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将编码嵌合抗原受体多肽的核酸序列引入免疫细胞。
64.将核酸或载体引入免疫细胞后，本领域技术人员可以通过常规技术对所得免疫细胞进行扩增和活化。
65.在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞还包含内源性cd5的表达被抑制或沉默。由于cd5在大多数t细胞表面表达，抑制或沉默工程化免疫细胞的内源性cd5可以避免其互相杀伤。
66.在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞还包含至少一种tcr/cd3基因的表达被抑制或沉默。所述tcr/cd3基因选自trac、trbc、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ和它们的组合。在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞进一步包含至少一种mhc-ii类相关基因的表达被抑制或沉默，所述mhc-ii类相关基因选自：hla-dpa、hla-dq、hla-dra、rfx5、rfxap、rfxank、ciita和它们的组合。
67.药物组合物
68.本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞作为活性剂，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。
69.如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington's pharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19th ed.pennsylvania:mack publishing company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。
70.根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。
71.根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用
方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的免疫细胞的药物组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。
72.根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠ii(sorfimer sodiumphotofrin ii)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀e(auristatin e)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素a、dna酶和rna酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗cd3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。
73.治疗应用
74.本发明还提供一种治疗患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。因此，本发明还涵盖所述工程化免疫细胞以及药物组合物在制备治疗与肿瘤抗原表达相关的疾病(例如癌症，如血液肿瘤或实体瘤)的药物中的用途。
75.在一个实施方案中，所述免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选b细胞、t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞和/或nkt细胞，更优选t细胞、nk细胞或nkt细胞。
76.在一个实施方案中，所述与肿瘤抗原表达相关的疾病是癌症，例如血液肿瘤或实体瘤，包括但不限于：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和cns癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(gbm)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)、小淋巴细胞性(sl)nhl、中间级/滤泡性nhl、中间级扩散性nhl、高级成免疫细胞性nhl、高级成淋巴细胞性nhl、高级小型非裂化细胞性nhl、大肿块病nhl)、b淋巴母细胞淋巴瘤(b-lbl)、套细胞淋巴瘤、aids相关淋巴瘤、以及waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)、b细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(cml)、恶性淋巴组织增生疾病、malt淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(ptld)；以及其他与靶标表达有关的疾病。优选地，
可以用本发明的工程化免疫细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌等。
77.下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
附图说明
78.图1：示出了单靶car-t细胞中|car的表达水平。
79.图2：示出了双靶car-t细胞中|car的表达水平。
80.图3：示出了cd5和cd19双靶car-t细胞对raji和jurkat靶细胞的杀伤效果。
81.图4：示出了cd5和bcma双靶car-t细胞对k562-bcma和jurkat靶细胞的杀伤效果。
