中国花鲈T细胞表面标志分子CD4-1的特异性抗体制备及应用

中国花鲈t细胞表面标志分子cd4
‑
1的特异性抗体制备及应用
技术领域
1.本发明属于鱼类分子免疫学技术领域，具体涉及一种中国花鲈t淋巴细胞表面标志分子cd4
‑
1的特异性抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.t淋巴细胞是机体主要的免疫细胞，参与机体的体液免疫应答和细胞免疫应答。其中，cd4
+
t淋巴细胞作为t淋巴细胞的主要功能亚群之一，在免疫过程中发挥着多种免疫功能，如在抵抗病原入侵等相关免疫防御中，cd4
+
t细胞细胞发挥着至关重要的作用。cd4
+
t细胞tcr识别apc表面的外源性抗原肽
‑
mhc ii类分子复合物后，活化成th细胞，产生多种细胞因子，趋化并激活其他免疫细胞来清除病原体。在哺乳动物中，cd4
+
t淋巴细胞亚群的特性及免疫功能已研究比较透彻，为开展疾病防治，评价机体免疫状态等开创了新局面。
3.cd4分子为单链跨膜糖蛋白，属ig超家族成员，主要表达于成熟的t淋巴细胞表面，可作为鉴定cd4 t淋巴细胞亚群的标志分子。近年来，关于不同鱼类cd4分子的研究相继开展，而对cd4分子的基因克隆是研究t淋巴细胞的前提。研究发现，鱼类的cd4分子主要有两种类型，即cd4
‑
1和cd4
‑
2分子。cd4
‑
1分子包含4个胞外ig区，1个跨膜区；cd4
‑
2分子胞外具有2个胞外ig区，1个跨膜区，其中ig区是其识别抗原肽段的区域。鱼类cd4
‑
1和cd4
‑
2分子与高等动物cd4分子相比较均具有保守的胞外样ig结构域及胞内酪氨酸激酶结合位点p56
lck
，而cd4
‑
2分子具有更原始的结构，因此推测在进化过程中由cd4
‑
2分子分化产生了cd4
‑
1分子。
4.中国花鲈(lateolabrax maculatus)是我国重要的海水养殖鱼类，近年来频发的养殖病害是妨碍其养殖业发展的重要因素。许多研究和实践表明疫苗是防治水产病害的一种有效措施。疫苗作用的发挥依赖机体适应性免疫机制的激活，在这一过程中t细胞扮演着重要角色。然而，由于缺少t淋巴标志分子的特异性抗体，因此对中国花鲈t淋巴细胞的分类、鉴定以及关于t细胞的免疫学功能都鲜有报道。因此，克隆中国花鲈t淋巴细胞的标志分子基因并制备其特异性抗体，有助于在转录水平研究基因的定位、组织分布及不同病原和免疫原刺激下的动态变化，对于在蛋白水平检测中国花鲈t淋巴细胞亚群数量变化、评价细胞免疫应答水平以及研制高效、绿色鱼用疫苗均具有重要现实意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种中国花鲈t淋巴细胞表面标志分子cd4
‑
1的特异性抗体及其制备方法和应用，利用其制备的多克隆抗体可检测中国花鲈的cd4
‑1+
t细胞，为鉴定中国花鲈t淋巴细胞亚群提供重要的免疫学工具，进而填补中国花鲈t淋巴细胞研究中的空白。
6.本发明首先提供一种中国花鲈cd4
‑
1分子基因，其编码蛋白的氨基酸序列如下：
7.mktliqsflivnavlmstmgaeevvyaqvgdtvtlkppvgtnlqrqylywffsdlqvawrnsfggkgfhkdepwtnrlswlddslvikniqqehfgtfscklksktlitfkvlklnvtkspsslllpgeilsldcsveapqghr
免疫基因的表达变化提供了可能，并为检测中国花鲈cd4
‑1+
t淋巴细胞提供了重要工具。本发明实现对中国花鲈cd4
‑1+
t淋巴细胞的鉴定及后续检测。
附图说明
18.图1为中国花鲈cd4
‑
1分子的基因及蛋白序列信息图。
19.图2为中国花鲈cd4
‑
1分子的系统发育进化树分析图。
20.图3为中国花鲈cd4
‑
1分子的多重序列比对分析图。
21.图4为中国花鲈cd4
‑
1分子的二级结构和三级结构分析图。
22.其中a为cd4
‑
1分子的二级结构域，b为cd4
‑
1分子的三级结构域图。
23.图5为中国花鲈cd4
‑
1分子的抗原表位参数分析图。
24.图6为免疫印迹法分析抗体与中国花鲈cd4
‑
1重组蛋白及肾脏白细胞的特异性结合图。
25.图7为间接免疫荧光法分析cd4
‑
1抗体与中国花鲈外周血白细胞表面的特异性结合反应图；其中1表示在100倍物镜下观察的抗体与血细胞表面发生特异性结合反应，荧光信号强，2为dapi衬染细胞核，3为1、2的叠加图。
26.图8为流式细胞术分析中国花鲈cd4
‑1+
t细胞的比例散点图及数据统计图，其中图a为散点图，图b为统计图。
27.图9为流式细胞术分析中国花鲈cd4
‑1+
t细胞在刺激后的比例变化图。
具体实施方式
28.本发明克隆了中国花鲈cd4
