一种松材线虫PAMPBxCDP1的突变体及应用

一种松材线虫pamp bxcdp1的突变体及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种松材线虫病原相关分子模式(pathogen
‑
associated molecular patterns，pamp)bxcdp1的突变体及其在制备用于防治松材线虫病的免疫诱导剂中的应用。


背景技术：

2.松材线虫病是由松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)引起的一种毁灭性森林病害。松材线虫可危害包括日本黑松(pinus thunbergii)、马尾松(p.massoniana)等在内的58种松属植物和13种非松属针叶树。目前该病主要分布在日本、中国、韩国、美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙和西班牙等国，其中日本、中国及韩国危害最为严重。我国于1982年南京中山陵首次发现该病，目前疫情已扩展到江苏、浙江、安徽、福建等17个省区。与2020年相比，疫区又新增63个县区(国家林业和草原局2021年第5号公告)。近四十年来，松材线虫病在我国的发生日益严重，已对我国的森林资源和生态环境造成严重破坏和不可估量的经济损失，因此松材线虫被列为国内头号森林植物检疫对象。
3.松材线虫病的发生发展极为复杂，涉及松树、松材线虫、天牛(传播媒介)、细菌、真菌以及地理环境等多方面，尽管目前存在的三种假说(酶学说、毒素学说和空洞化学说)都由不同的试验证据证实，但松材线虫病确切的致病机理一直没有完全弄清，导致该病防治难度大，效果不佳，松树一旦感病，枯萎死亡的结局不可逆转。对于松材线虫病的生物防治，虽经室内生物活性测定筛选出许多具有高效杀线活性的菌株，但在林间防治效果还不明确，使化学防治成为松材线虫病常用的防治手段之一。虽然研究者已筛选出一些具有防治松材线虫病潜力的药剂，如甲维盐、阿维菌素、氯氟氰虫酰胺和啶虫脒等。但这些化学药剂使用不当易危害松树、污染环境，且成本较高，因而不能在林间大量施用。因此目前对于松材线虫病的防治还没有一个十分有效的方法。
4.在自然界中，尽管植物会受到许多病原微生物(包括真菌，细菌，线虫，病毒等)以及昆虫的侵袭，但是由于植物具有的先天免疫使得它们对于大部分的微生物具有抗性。在目前普遍认为的植物免疫系统与病原互作的“z”字形模式中，植物免疫系统的第一道防卫反应即植物细胞膜上的模式识别受体(paremrecognitionreceptors，prrs)可以识别病原物或微生物相关分子模式(pathogen
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ormicrobia1
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associated molecular patterns，mamps or pamps)，从而激发植物基础防卫反应，诱导一些信号通路的激活，阻碍病原物的进一步扩展，即pamp
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triggered immunity(pti)。
5.植物免疫诱导抗性的研究在国内外已有近百年的历史，科学家们发现了很多对植物具有诱导抗性的功能物质并应用到植物病害的治理实践中。其中pamps(又称诱导子或激发子)对植物所产生的抗病信号经内源信号转导物质水杨酸、茉莉酸、乙烯和一氧化氮可转导到整个植株，经过一系列抗病相关基因的调控和表达引起寄主防御酶系统如苯丙氨酸解氨酶、β
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1，3葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化物酶等以及抗病物质如木质素与植保素等的变化及病程相关蛋白的调控与表达，以此来抵抗病原菌的侵入和发展，减轻和防治病害的发生。
6.生物诱抗剂(或称之为植物疫苗)是利用生物诱导抗性的原理，通过提高植物免疫能力开发的一种新型生物农药，通过调节植物的新陈代谢，激活植物的免疫和生长系统，从而增强植物抗病和抗逆能力。研究开发高活性植物病害疫苗是我国现代农林业研究领域的一个新的重要课题。利用诱导免疫抗性，可以针对植物病害的发生发展规律制定防治对策，提高植物病害的防治水平，减少化学农药的使用，从根本上减少农药对环境的污染。