82.图5：示出了cd5和claudin18.2双靶car-t细胞对nugc4-18.2和jurkat靶细胞的杀伤效果。
83.图6：示出了cd5和cd19双靶car-t细胞与raji和jurkat靶细胞共培养后的ifnγ释放水平。
84.图7：示出了cd5和bcma双靶car-t细胞与k562-bcma和jurkat靶细胞共培养后的ifnγ释放水平。
85.图8：示出了cd5和claudin18.2双靶car-t细胞与nugc4-18.2和jurkat靶细胞共培养后的ifnγ释放水平。
具体实施方式
86.实施例1.制备car t细胞
87.合成编码以下蛋白的序列，并将其依次克隆至plvx载体(public protein/plasmid library(ppl)，货号:ppl00157-4a)：cd8α信号肽(seq id no：38)、抗cd5抗体(seq id no：9)、接头(seq id no：29)、抗cd19抗体(seq id no：18)或抗bcma抗体(seq id no：22)或抗claudin18.2抗体(seq id no：26)、cd8α铰链区(seq id no：39)、cd8α跨膜区(seq id no：31)、4-1bb胞内区(seq id no：34)、cd3ζ初级信号传导结构域(seq id no：35)，并通过测序确认目标序列的正确插入，获得表达cd5+cd19、cd5+bcma或cd5+claudin18.2双靶的car质粒。
88.在无菌管中加入3ml opti-mem(gibco，货号31985-070)稀释上述质粒后，再根据质粒:病毒包装载体：病毒包膜载体＝4:2:1的比例加入包装载体pspax2(addgene，货号12260)和包膜载体pmd2.g(addgene，货号12259)。然后，加入120ul x-treme gene hp dna转染试剂(roche，货号06366236001)，立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293t细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，超速离心(25000g，4℃，2.5小时)获得浓缩的慢病毒。
89.用dynabeads cd3/cd28 cts
tm
(gibco,货号40203d)激活野生型t细胞，并在37℃和5％co2下继续培养1天。然后采用crispr系统敲除野生型t细胞中的tcr/cd3组分(具体为trac基因)和cd5基因，获得tcr/cd5双敲除的dko-t细胞。将浓缩的慢病毒加入dko-t细胞，持续扩增培养，获得双靶的car5-19 t细胞、car5-bcma t细胞和car5-18.2t细胞。
90.用同样的方法制备仅针对cd5、cd19、bcma或claudin18.2单靶的car质粒，并将其转入dko-t细胞，获得单靶的car-t细胞。
91.培养第12天，使用biotin-sp(long spacer)affinipure goat anti-mouse igg,f(ab')2fragment specific(min x hu,bov,hrs sr prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)或biotin-sp(long spacer)affinipure goat anti-human igg,f(ab')2fragment specific(min x hu,bov,hrs sr prot)(jackson immunoresearch，货号109-065-097)作为一抗，apc streptavidin(bd pharmingen，货号554067)或pe streptavidin(bd pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测相应单靶和双靶car-t细胞上car分子表达水平，结果如图1和图2所示。
92.可以看出，本发明制备的car t细胞中的car均可以有效表达。
93.实施例2：car t细胞对靶细胞的杀伤效果
94.为了检测car-t细胞对靶细胞的杀伤能力，首先以1x104/孔将携带荧光素基因的各种靶细胞(cd5阳性的jurkat细胞、cd19阳性的raji细胞、bcma阳性的k562-bcma细胞和claudin18.2阳性的nugc4-18.2细胞)铺入96孔板中，然后以3：1的效靶比(即效应t细胞与靶细胞之比)将car t细胞和未转染t细胞(nt，阴性对照)铺入到96孔板进行共培养，16-18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：(靶细胞荧光均值-样品荧光均值)/靶细胞荧光均值
×
100％，计算得到杀伤效率，结果如图3-5所示。
95.可以看出，与nt细胞相比，双靶car-t细胞对靶细胞的杀伤都是特异性的，且对靶细胞都有显著杀伤活性。其次，与单靶car-t细胞相比，双靶car-t细胞一方面显著增加了对表达肿瘤抗原的靶细胞(raji、k562-bcma、nugc4-18.2细胞)的杀伤活性，另一方面对jurkat细胞的杀伤与cd5单靶的car-t细胞相当。
96.以上结果表明，双靶点car-t细胞的设计产生了协同效果，其对靶细胞的杀伤效果优于单靶点car-t细胞。
97.实施例3.car t细胞的细胞因子释放
98.以1x105/孔将各靶细胞铺于96孔板中，然后以1:1的比例将car-t和nt细胞(阴性对照)与靶细胞共培养，18-24小时后收集细胞共培养上清液。然后通过elisa检测上清液中的ifnγ释放水平，结果如图6-8所示。
99.可以看出，各双靶car-t细胞与相应靶细胞共培养后，均有效分泌大量的ifnγ。cd5+cd19双靶car-t细胞的ifnγ释放水平与单靶cd19或cd5 car-t细胞的释放水平相当，而cd5+bcma双靶和cd5+claudin18.2双靶car-t细胞在与jurkat细胞共培养后，其ifnγ释放水平均显著高于cd5单靶car-t细胞。
100.需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。