一种同时鉴定辣椒雄性不育三系杂交种恢复性和真实性的分子标记及其鉴定方法

1.本发明属于育种技术领域，具体涉及一种同时鉴定辣椒雄性不育三系杂交种恢复性和真实性的分子标记及其鉴定方法。


背景技术：

2.辣椒，茄科辣椒属，是一种重要的蔬菜作物和调味料，因其适应性强，风味独特，营养价值丰富，产业价值高，而在全国范围内广泛种植，是我国传统的出口产品之一。我国种植的辣椒种类可分为鲜食椒和加工型辣椒，相较于鲜食椒，加工型辣椒的经济效益高，产业链长，产品增值潜力大，如主要来源自色素加工型辣椒的辣椒红素，被广泛应用于食品乃至饲料、化妆品、和药品的加工中。虽然加工型辣椒的产业发展前景广阔，用种量大，但发展水平与鲜食辣椒产业相比较低，且现阶段关于加工型辣椒专用杂交种选育的研究较少，栽培上仍以地方品种为主，该现状亟需得到改善。
3.大部分辣椒杂交种在长势、产量、品质和抗逆性等方面均表现出十分显著的杂种优势特性，近年来，杂交品种已广泛应用于辣椒的商业化生产中。利用雄性不育三系配套杂交制种成本低，是比较理想的辣椒制种手段。该育种体系由不育系、保持系和恢复系组成，稳定的雄性不育系的存在极大减少了母本去雄和授粉的人力成本消耗，且其与强育性恢复系杂交后新产生的f1代杂交种不仅育性可以恢复正常，还能进行自交结实，具有适应性广、制种容易、制种产量高、成本低等优点。但由于机械混杂和人为等原因导致的生产过程中无法避免的种子混杂的问题，“假杂种”是杂交制种生产中极受关注的问题。
4.种子作为农业生产的基础资料，三系杂交制种后关于杂交种子的真实性、纯度及育性恢复的鉴定至关重要。目前的常规鉴定方法有田间鉴定、生化鉴定和分子鉴定。田间鉴定的准确性虽高，但所需鉴定周期长，人力成本高；而生化水平上的鉴定则易因蛋白质的多态性低导致不能完全显示出品种间的差异；相比之下，使用分子标记鉴定可直接鉴定出其品种基因水平上的差异，且鉴定周期短，是未来进行品种鉴定的主要发展趋势。
5.虽然目前已公开的辣椒分子标记较多，但分子标记在实际的应用中表现的结果并不理想。例如有些分子标记虽与恢复基因rf图位紧密，但在实际应用中所表现出的鉴定结果与表型吻合度存在偏差，甚至可能产生无扩增出目的条带的现象。还有些分子标记只针对辣椒品种的真实性或育性的单一属性开发，分子标记的单一鉴定结果不能全面评价种子的可用程度。还有是根据辣椒全基因组开发的分子标记，提供的标记数量大，没有品种针对性，在实际操作中需要多个标记配合使用，鉴定工作量大。还有些分子标记仅为显性标记，无法确切区分纯合基因型还是和杂合基因型，应用时容易受到外界温度等环境的干扰。
6.目前ssr（simple sequence repeats，简单重复序列）由于其位点大量广泛地分布于辣椒的整个基因组，具有多等位基因的特性，可揭示的多态性高，在目前的标记开发中较受青睐。
7.因此，随着育种研究的快速发展，为了缩短辣椒雄性不育杂交种的鉴定周期、降低
鉴定难度，目前急需针对不同品种辣椒开发具有特异性的且能够同时鉴定杂交种的真实性、纯度及恢复性的共显性分子标记。


技术实现要素：

8.为了克服和解决现有技术中存在不足和缺陷，本发明的目的在于提供一种同时鉴定辣椒雄性不育三系杂交种恢复性和真实性的分子标记及其鉴定方法。
9.为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：本发明提供了一种同时鉴定辣椒雄性不育三系杂交种恢复性和真实性的分子标记cr
‑
s
‑
01，所述分子标记cr
‑
s
‑
01的序列为：cr
‑
s
‑
01 f：ctcccttatgtgctaacttttgg；cr
‑
s
‑
01 r：atcttcttcatcagcttcctcct。
10.本发明还提供了一种同时鉴定辣椒雄性不育三系杂交种恢复性和真实性的分子标记cr
‑
s
‑
02，其特征在于，所述分子标记cr