7.目前，我国植物疫苗即抗病诱导剂的研究虽处于起步阶段，但已经取得了一些进展。如，利用寡糖诱导多种植物对植物真菌病害的抗性。利用来源于细极链格孢的激活蛋白诱导多种植物对病毒病等多种植物病害的抗性。这些研究都已商品化，并开始在田间应用，取得了较好的抗病增产效果。目前蛋白类诱导剂除过敏蛋白、隐地蛋白及激活蛋白外，还有一些糖蛋白如疫霉糖蛋白及其13个氨基酸的短肽(pep
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13)，可诱导欧芹细胞瞬时离子流、防卫基因转录和植物保卫素积累。另外，植物病原细菌的pamps脂多糖能有效抑制毒性菌株细菌的数量；另一个细菌pamps鞭毛蛋白flagellin及其22个氨基酸(即flg22)能诱导水稻悬浮细胞产生抗病防御反应。这些结果表明作为免疫激发子之一的病原物的pamps可被用于作为植物免疫诱导剂的开发，并具有广阔的应用前景。
8.申请人前期从松材线虫侵染松树早期转录组数据中筛选和鉴定了1个松材线虫分泌的pamp bxcdp1(见专利号为zl201910437852.x，名称为松材线虫的病原相关模式分子蛋白bxcdp1及其应用的中国专利)。研究发现bxcdp1能触发包括寄主松树在内的多种植物的细胞坏死和免疫反应，并能诱导松树产生更强的防卫反应，提高松树对松材线虫的抵抗。但关于其触发植物免疫的关键氨基酸区域及鉴定出的关键氨基酸区域是否能作为植物免疫诱导剂、提高松树抗松材线虫病的能力还不清楚。


技术实现要素：

9.基于现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的第一技术问题是提供一种松材线虫pamp bxcdp1的突变体，并公开了其氨基酸序列及编码基因的核苷酸序列；本发明所要解决的第二技术问题是提供上述松材线虫pamp bxcdp1的突变体的应用，比如在制备用于防治松材线虫病的免疫诱导剂中的应用，在诱导植物免疫反应中的应用。
10.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
11.本技术人前期鉴定到松材线虫的1个pamp bxcdp1，发现bxcdp1触发包括寄主松树在内的多种植物的细胞坏死和免疫反应，它能诱导松树产生更强的防卫反应，提高松树对松材线虫的抵抗。因此将松材线虫病原相关分子模式bxcdp1编码的氨基酸序列分成19段，设计出bxcdp1及其19个删除部分片段的突变体，并通过农杆菌注射成功表达于本氏烟中，筛选到触发本氏烟细胞坏死的最短区域m9、m15及m16(第56
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86aa、第107
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136aa及第153
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173aa)。m9、m15及m16显著诱导本氏烟pti marker基因的上调表达，能有效诱导本氏烟的免疫反应。且m9和m16能激发寄主松树的病程相关基因的表达，激活松树的防御反应。
12.m9和/或m16作为松材线虫pamp bxcdp1的突变体，突变体m9的氨基酸序列如seq id no.1所示，突变体m16的氨基酸序列如seq id no.2所示。
13.需要说明的是，m9和/或m16突变体的名称并不是其本身的生物学名称，而是为了方便本技术写作与理解进行了统一命名。
14.也可将具有免疫诱导活性的多肽m9和m16组成融合蛋白，或者m9和m16的序列作为
融合蛋白的部分序列。
15.如seq id no.3所示和如seq id no.4所示的序列分别为突变体m9的编码基因的核苷酸序列和突变体m16的编码基因的核苷酸序列。
16.包含所述的编码基因的重组质粒、表达盒或重组菌，也作为本发明要求保护的范围。
17.一种制备松材线虫pamp bxcdp1的突变体的方法，包括以下步骤：将所述的松材线虫pamp bxcdp1的突变体的编码基因克隆到重组质粒中，并转化至宿主细胞中，获得重组菌，培养重组菌，诱导松材线虫pamp bxcdp1的突变体的表达。