‑
1分子基因可作为cd4 t淋巴细胞亚群的标志物，从而用于鉴定cd4
+
t细胞，进而可深入研究cd4
+
t细胞的功能特性，以及评价鱼类细胞免疫应答水平并作为研制高效、绿色鱼用疫苗的评价指标。
29.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
30.中国花鲈cd4
‑
1分子的基因序列及氨基酸序列结构通过基因克隆获得，并经生物信息学分析验证，抗原性分析后，筛选得到抗原性高的氨基酸序列用于合成多肽。
31.利用多肽作为抗原制备的抗中国花鲈cd4
‑
1分子的多克隆抗体经酶联免疫吸附试验实验结果显示抗体能与cd4
‑
1分子的重组蛋白发生特异性结合，效价显著高于以重组蛋白作为抗原制备的抗中国花鲈cd4
‑
1分子的多克隆抗体。
32.抗中国花鲈cd4
‑
1分子的多克隆抗体经蛋白免疫印迹实验结果显示抗体能与cd4
‑
1分子的重组蛋白和天然蛋白发生特异性结合，并经质谱验证。
33.中国花鲈cd4
‑
1抗体与中国花鲈部分白细胞表面发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，在100倍油镜下能够观察到绿色荧光信号在细胞膜表面呈散点状分布。
34.本发明的中国花鲈t细胞表面标志分子cd4
‑
1基因的克隆方法是运用生物信息学软件分析已公布鱼类的cd4
‑
1蛋白序列的保守区(选择大于等于5个种类)，选择蛋白比对序列中连续6个相同的氨基酸的两段肽段(lisgqq
‑
itklie)，两段肽段相距大于等于20个氨基酸。通过对其设计简并引物，并根据中国花鲈的密码子偏好性，优化引物，以中国花鲈肾脏为模版，pcr扩增技术得到cd4
‑
1的核心序列，对核心片段设计特异性引物(gsp)，利用race技术，以中国花鲈肾脏为模版，pcr扩增技术得到cd4
‑
1基因的cds序列。
35.本发明中克隆的cd4
‑
1基因经生物信息学分析，结果显示其为中国花鲈的cd4
‑
1基因，具有四个ig结构域，一个跨膜结构域；通过进化树分析结果显示中国花鲈的cd4
‑
1能与鱼类的cd4
‑
1聚为一支，多重序列比对分析结果显示中国花鲈的cd4
‑
1序列的ig结构域在进化上是保守的，与日本花鲈的相似度最高。
36.利用中国花鲈cd4
‑
1多肽制备的多克隆抗体经间接酶联免疫反应实验结果显示抗体能与中国花鲈的cd4
‑
1裸肽和cd4
‑
1重组蛋白发生特异性结合，且效价显著高于以重组蛋白为抗原制备的抗体。免疫印迹结果显示：cd4
‑
1多抗能特异性识别分子量约为64.2kda的中国花鲈cd4
‑
1重组蛋白以及能识别分子量约为52kda的天然蛋白。免疫荧光检测结果显示，cd4
‑
1分子的抗体能特异性识别部分白细胞的膜表面cd4
‑
1分子。流式细胞术分析结果显示，中国花鲈外周血、脾脏、头肾中均存在cd4
‑1+
t淋巴细胞，其中脾脏中含量最高。
37.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
38.实施例1：中国花鲈t细胞表面标志分子cd4
‑
1的基因克隆
39.1、设计基因保守序列部分的简并引物
40.查找ncbi上已公布的其他鱼类的cd4
‑
1蛋白序列，通过blast查找与鲈形目同源性较高的鱼类的序列，利用bioedit查找序列上较为保守的区域(连续相同的氨基酸大于或等于6个)，根据保守区域分别设计各自的简并引物(表1)，并根据中国花鲈的密码子偏好性优化简并引物后，送于擎科公司合成。
41.表1：cd4
‑
1基因简并引物表
42.f：lisgqq5'ttratttcdggccarcag 3'r：itklie5'ytcratcttcagcgtkat 3'
43.2、基因核心片段扩增
44.使用设计的简并引物，以中国花鲈的cdna为模板进行cd4
‑
1基因扩增。扩增过程，结合温度梯度pcr及touchdown pcr方法对pcr过程进行优化，直至扩增出核心片段。琼脂糖凝胶电泳对扩增得到的pcr产物进行检测，紫外光下观察凝胶成像结果，预估大小处目的条带所在的凝胶用刀切下，连接007载体，转入克隆菌，并挑取单克隆菌落送于公司测序，测序返还的序列结果，用ncbi上的blast进行验证，克隆的核心序列是否为cd4
‑
1基因的片段。核心片段核苷酸序列如下：
45.ttaatttctggccagcaggtcaacctgacttgcagcttcggccagccgctgccctctgacctgcggctgaaatggttcacacctgaacaatcgtccctgcagcctctaagtcctgaccatcaccgcgcccatctcaccatcccacaagtggggactggagatggcggaaagtggaggtgtgagctgtggcagagcaacacactgctggcgtcaactgtgataacgctgaagatcgaa。