‑
s
‑
02的序列为：cr
‑
s
‑
02 f：ctcccttatgtgctaacttttgg；cr
‑
s
‑
02 r：attcatcttcttcatcagcttcc。
11.本发明还提供了利用所述的分子标记cr
‑
s
‑
01或者所述的分子标记cr
‑
s
‑
02同时进行辣椒雄性不育三系杂交种恢复性和真实性的鉴定方法，包括以下步骤：（1）提取辣椒雄性不育三系杂交种及其父本、母本的基因组dna；（2）以步骤（1）中的基因组dna为模板，利用分子标记cr
‑
s
‑
01或者分子标记cr
‑
s
‑
02进行pcr扩增，pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；（3）将辣椒雄性不育三系杂交种及其父本、母本的扩增条带进行比对，若在辣椒雄性不育三系杂交种中出现共显性标记，则判断其为亲本的真实杂交种且含雄性不育恢复基因（真实可育杂交种）；若在辣椒雄性不育三系杂交种中仅出现父本的扩增条带，则判断其为亲本的假杂交种且含雄性不育恢复基因（假性可育杂交种）；若在辣椒雄性不育三系杂交种中仅出现母本的扩增条带，则判断其为亲本的假杂交种且不含雄性不育恢复基因（假性不可育杂交种）。
12.进一步的，所述基因组dna提取自辣椒雄性不育三系杂交种及其父本、母本的种子或者植株叶片。
13.进一步的，所述步骤（2）中pcr扩增条件为：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，58℃退火15s，72℃延伸1min，重复35 个循环；72℃总延伸 5min，4℃保存。
14.进一步的，所述共显性标记为辣椒雄性不育三系杂交种中同时显示出母本与父本的互补条带。
15.进一步的，所述辣椒雄性不育三系杂交种为色素加工型辣椒杂交种。
16.与现有技术相比，本发明的优点和有益技术效果是：1、本发明利用辣椒基因组序列中的ssr位点设计得到了两个能够同时鉴定色素加工型辣椒雄性不育三系杂交种真实性、恢复性以及纯度的分子标记cr
‑
s
‑
01和cr
‑
s
‑
02，进而建立了一种简单、快速、准确且同时鉴定色素加工型辣椒雄性不育三系杂交种的真实性、纯度及恢复性的方法，能够为加快色素加工型辣椒的恢复系的选育提供一定依据。
17.2、本发明中的共显性标记能够明确区分开杂交后代中的真、假杂交种，准确判断
杂交种后代单株的真实性，可极大降低鉴定杂交种的真实性及纯度的操作难度和鉴定成本。
18.3、本发明的鉴定方法能够为其他辣椒雄性不育杂交种开发育性恢复标记提供了参考，为杂交品种的开发与保护提供一定基础，也可作为新品种选育的鉴定方法，为育种单位使用，有利于推动辣椒产业的进一步发展。
附图说明
19.图1是亲本与f1代间无多态性的示例；其中1：母本；2：父本；3：f1代。
20.图2是亲本与f1代间有多态性的显性标记示例；其中1：母本；2：父本；3：f1代。
21.图3是亲本与f1间有多态性的共显性标记示例；其中1：母本；2：父本；3：f1。
22.图4是分子标记cr
‑
s
‑
01在
‘
青农干椒4号’亲本及f1部分代单株的扩增结果；其中m:marker；1：母本；2：父本；3
‑
17：青农干椒4号。
23.图5是分子标记cr
‑
s
‑
01在
‘
青农干椒8号’亲本及f1部分代单株的扩增结果，其中m:marker；1：母本；2：父本；3
‑
17：青农干椒8号。
24.图6是分子标记cr
‑
s
‑
02在
‘
青农干椒4号’亲本及f1部分代单株的扩增结果；其中m:marker；1：母本；2：父本；3
‑
17：青农干椒4号。
25.图7是分子标记cr
‑
s
‑
02在
‘
青农干椒8号’亲本及f1部分代单株的扩增结果，其中m:marker；1：母本；2：父本；3
‑
17：青农干椒8号。