18.重组质粒或重组表达载体转化至农杆菌时，可根据实际需求选择转化的方法以及农杆菌的菌种，本技术中采用的是电击转化至转化到农杆菌gv3101中。
19.所述的松材线虫pamp bxcdp1的突变体或所述的编码基因或所述的重组质粒、表达盒或重组菌在制备用于防治松材线虫病的免疫诱导剂中的应用。
20.免疫诱导剂或生物诱抗剂或称之为植物疫苗是利用生物诱导抗性的原理，通过提高植物免疫能力开发的一种新型生物农药，通过调节植物的新陈代谢，激活植物的免疫系统和生长系统，从而增强植物抗病和抗逆能力。将植物作为直接靶标，通过提高植物免疫力来抗病。
21.所述免疫诱导剂中，含有1个或多个上述松材线虫pamp bxcdp1的突变体作为有效成分。
22.所述的松材线虫pamp bxcdp1的突变体或所述的编码基因或所述的重组质粒、表达盒或重组菌在诱导植物免疫反应中的应用。
23.m9、m15及m16显著诱导本氏烟pti marker基因的上调表达，有效诱导本氏烟的免疫反应。m9和m16能提高松树病程相关基因的上调表达，从而增强了松树的防御反应，m9和m16是bxcdpi有效激活寄主松树的防御反应的关键区域。在提高松苗抗松材线虫病的能力上，m9效果最佳，m16次之。
24.有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
25.以bxcdp1为研究对象，鉴定其触发植物免疫反应的氨基酸区域(多肽)，并探究鉴定到的多肽提高松树抗松材线虫病的能力，为利用植物诱导抗性开发松树抗松材线虫病的免疫诱导剂提供了基础，利用其诱导免疫抗性，可以针对松材线虫病的发生发展规律制定防治对策，提高松材线虫病的防治水平，减少化学农药的使用和对环境的污染。
附图说明
26.图1为缺失突变体分析bxcdp1的功能域图；
27.图2为3个bxcdp1触发本氏烟细胞坏死的突变体的westernblot检测图；
28.图3为注射bxcdp1关键多肽后本氏烟pti marker基因相对表达量检测图；
29.图4为经bxcdp1 3段多肽和松材线虫处理后的黑松的病程相关基因的表达量检测图；
30.图5为bxcdp1关键多肽提高松树抗松材线虫病能力检测图。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
32.实施例1
33.一、bxcdp1删除部分片段的突变体在本氏烟中的瞬时表达
34.(1)载体构建
35.将松材线虫病原相关分子模式bxcdp1编码的氨基酸序列分成19段。以松材线虫的cdna为模板，设计特异性的引物(见表1)，用phantamaxsuper
‑
fidelitydna polymerase(vazyme，nanjing，china)试剂盒进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)扩增松材线虫病原相关分子模式bxcdp1及其19个删除部分序列的突变体(分别命名为bxcdp1nsp、m1
‑
m18，表1为其相应的pcr扩增引物)。将pcr产物回收后利用同源重组试剂盒clone express ii onestep cloning kit(vazyme，nanjing，china)的方法将其完整的编码区连接到表达载体pbinrfp上。连接体系配好后，用枪头轻轻吸打混匀，37℃孵育30min后，立即放入冰上5min。吸取5μl连接产物到50μl大肠杆菌jm109感受态中，冰上静置30min后，42℃热激90s，立刻放到冰上放置2min后，加入750μl不含有抗生素的液体luria
‑
bertani(lb)培养基，220r，37℃摇培1h，后5000r，离心1min，弃上清，留100ul菌液，枪头吸打混匀后涂布到含有卡那霉素的lb固体平板上，放置到37℃培养箱中过夜培养。挑取长出来的转化子进行pcr验证，验证后挑取单菌落于含有卡那霉素的lb液体培养基中，220r，37℃摇培过夜。按takara minibest plasmidpurification kit ver.4.0试剂盒步骤提取质粒(takara，japan)，送公司(金斯瑞生物科技有限公司)测序。正确后取2μl质粒，加入到50μl农杆菌感受态gv3101，冰上静置2min，用枪头全部吸取至电击杯中，电击(电压2.5kv)转化，后加入750μl不含有抗生素的lb液体培养基，200r，30℃摇培1h，后5000r，离心1min，弃上清，留100μl菌液，枪头吸打混匀后涂布到含有卡那霉素和利福平的lb固体平板上，放置到30℃培养箱中过夜培养。使bxcdp1及其19个突变体被成功克隆并转化到农杆菌gv3101中。