46.3、race获得中国花鲈cd4
‑
1基因orf序列
47.将上述核心序列分别利用3
′‑
race和5
′‑
race扩增获得cd4
‑
1基因的全长。设计特异性引物(gsp)，用于扩增得到中国花鲈cd4
‑
1基因的orf序列(表2)。
48.表2：cd4
‑
1基因特异性引物表
[0049]3’
race引物5'agcctctaagtcctgaccatcaccg 3'5’race引物5'actttccgccatctccagtcccc 3'
[0050]
最终确定了中国花鲈cd4
‑
1基因的编码cds的核苷酸序列如下：
[0051]
atgaagaccttaattcaatccttcctcattgtcaatgctgtcctcatgtcgaccatgggggcagaaga
agtggtgtatgctcaggtgggagacacagttacccttaagcctccagtgggtacgaatttacaaagacagtatttgtactggttcttcagtgaccttcaagttgcctggagaaattcctttggcggaaaggggttccataaagatgaaccctggactaatagattgtcctggcttgacgactcactggtcatcaagaacatccaacaagaacactttgggaccttttcctgtaaactaaaatctaaaactttaatcacatttaaagtactcaaactcaatgtgactaagagcccaagctctcttctgctgcctggggaaattctgtctctggactgcagcgtggaggctcctcagggtcacaggaagccagagatatactggctggatccccagggaaagaaaattgccaataatgaaggaccattcaaagtgacagccaaaggccaacacaatggccagtggacttgtgttgtgcgaaatgatagaacagaacacaaagccacagtctctgttactgttgtggacctctccccagctcctcagcgtcctcagtatacgtctctatcctcgcccctcatcctgccctgttccattcctgcgcccatctcctgggaacaaatgaaagctaagggcatccggggagttgactggttattcttccctaaaccaagctcgaatctcatttctgatgatccacagagtctcttctccctctctctggaggatccactgaactggaagcccaaccaagacagaggactgactcctgtacgagactttaaaaaaggagatctgtctttgaccagaaaccgaggaagagaagatgacagaggagactatgtatgcatcctgaaagttaacgaaaatatgtctctgaacaggactgtacaagtaaatgtgctgaaaatcatctcctacccaggaacagacttaatttctggccagcaggtcaacctgacttgcagcttcggccagccgctgccctctgacctgcggctgaaatggttcacacctgaacaatcgtccctgcagcctctaagtcctgaccatcaccgcgcccatctcaccatcccacaagtggggactggagatggcggaaagtggaggtgtgagctgtggcagagcaacacactgctggcgtcaactgtgataacgctgaagatcgaagtacccaagctgagtgtgtggatgctggtgatcatatgtagtgccacaatcatcataatcctcctcctcatcctctgtttcatcttctacaaacgcagacaacggaagttgagacacctcaggcatcgactctgccaatgcaaaaaccgcaagcccaaagggttctacagaacataa；
[0052]
编码的蛋白的氨基酸序列如下：
[0053]
