技术特征：
1.一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)囊胚培养液的获得：通过单精子注射方法获得受精卵，将其培养至第3天卵裂球期之后转移至新制备的囊胚培养微滴中进行囊胚培养，将形成囊胚的胚胎吸出，转移至新的囊胚培养液中或者进入玻璃化冻存流程，剩余的原囊胚培养液即检测时所需要收集的样本；(2)囊胚培养液的采集：将步骤(1)中获取的原囊胚培养液转移至裂解液中，离心后，样本进入下一步的全基因组扩增步骤；(3)囊胚培养液中微量dna的全基因组扩增：向步骤(2)中获得的囊胚培养液与裂解液的混合物中加入裂解酶，混匀后孵育，而后使裂解酶失活，取出裂解产物加入pcr反应管中进行基因组扩增反应；(4)将全基因组扩增后的dna产物进行分析，以鉴定胚胎的染色体状态是否正常：分析时采用二代测序、核酸芯片或者免疫荧光检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中裂解液的成分是ph为7.0～8.0的tris
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cl 25
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45mm，edta 0.5
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3mm，kcl 10
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25mm以及浓度为0.05％
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5％的去污剂，所述去污剂为triton x
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100、triton x
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114、吐温20、np40和sds中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，裂解液的成分优选为ph为7.2的tris
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cl 40mm，edta 1mm，kcl 15mm以及3％的triton x
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100。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的裂解酶选自蛋白酶k、qiagen protease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和溶菌酶中的一种或多种，所述裂解酶的浓度为1
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25μg/ml。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解酶的浓度优选为20μg/ml。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中孵育温度为30
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60℃，孵育时间为1min至12h，失活温度为75
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95℃，失活时间为1
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15min。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中优选的，孵育温度为40℃，孵育时间为3h，失活温度为90℃，失活时间为5min。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中进行pcr反应时的pcr反应管中含有扩增混合液、0.5％
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20％的pcr抑制物对抗剂、5
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20mm dntp、5
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100μm ng和nt引物、50
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200μm扩增引物、0.5
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10单位核酸聚合酶，所述pcr抑制物对抗剂选自dmso、甜菜碱、甲酰胺、甘油和白蛋白中的一种或多种，所述核酸聚合酶选自phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶、vent聚合酶、deep vent聚合酶、klenow fragment dna聚合酶i、mmlv反转录酶、amv反转录酶、hiv反转录酶、超保真dna聚合酶、taq聚合酶、e.coli dna聚合酶、longamp taq dna聚合酶和onetaq dna聚合酶中的一种或多种。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增混合液的成分为10
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25mm tris
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hcl，5
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25mm(nh4)2so4，5
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30mm kcl，0.5
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5mm mgso4，0.1％
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20％dmso和0.05
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5％triton x
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100。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述扩增混合液的成分优选为15mm tris
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hcl，15mm(nh4)2so4，20mm kcl，1mm mgso4，5％dmso和2％triton x
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100。11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ng和nt引物从5’端到3’端包含通用序列和可变序列，其中所述通用序列由g、a、c和t四种碱基中的三种或者两种组成，条件是
所述通用序列不同时包括g和c；所述扩增引物包含所述通用序列且不包含所述可变序列。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述可变序列选自下组：(n)nggg、(n)nttt，(n)mtntng，(n)xgtgg(n)y，其中n为任意的可与天然核酸进行碱基配对的核苷酸，n是选自3
‑
17的正整数，m是选自3
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15的正整数，x和y分别是选自3
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13的正整数。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述ng和nt引物包括seq id no:1[gtgagtgatggttgaggtagtgtggagnnnnnnnn]、seq id no:2[gtgagtgatggttgaggtagtgtggagnnnnnggg]、seq id no:3[gtgagtgatggttgaggtagtgtggagnnnnnttt]、seq id no:4[gtgagtgatggttgaggtagtgtggagnnntntng]或seq id no:5[gtgagtgatggttgaggtagtgtggagnnngtggnn]的序列，其中n为任意的可与天然核酸进行碱基配对的核苷酸；所述扩增引物从5’到3’具有seq id no:6[gtgagtgatggttgaggtagtgtggag]的序列。14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中全基因组扩增的热循环程序如下所述：(1)在介于90
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98℃之间的第一变性温度反应5
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20s；(2)在介于5
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15℃之间的第一退火温度反应5
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60s，在介于15
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25℃之间的第二退火温度反应5
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60s，在介于25
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35℃之间的第三退火温度反应30
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80s，在介于35
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45℃之间的第四退火温度反应5
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60s，在介于45
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55℃之间的第五退火温度反应5
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60s；(3)在介于55
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80℃之间的第一延伸温度反应10
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150min；(4)在介于90
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98℃之间的第二变性温度反应5
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30s；(5)在介于45
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70℃之间的第六退火温度反应10
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30s；(6)在介于60
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80℃之间的第二延伸温度反应1
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10min；(7)重复步骤(4)到(6)5至50个循环；(8)在介于60
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80℃之间的温度下继续延伸反应1
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10min；(9)将扩增后的产物在0
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5℃下冷藏保存。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，优选地，步骤(3)中全基因组扩增的热循环程序如下所述：(1)在第一变性温度95℃下反应10s；(2)在第一退火温度10℃下反应45s，在第二退火温度20℃下反应45s，在第三退火温度30℃下反应60s，在第四退火温度40℃下反应45s，在第五退火温度50℃下反应45s；(3)在第一延伸温度62℃下反应90min；(4)在第二变性温度95℃下反应20s；(5)在第六退火温度59℃下反应20s；(6)在第二延伸温度72℃下反应3min；(7)重复步骤(4)到(6)10至30个循环；(8)在72℃下继续延伸反应5min；(9)将扩增后的产物在4℃下冷藏保存。
技术总结
本发明涉及一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法，通过从胚胎早期体外培养液即囊胚培养液中检测胚胎来源的游离DNA，对微量DNA进行均匀的全基因组扩增，再利用二代测序等方法对扩增后的DNA产物进行分析，从而判断胚胎的染色体情况，即是否出现染色体整体或局部的非整倍体。本发明选择囊胚培养液这种体外受精操作过程中胚胎体外培养阶段的废弃物作为检测样本，这种非侵入性无创的方法既避免了常规卵裂球活检或囊胚滋养层细胞活检取样时对胚胎造成的细胞损伤，又不给临床增添额外的麻烦，同时简化了样本获取时的操作，安全可靠性及简便性更高。靠性及简便性更高。靠性及简便性更高。
技术研发人员：陆思嘉 蔡立义 姚兵
受保护的技术使用者：序康医疗科技（苏州）有限公司
技术研发日：2015.11.05
技术公布日：2021/11/23