36.表1bxcdp1及其19个突变体的pcr引物
37.[0038][0039]
(2)农杆菌注射本氏烟
[0040]
在含有卡那霉素和利福平的lb固体平板上挑取携带有目标基因的农杆菌单菌落加入到含有卡那霉素和利福平的lb液体培养基中，220r，30℃过夜摇培。5000r，3min离心2次后收集菌体，用洗菌缓冲液(10mm mgcl2，10mm mes and100μmas，ph 5.6)悬浮菌体3次，用分光光度计将菌悬液的od值调成0.4。最后用1ml注射器将菌液注射进本氏烟(nicotiana benthamiana)叶片中。试验重复至少3次，每次试验中各处理至少有3个生物学重复。
[0041]
bxcdp1及其19个突变体通过农杆菌注射成功表达于本氏烟中，结果发现多个bxcdp1突变体能引起本氏烟细胞的强烈坏死，但其中3个bxcdp1突变体，即m9、m15及m16(第56
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86aa、第107
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136aa及第153
‑
173aa)是目前能筛到的触发本氏烟细胞坏死的最短区域
(图1)。随后进行western blot检测这三个突变体的表达情况，结果发现它们编码的氨基酸区域均能正常表达(图2)。
[0042]
二、bxcdp1触发本氏烟细胞坏死的3段关键氨基酸区域激发本氏烟免疫反应的能力检测
[0043]
将筛选出的能引起本氏烟细胞坏死的bxcdp1的3段氨基酸序列交由江苏金斯瑞生物有限公司进行多肽合成，以突变体m14作为阴性对照。每段多肽合成量为4mg，纯度为95％以上。用二甲基亚砜(dmso)将合成的多肽溶解备用。前期申请人发现病原相关分子模式bxcdp1能有效触发3个本氏烟ptimaker基因(acre31、pti5及cyp71d20)上调表达(hu et a1.，2020)。为检测本技术筛选出的bxcdp1的三段多肽是否也能激活本氏烟的免疫反应，将合成的多肽m9、m15及m16以及对照多肽m14溶解后分别用ddh2o将其再稀释至1um，用1ml注射器将其注入本氏烟叶片上，以m14做对照，注射3h后将本氏烟取下，液氮速冻后研钵研磨，按plant total rna kit(zoman，beijing，china)试剂盒说明书提取本氏烟叶片总rna。后用ii 1st strand cdna synthesis kit(+gdnawiper)(vazyme，nanjing，china)试剂盒反转录本氏烟总rna成cdna并作为模板，设计特异性的引物(表2)，采用相对定量pcr(quantitative reverse transcription
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polymerase chain reaction，qrt
‑
pcr)检测本氏烟病程相关分子模式诱导的免疫(pti)的标志性基因(marker基因)的表达。以本氏烟(n.benthamiana)延伸因子基因(nbef1α)作为内参基因应用于qrt
‑
pcr中，试验重复3次，每次试验中各处理有3个生物学重复。
[0044]
表2本氏烟ptimarker基因的qrt
‑
pcr引物
[0045][0046][0047]
注射m9后的本氏烟本氏烟pti maker基因pti5和acre31的相对表达量分别为3.12和2.15(图3a)；注射m15后的本氏烟pti maker基因pti5的相对表达量为2.42(图3b)；注射m16后的本氏烟pti maker基因cyp71d20的相对表达量为2.81(图3c)。差异显著性分析结果表明，m9、m15及m16可诱导本氏烟的pti maker基因acre31、pti5及cyp71d20显著上调，进一步说明本氏烟的免疫反应被激活。
[0048]
三、bxcdp1的关键多肽m9和m16对松树病程相关基因表达的影响
[0049]