mktliqsflivnavlmstmgaeevvyaqvgdtvtlkppvgtnlqrqylywffsdlqvawrnsfggkgfhkdepwtnrlswlddslvikniqqehfgtfscklksktlitfkvlklnvtkspsslllpgeilsldcsveapqghrkpeiywldpqgkkiannegpfkvtakgqhngqwtcvvrndrtehkatvsvtvvdlspapqrpqytslssplilpcsipapisweqmkakgirgvdwlffpkpssnlisddpqslfslsledplnwkpnqdrgltpvrdfkkgdlsltrnrgreddrgdyvcilkvnenmslnrtvqvnvlkiisypgtdlisgqqvnltcsfgqplpsdlrlkwftpeqsslqplspdhhrahltipqvgtgdggkwrcelwqsntllastvitlkievpklsvwmlviicsatiiiilllilcfifykrrqrklrhlrhrlcqcknrkpkgfyrt*
[0054]
利用基因序列翻译系统(http://www.expasy.org/)，得到中国花鲈cd4
‑
1mrna翻译的蛋白的氨基酸序列(图1)，利用mega 5.0软件，构建了cd4
‑
1分子的系统进化树(图2)；利用dnaman软件对得到的中国花鲈的cd4
‑
1蛋白序列与其他鱼类的序列进行多重序列比对分析，结果显示中国花鲈的cd4
‑
1分子与日本花鲈的序列同源性最高(图3)。
[0055]
实施例2：中国花鲈cd4
‑
1分子多克隆特异性抗体的制备
[0056]
1、cd4
‑
1抗原肽片段的筛选
[0057]
分析了实施例1获得的中国花鲈cd4
‑
1分子的蛋白二级结构域。结果显示，中国花鲈cd4
‑
1分子的跨膜区在419～441位区，其中1～418位区显示为胞外区，胞外区存在四个ig样结构域，442～470为胞内区。根据smart软件预测跨膜区和结构域的目的在于保证分析设计的抗原肽位于中国花鲈cd4
‑
1胞外区及ig样结构域上。利用蛋白质三级结构的在线预测系统swiss model，https://swissmodel.expasy.org/interactive，对中国花鲈cd4
‑
1蛋白的三级结构进行同源构建并分析，建立了蛋白的三维结构模型(图4)。
[0058]
采用dnastar软件对中国花鲈cd4
‑
1分子抗原表位参数进行分析，参数主要包括亲
水性(hydrophilicity plot
‑
kyte
‑
doolittle)、柔韧性(flexible regions
‑
karplus
‑
schulz)、抗原性(antigenic index
‑
jameson
‑
wolf)和表面可及性(surface probability plot
‑
emini)等(图5a)。综合各参数，取位于β
‑
转角和无规则卷曲区域，取亲水性指数≥0、表面可及性指数≥1和抗原性指数≥0的氨基酸区段作为潜在表位。从中可以看出中国花鲈cd4
‑
1分子抗原表位可能存在的位置。采用iedb在线预测软件，结合dnastar软件分析结果，对中国花鲈cd4
‑
1分子抗原表位进一步预测，预测出可能的b细胞线性表位(图5b)。从图5a中可以看出中国花鲈cd4
‑
1分子抗原表位可能存在的位置大多位于胞外区域。而图5b所示的b细胞线性表位也分布在该区域。
[0059]
综合以上预测数据，最终确定候选抗原肽。首先，排除位于跨膜区和胞内区的抗原表位，使得抗原肽位于胞外区段和ig样结构域上。其次，抗原肽应位于二级结构中的无规则卷曲和β
‑
转角区域。最后，分析抗原表位参数及预测的潜在抗原表位，确定抗原肽的具体位置，最终选择中国花鲈cd4
‑
1分子抗原肽为
244
pkpssnlisddpqsl
258
。抗原肽由公司合成并偶联血蓝蛋白载体，纯度经质谱验证。
[0060]
2、免疫
[0061]
用中国花鲈cd4
‑
1多肽
‑
klh复合物作为抗原免疫小鼠。每次的免疫剂量为1mg，免疫共分4次进行，前2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为1周，均为腹腔注射：
[0062]
①
基础免疫：cd4
‑
1多肽
‑
klh复合物与弗氏完全佐剂等量(v/v)混匀作为抗原；
[0063]
②
加强免疫：cd4
‑
1多肽
‑
klh复合物与弗氏不完全佐剂等量(v/v)混匀作为抗原；
[0064]
③
二次加强免疫：cd4
‑
1多肽
‑
klh复合物与弗氏不完全佐剂等量(v/v)混匀作为抗原；
[0065]
④
再次加强免疫：cd4
‑
1多肽
‑
klh复合物与弗氏不完全佐剂等量(v/v)混匀作为抗原。
[0066]
⑤
最后一次免疫后，间隔三天，进行眼球采血。将采集的血液，于室温下倾斜静置2h，4℃冰箱中过夜。次日，将离心管在4℃、8000g条件下离心10min，小心吸取上清作为多克隆抗体。
[0067]
实施例3:本发明克隆基因所制备的多抗的免疫印迹法鉴定
[0068]
(1)十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳：