26.图8是辣椒雄性不育三系杂交种
‘
青农干椒4号’田间鉴定照片。
27.图9是辣椒雄性不育三系杂交种
‘
青农干椒8号’田间鉴定照片。
具体实施方式
28.下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
29.实施例11.待鉴定的辣椒雄性不育三系杂交种及相关材料的准备1.1 待鉴定的辣椒雄性不育三系杂交种子准备从待鉴定的辣椒f1杂交种中进行随机抽样，共取不少于100粒的饱满种子，于4℃冰箱中保存备用。
30.1.2 待鉴定的辣椒雄性不育三系杂交种的父本、母本材料准备1.2.1 种子从待鉴定的辣椒雄性不育三系杂交种的父本、母本中进行随机抽样，分别取20
‑
40粒饱满种子，于4℃冰箱中保存备用。
31.1.2.2 叶片在辣椒亲本材料种子不可获得的情况下，可在杂交种制种田内，利用随机取样法从亲本材料中抽取数个单株，每株取心叶2
‑
5片，置于标记编号的塑料自封袋内，在
‑
20℃冰箱中保存备用。
32.2.待鉴定的辣椒种子或叶片材料的处理方法2.1种子：将f1代及父母本种子于50℃温汤浸种20
‑
30min，常温浸泡1h。使用培养皿纸床法进行催芽，具体方法为：种子上层置一张滤纸，下层置两张滤纸，均用蒸馏水润湿，
将浸种后的种子均匀布置于下层滤纸上，于15
‑
34℃范围内黑暗条件下培养7
‑
10天，待其进入芽苗期即可取样进行杂交种的真实性和育性的恢复性鉴定。
33.对于待鉴定的辣椒雄性不育三系杂交种的芽苗期幼苗需进行单株编号和取样，并于5
‑
7叶期田间定植，用于后期的田间育性鉴定和真实性验证。
34.2.2叶片：将制种田内采集的辣椒父本、母本叶片分别混合建立父本、母本的混池，并于
‑
20℃下保存。
35.3.待鉴定辣椒材料的基因组dna提取采用改良ctab法。将上述样品经液氮冷冻后磨碎至粉末状，装入离心管中，加入65℃预热的2% ctab，65℃水浴1h，期间每隔10min混匀一次；加入核酸提取液（氯仿：异戊醇=24:1）750μl；12000 r/min离心10min，取500μl上清液至1.5ml离心管中；加入300μl于
‑
20℃保存的异丙醇放置30min，产生絮状沉淀后离心10min；弃上清，用300μl 75%酒精清洗2次，晾干沉淀，加入50μl ddh2o，彻底溶解后，使用dna浓度检测仪进行浓度检测，并用ddh2o将dna稀释至100
‑
200μl/ng，放入
‑
20℃冰箱保存备用。
36.4.用于同时鉴定辣椒雄性不育三系杂交种恢复性和真实性的分子标记设计所设计引物位于辣椒6号染色体。辣椒基因组数据来源于sgn网站（https://solgenomics.net），使用ssrhunter软件搜索获取序列中的ssr位点以进行引物设计。设计得到两对分子标记cr
‑
s
‑
01和cr
‑
s
‑
02，其序列分别如下：cr
‑
s
‑
01 f：ctcccttatgtgctaacttttgg；cr
‑
s
‑
01 r：atcttcttcatcagcttcctcct。
37.cr
‑
s
‑
02 f：ctcccttatgtgctaacttttgg；cr
‑
s
‑
02 r：attcatcttcttcatcagcttcc。
38.5.利用pcr和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行引物扩增和条带分析利用待鉴定的辣椒材料的基因组dna和上述设计的分子标记进行pcr扩增，将pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
39.pcr反应体系：采用25μl反应体系，包括12.5μl 2
×
go taq r colorless master mix，1μl正向引物，1μl反向引物，2μl dna模板，并补充8.5μl ddh2o。