将50μg/ml的m9、m15及m16和对照m14分别接入2年生黑松4h后，再接种约1500条松材线虫。6h后取松树茎段，液氮速冻后研磨，按plant totalrnakit(zoman，beijing，china)试剂盒说明书提取松树茎段总rna。后用ii 1st strand cdnasynthesis kit(+
gdnawiper)(vazyme，nanjing，china)试剂盒反转录松树总rna成cdna并作为模板，设计特异性的引物(表3)，采用qrt
‑
pcr检测松树病程相关基因ptpr
‑
3、ptpr
‑
4和ptpr
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5的相对表达量表达。以黑松(pinus thunbergii)延伸因子基因(ptef1α)作为内参基因应用于qrt
‑
pcr中，试验重复3次，每次试验中各处理有3个生物学重复。
[0050]
表3用于进行qrt
‑
pcr检测的黑松病程相关基因引物
[0051][0052]
和对照松树相比，接入m9后再接种松材线虫的黑松的ptpr
‑
3和ptpr
‑
5的相对表达量分别为4.66和3.93；接入m16后再接种松材线虫的黑松的ptpr
‑
3和ptpr
‑
4的相对表达量分别为11.20和5.92；而接入m15后再接种松材线虫的黑松的三个病程相关基因与对照松树的基因表达量上没有显著性差异(图4)。这说明m9和m16能提高松树病程相关基因的上调表达，从而增强了松树的防御反应，m9和m16是bxcdp1有效激活寄主松树的防御反应的关键区域。
[0053]
四、bxcdp1触发本氏烟细胞坏死的3段关键氨基酸区域增强松树抗松材线虫病的能力检测
[0054]
用无菌手术刀片在2年生黑松茎干上斜切一个小伤口，伤口深度到达木质部，然后将灭菌棉球塞在伤口上，并用封口膜做一个漏斗，在贴近伤口基部用封口膜缠紧。将1ml50μg/mlbxcdp1关键多肽m9、m15及m16分别接入漏斗中，4h后将约1500条混合虫龄的松材线虫强毒虫株ama3虫悬液分别接到黑松伤口上。观察松苗发病情况并拍照。以接入m14后接入松材线虫的黑松苗作为对照。试验重复3次，每次试验中各处理有3个生物学重复。
[0055]
同时根据松苗针叶颜色变化程度，将松苗的感病程度划分以下5个等级：0级：所有针叶均为正常的绿色；i级：小部分针叶变黄；ii级：大约一半的针叶变黄或者萎蔫；iii级：绝大部分针叶萎蔫；iv级：所有针叶萎蔫。各处理中松苗的感病率和感病指数按如下公式进行计算：
[0056]
感病率＝感病株树/总株树*100％。
[0057]
感病指数＝∑(各级株树
×
等级数)/(总株树
×
发病最高等级数)
×
100。
[0058]
松树接种多肽和松材线虫12天后，接入对照m14后再接种松材线虫的黑松苗大部分出现针叶褪绿黄化现象，而接入m9、m15、m16后再接种松材线虫的松苗有部分表现轻微的感病。接种15d后，接入m9和m16后再接种松材线虫的松苗的感病症状明显轻于对照，接入m15后再接种松材线虫的松苗的感病症状稍微轻于对照(图5c)。对接种12d和15d时松苗的感病率和感病指数做了相应统计。发现接入对照m14后再接种松材线虫的黑松苗第12d和第15d的感病率分别为66.7％和100％，其相应的感病指数为25和72.2；接入m15后再接种松材线虫的黑松苗第12d和第15d的感病率分别为44.4％和100％，其相应的感病指数为13.8和
58.3；接入m9后再接种松材线虫的黑松苗第12d和第15d的感病率分别为33.3％和77.8％，其相应的感病指数为5.53和36.1；接入m16后再接种松材线虫的黑松苗第12d和第15d的感病率分别为33.3％和77.8％，其相应的感病指数为11.1和36.1(图5a
‑
b)。经差异显著性分析发现，接入对照m14后再接种松材线虫的黑松苗与分别接入m9和m16后再接种松材线虫的黑松苗的感病率和感病指数具有显著性差异，同时尽管对照组与接入m15后再接种松材线虫的黑松苗在侵染12d时的感病率有显著性差异，但侵染15d时的感病率没有显著差异，且虽然经m14处理的松树感染松材线虫的感病指数高于m15处理的松树，但两者之间的差异不显著。结合上一个试验结果，得出以下结论：这三段多肽中的m9和m16由于激发了松树的病程相关基因的上调表达，提高了松树的防御反应，从而分别都能在一定程度上提高松苗抗松材线虫的能力，其中m9激发松树抗松材线虫病的能力最强，m16次之。