[0069]
①
将纯化的中国花鲈cd4
‑
1重组蛋白和中国花鲈肾脏白细胞分别加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3～5min；
[0070]
②
将
①
处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10μl，在恒流条件下，起始时用低电流(30
‑
40ma)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流(50
‑
70ma)，电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；凝胶部分用于转膜，部分放置在考马斯亮蓝染液中染色1h。
[0071]
③
剪取一块与电泳凝胶相同大小的pvdf膜(孔径0.22μm)，经甲醇激活并纯水浸泡后，以电转移缓冲液(电转移缓冲液：25mmol/l tris
‑
base，192mmol/l甘氨酸，20％甲醇，ph 8.3)润湿，放在电泳后的凝胶上。在pvdf膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与pvdf膜及滤纸形成一套夹心的“三明治”；
[0072]
④
将“凝胶三明治”置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将pvdf膜面向正极；电泳
恒压30v，通电1.5小时；
[0073]
⑤
转移完毕，取出pvdf膜。
[0074]
(2)蛋白免疫印迹：
[0075]
①
将pvdf膜用pbs洗10分钟，然后将其置于3％的牛血清白蛋白溶液(pbs配)中封闭1h，37℃；
[0076]
②
用pbst洗3次，每次5分钟；
[0077]
③
孵育一抗：取制备的鼠抗花鲈cd4
‑
1多克隆抗体、未免疫的鼠血清(对照)以1：1000的比例进行稀释，将pvdf膜浸没其中，在37℃恒温箱中孵育1.5h；
[0078]
④
同
②
法洗涤三次；
[0079]
⑤
将pvdf膜加入辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠ig抗体(1:10000稀释)中，37℃孵育1小时；
[0080]
⑥
同
②
法洗涤三次；
[0081]
⑦
把pvdf膜放入反应机器中用发色液(1：1配制发色液)发色；
[0082]
⑧
同时把放置在考马斯亮蓝中的凝胶在沸水中煮至条带清晰，pdvf膜上发出条带的位置对应到凝胶上，将对应的条带小心切下送去质谱。
[0083]
结果：cd4
‑
1抗体与中国花鲈cd4
‑
1重组蛋白在64.2kda处发生特异性反应，与中国花鲈脾脏白细胞在50kda处发生特异性反应(图6)，显示条带，而阴性对照无条带显示。
[0084]
实施例4：中国花鲈cd4
‑
1抗体的间接免疫荧光方法鉴定
[0085]
①
将percoll不连续密度梯度离心获得的中国花鲈外周血白细胞，以pbs重悬，并将浓度调整至5
×
106个/ml。
[0086]
②
把白细胞悬液滴在干净的载玻片上，每滴50μl，在室温下湿盒中沉降1小时后取出放入4％多聚甲醛中固定20分钟，取出风干。
[0087]
③
以免疫的小鼠血清为第一抗体，阴性对照为鼠阴性血清，加在载玻片的细胞样品上，37℃湿盒中孵育1小时。
[0088]
④
取出载玻片，用pbs洗三次，每次5分钟。
[0089]
⑤
以异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体为第二抗体，加在细胞样品上，37℃湿盒中孵育45分钟。
[0090]
⑥
取出载玻片，同
④
浸洗，甘油封片。
[0091]
⑦
荧光显微镜下观察。
[0092]
结果：中国花鲈cd4
‑
1抗体与中国花鲈部分白细胞表面发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，在100倍油镜下能够观察到绿色荧光信号在细胞膜表面呈散点状分布，这与cd4
‑
1蛋白分布于t淋巴细胞表面的事实相吻合，而阴性对照则没有观察到荧光信号(图7)。
[0093]
实施例5：中国花鲈cd4
‑
1抗体在检测中国花鲈cd4
‑1+
t细胞数量比例中的应用
[0094]
①
选取暂养一周后的健康中国花鲈(500
±
5g)，采用乙醚麻醉后，于尾静脉抽取中国花鲈外周血白细胞，同时取中国花鲈的脾脏和头肾组织，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取中国花鲈外周血、脾脏及头肾的白细胞。将提取的中国花鲈各组织白细胞用无菌pbs缓冲液稀释成细胞密度为1