40.pcr扩增程序：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，58℃退火15s，72℃延伸1min，35 个循环；最后 72℃总延伸 5min，4℃保存。
41.8%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配方为：30%非变性聚丙烯酰胺溶液 24ml、10
×
tbe缓冲液 9ml、ddh2o 60ml、10%过硫酸铵（aps）550μl、temed 90μl。
42.6.利用分子标记进行辣椒杂交种恢复性和真实性鉴定的实例以色素加工型辣椒雄性不育三系杂交品种
‘
青农干椒4号’和
‘
青农干椒8号’（均来源于青岛农业大学）为例，对利用分子标记cr
‑
s
‑
01和cr
‑
s
‑
02鉴定辣椒杂交品种的恢复性和真实性的方法进行具体说明。
43.恢复性：设计的标记引物可有效的区分父母本，在材料间恢复基因位点存在多态性。在杂种一代，250bp处出现条带，说明f1表现为可育，能够恢复母本的雄性不育性。但其他引物上，无多态性，则不能选择（如图1）。需要说明的是，cr
‑
s
‑
01和cr
‑
s
‑
02标记不一定适应所有的辣椒品种，但可以利用这种方法筛选恢复性关联的标记。
44.真实性：设计的标记引物为共显性标记，可以进行真实性鉴定。为了简化鉴定程
序，其他的显性标记不能使用（如图2和图3）。
45.纯度：设计的标记引物可准确区分f1中的真实杂交种。使用本发明中分子标记cr
‑
s
‑
01和cr
‑
s
‑
02对100株后代单株进行纯度鉴定，显示双亲互补条带的单株可判断为亲本真实杂交种，反之则为假杂种。杂交种纯度计算方法为：杂交种纯度=显示共显性标记条带的单株数/待鉴定的总株数
×
100%。
46.6.1利用分子标记cr
‑
s
‑
01的鉴定结果标记cr
‑
s
‑
01在色素加工型辣椒杂交品种
‘
青农干椒4号’（图4）和
‘
青农干椒8号’（图5）的不育系母本中可扩增出243bp的目的片段，在其恢复系父本中则显示为约250bp左右的片段，在杂交种中可稳定扩增出母本与父本的杂合双带，为共显性标记。
47.在色素加工型辣椒杂交种真实性鉴定中，若f1代显示母本与父本的互补条带（图4中4
‑
11和13
‑
17号f1单株），则判断该杂交种为母本与父本的真实杂交种，若仅显示母本或父本的带型（图4中3和12号f1单株），则判断该单株为亲本的假杂交种。
48.利用标记cr
‑
s
‑
01对色素加工型辣椒杂交品种
‘
青农干椒4号’的共113个单株进行纯度鉴定，其中有8个单株仅显示母本或父本的带型，为假杂交种，经计算，
‘
青农干椒4号’的纯度为92.92%；利用标记cr
‑
s
‑
01对色素加工型辣椒杂交品种
‘
青农干椒8号’的共106个单株进行纯度鉴定，其中有3个单株仅显示母本或父本的带型，为假杂交种，经计算，
‘
青农干椒8号’的纯度为97.17%。
49.根据标记cr
‑
s
‑
01在色素加工型辣椒杂交种的不育系母本和恢复系父本中显示的目的条带的多态性可知，含有243bp片段的单株为不含育性恢复基因rf的不育植株，含有250bp左右片段的为含育性恢复基因rf的可育植株。进行育性恢复结果分析时，若杂交种在凝胶电泳图中显示为250bp左右片段的带型，则可判断该单株含有雄性不育rf恢复基因，即该单株花粉育性恢复，可正常结果，用于生产安全；若仅显示243bp目的条带，则判断其不含有雄性不育rf恢复基因，即该单株花粉育性表现为不育，不能正常结果，直接用于生产风险极大。
50.6.2利用标记cr
‑
s
‑
02的鉴定结果标记cr
‑
s
‑
02在色素加工型辣椒杂交品种
‘
青农干椒4号’（图6）和
‘