×
106cells/ml的细胞悬液。
[0095]
②
取从每个组织样品分别准备两份白细胞悬液，一份为检测样品，一份为对照样品，离心倒掉上清后，往检测样品中加入1ml中国花鲈cd4
‑
1多克隆抗体重悬，同组织对照组
加入等量鼠阴性血清，37℃孵育1.5h。
[0096]
③
于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌pbs重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
[0097]
④
用1ml异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠ig二抗重悬
③
中洗涤离心后的细胞沉淀，37℃孵育1h。
[0098]
⑤
于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌pbs重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
[0099]
⑥
离心洗涤完成后，用500μl无菌pbs重悬细胞，用于流式细胞仪分析。
[0100]
结果：各组织阴性对照样品流式分析的散点图未有阳性反应细胞群出现，而与中国花鲈cd4
‑
1抗体孵育的中国花鲈各组织白细胞流式分析散点图呈现两个细胞群，说明cd4
‑
1抗体能与中国花鲈部分白细胞发生特异性结合，检测结果显示中国花鲈外周血白细胞中cd4
‑1+
细胞数量比例为5.1％，脾脏组织白细胞中的cd4
‑1+
细胞数量比例为10.0％，头肾组织白细胞中的cd4
‑1+
细胞数量比例为13.1％(图8)。
[0101]
实施例6：中国花鲈cd4
‑
1抗体在检测中国花鲈cd4
‑1+
t细胞klh刺激后数量比例变化中的应用
[0102]
①
将暂养1周的健康中国花鲈(500
±
5g)随机分为两组，每组5条。实验组注射1mg/ml klh，对照组不进行任何处理。具体实验操作为：取1个2.5ml的无菌注射器，向一只注射器内加入2ml klh溶液，将抗原采用腹腔注射的方式注射给鱼体，每条鱼注射400微升。
[0103]
②
于免疫后第3天，选取健康的中国花鲈，采用乙醚麻醉后，于尾静脉抽取中国花鲈外周血白细胞，同时取中国花鲈的脾脏和头肾组织，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取中国花鲈外周血、脾脏及头肾的白细胞。将提取的中国花鲈各组织白细胞用无菌pbs缓冲液稀释成细胞密度为1
×
106cells/ml的细胞悬液。
[0104]
③
取从每个组织样品分别准备两份白细胞悬液，一份为检测样品，一份为对照样品，离心倒掉上清后，往检测样品中加入1ml中国花鲈cd4
‑
1多克隆抗体重悬，对照组为未刺激的鱼体同组织细胞，37℃孵育1h。
[0105]
④
于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌pbs重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
[0106]
⑤
用1ml异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠ig单抗重悬
④
中洗涤离心后的细胞沉淀，37℃孵育1h。
[0107]
⑥
于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌pbs重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
[0108]
⑦
离心洗涤完成后，用500μl无菌pbs重悬细胞，用于流式细胞仪分析。
[0109]
结果：与各组织阴性对照样品流式分析的散点图相比，klh刺激后中国花鲈cd4
‑
1抗体孵育的中国花鲈各组织白细胞流式分析散点图中的阳性细胞群呈现增加趋势，说明中国花鲈cd4
‑1+
t细胞能够被t细胞刺激物klh激活，发生应答变化，检测结果显示中国花鲈外周血白细胞中cd4
‑1+
细胞数量比例由5.1％增加到16.1％，脾脏组织白细胞中的cd4
‑1+
细胞比例由10.0％增加到26％，头肾组织白细胞中的cd4
‑1+
细胞比例由13.1％增加到35.7％(图9)。
[0110]
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行
修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明请求保护的范围。