青农干椒8号’（图7）的不育系母本中可扩增出247bp的目的片段，在其恢复系父本中则显示为约250bp左右的片段，在杂交种中可稳定扩增出母本与父本的杂合双带，为共显性标记。
51.在色素加工型辣椒杂交种真实性鉴定中，若f1代显示母本与父本的互补条带（图6中4
‑
11和13
‑
17号f1单株），则判断该杂交种为母本与父本的真实杂交种，若仅显示母本或父本的带型（图6中3和12号f1单株），则判断该单株为亲本的假杂交种。利用标记cr
‑
s
‑
02鉴定色素加工型辣椒杂交品种
‘
青农干椒4号’、
‘
青农干椒8号’的种子纯度分别为92.92%、97.17%，与利用标记cr
‑
s
‑
01的纯度鉴定结果一致。
52.根据标记cr
‑
s
‑
02在色素加工型辣椒杂交种的不育系母本和恢复系父本中显示的目的条带的多态性可知，含有247bp片段的单株为不含育性恢复基因rf的不育植株，含有250bp左右片段的为含育性恢复基因rf的可育植株。进行育性恢复结果分析时，若杂交种在凝胶电泳图中显示为250bp左右片段的带型，则可判断该单株含有雄性不育rf恢复基因，即该单株花粉育性恢复，可正常结果，用于生产安全；若仅显示247bp目的条带，则判断其不含有雄性不育rf恢复基因，即该单株花粉育性表现为不育，不能正常结果，直接用于生产风险
极大。
53.7.辣椒杂交种田间育性和纯度的验证对定植的100株辣椒f1代单株进行田间表型的纯度与育性鉴定，以验证ssr标记鉴定结果。色素加工型辣椒杂交品种
‘
青农干椒4号’和
‘
青农干椒8号’的田间表型分别见图8和图9。
54.7.1辣椒杂交种的纯度验证将定植的100株辣椒f1杂交种单株，与该杂交种的品种特性，如叶片性状、果实性状等进行比较，如表现一致则说明为该品种真实杂交种。根据真实杂交种数量进行品种纯度计算，计算方法为：品种纯度=真实杂交种的株数/待鉴定的总株数
×
100%，并对标记鉴定结果进行验证，结果见表1。
55.7.2辣椒杂交种的育性验证利用真实性和纯度鉴定的100株辣椒f1杂交种单株，在开花期，进行第一次田间育性鉴定，根据花期花粉量的多少进行育性鉴定，若花粉量多则表型鉴定结果为可育。在结果期进行第二次田间育性鉴定，根据有无果实进行育性鉴定，若有果实则表型鉴定结果为可育，结果见表1。
56.该田间表型验证鉴定结果与cr
‑
s
‑
01、cr
‑
s
‑
02分子标记鉴定结果吻合，说明应用分子标记cr
‑
s
‑
01和cr
‑
s
‑
02对辣椒雄性不育三系杂交种的真实性、纯度和恢复性的鉴定结果准确可靠，且简单快速。
57.表1：辣椒杂交种
‘
青农干椒4号’和
‘
青农干椒8号’的田间验证鉴定结果辣椒品种纯度育性青农干椒4号96%100%可育青农干椒8号100%100%可育实施例2：一种利用分子标记同时进行辣椒雄性不育三系杂交种恢复性和真实性的快速鉴定方法，包括以下步骤：（1）提取待鉴定的辣椒雄性不育三系杂交种及其父本、母本的种子或者植株叶片的基因组dna；（2）利用分子标记cr
‑
s
‑
01或者cr
‑
s
‑
02，以上述提取的基因组dna为模板，进行pcr扩增，pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察扩增条带；（3）将杂交种的扩增条带与其父本、母本的扩增条带进行对比，若在杂交种中出现共显性标记，即在杂交种中同时显示出母本与父本的互补条带，则判断该杂交种为亲本的真实杂交种且含有雄性不育恢复基因（真实可育杂交种）；若在杂交种中只显示母本的扩增条带，则判断该杂交种为亲本的假杂交种且不含有雄性不育恢复基因（假性不可育杂交种）；若在杂交种中只显示父本的扩增条带，则判断该杂交种为亲本的假杂交种且含有雄性不育恢复基因（假性可育杂交种）。
58.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。