1.本发明属于原生质体制备技术领域，具体涉及岭南药用植物穿心莲原生质体的制备及应用。
背景技术：
2.植物原生质体是指细胞壁以内各种结构的总称，具有再生形成完整植株的能力。目前制备植物原生质体的主要手段是酶解法，然而利用酶解法制备植物原生质体时，如黄瑞华等利用酶解6小时的方法制备穿心莲原生质体(黄瑞华等.穿心莲叶片原生质体制备方法的建立与优化[j/ol].分子植物育种:1
‑
16.http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.s.20210428.1414.012.html.)，酶解时间长，制备效率不高。如何缩短制备植物原生质体的时间，是原生质体制备行业亟待解决的问题。
技术实现要素：
[0003]
本发明的目的在于提供一种原生质体酶解液，能够缩短制备原生质体时酶解时间，提高原生质体的制备效率。
[0004]
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0005]
本发明提供了一种原生质体酶解液，包括1.5wt.％纤维素酶r
‑
10、0.75wt.％离析酶r
‑
10、0.6m甘露醇、20mm mes、20mm kcl、10mm cacl2和0.1wt.％bsa。
[0006]
本发明提供了上述酶解液的制备方法，包括如下步骤：
[0007]
将所述纤维素酶r
‑
10、离析酶r
‑
10、甘露醇、mes和kcl混合，在55℃的条件下温育10min，冷却至室温，得第一混合液；
[0008]
将所述第一混合液与cacl2和bsa混合，过滤除菌得酶解液。
[0009]
本发明提供了一种穿心莲原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
切碎穿心莲幼苗的下胚轴和叶组织后调节渗透压，得穿心莲幼苗下胚轴和叶的碎片；
[0011]
将所述碎片与上述酶解液混合酶解3～4小时，得穿心莲酶解液；
[0012]
将所述穿心莲酶解液与w5溶液混合，过滤得原生质体。
[0013]
优选的，所述培养的光暗时间比为12h：12h；所述培养的光照强度为100μmol m
‑2s
‑1。
[0014]
优选的，所述培养的时间为20～40d；所述培养的温度为20～30℃。
[0015]
优选的，所述渗透压调节包括将切碎植物幼苗的下胚轴和叶组织置于渗透压调节液中黑暗培养30min，所述渗透压调节液包括0.6m甘露醇溶液。
[0016]
优选的，所述w5溶液包括5mm kcl，154mm nacl，125mm cacl2和2mm mes。
[0017]
本发明提供了一种穿心莲原生质体瞬时转染的方法，包括如下步骤：
[0018]
将上述穿心莲原生质体与外源性质粒和peg溶液混合，黑暗反应12～15min，得反应液；
[0019]
混合w5溶液与所述反应液，分离得转染的原生质体。
[0020]
优选的，所述外源性质粒、穿心莲原生质体和peg溶液的体积比为1：10：11。
[0021]
优选的，所述外源性质粒含有标记基因。
[0022]
本发明提供一种原生质体酶解液，包括1.5wt.％纤维素酶r
‑
10、0.75wt.％离析酶r
‑
10、0.6m甘露醇、20mm mes、20mm kcl、10mm cacl2和0.1wt.％bsa。本发明通过精心调配原生质体酶解液，可以更好地将细胞壁去除，使细胞游离出来，同时细胞维持很好的生理状态。
[0023]
进一步的，本发明通过调整甘露醇浓度，维持细胞渗透压，减少了原生质体在转染过程中的皱缩或涨破，保证了原生质体的细胞形态。利用本发明所述酶解液能够缩短原生质体制备时的酶解时间，保证了原生质体的高活性和高产量，可用于基因瞬时表达研究。
附图说明
[0024]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]
图1为实施例1穿心莲幼苗期的生长状态图；
[0026]
图2为实施例2制备原生质体时采用穿心莲幼苗组织示意图，其中，图2a为完整的组织，图2b为切碎后的组织；
[0027]
图3为实施例2制得的原生质体的20倍显微放大图；
[0028]
图4为实施例2制得的穿心莲原生质体经过二乙酸荧光素染色后20倍显微放大图；
[0029]
图5为实施例2制得的穿心莲原生质体转染puc
‑
gfp的成像图，其中图5a为gfp荧光成像结果，图5b为叶绿素(chl)自发荧光成像结果，图5c为gfp和chl整合(merged)，图5d为明场通道(bright)的成像图。
具体实施方式
[0030]
本发明提供了一种原生质体酶解液，包括1.5wt.％纤维素酶r
‑
10、0.75wt.％离析酶r
‑
10、0.6m甘露醇、20mm mes、20mm kcl、10mm cacl2和0.1wt.％bsa。
[0031]
本发明提供的原生质体酶解液包括1.5wt.％纤维素酶r
‑
10和0.75wt.％离析酶r
‑
10。在本发明中，所述纤维素酶r
‑
10和离析酶r
‑
10混合搭配能够有效分解细胞壁。本发明对所述纤维素酶r
‑
10和离析酶r
‑
10的来源没有严格要求，优选购自yakult。
[0032]
本发明提供的原生质体酶解液包括0.6m甘露醇。本发明所述甘露醇维持细胞渗透压。
[0033]
本发明提供的原生质体酶解液包括20mm mes。本发明所述mes发挥缓冲剂的作用。
[0034]
本发明提供的原生质体酶解液包括20mm kcl和10mm cacl2。在本发明中，所述kcl和cacl2能够使原生质体不受植物材料生理状态的限制，维持原生质体较好的生理状态，提高原生质体的活性和质量。
[0035]
本发明提供的原生质体酶解液包括0.1wt.％bsa。本发明所述bsa具有保护作用，能够减少或防止细胞壁酶解过程中对细胞器的破坏。
[0036]
本发明所述原生质体酶解液通过精心调配，可以更好地将细胞壁去除，使细胞游离出来，同时细胞维持很好的生理状态。
[0037]
本发明还提供了基于上述技术方案所述酶解液的制备方法，包括如下步骤：
[0038]
将所述纤维素酶r
‑
10、离析酶r
‑
10、甘露醇、mes和kcl混合，在55℃的条件下温育10min，冷却至室温，得第一混合液；
[0039]
将所述第一混合液与cacl2和bsa混合，过滤除菌得酶解液。
[0040]
本发明对混合所述纤维素酶r
‑
10、离析酶r
‑
10、甘露醇、mes和kcl的方式没有严格要求，采用常规方法即可。
[0041]
本发明混合所述纤维素酶r
‑
10、离析酶r
‑
10、甘露醇、mes和kcl后，在55℃的条件下温育10min，冷却至室温，得第一混合液。本发明所述温育能够使纤维素酶r
‑
10和离析酶r
‑
10中存有的dna酶和蛋白酶失活。本发明对冷却的方式没有严格要求，所述室温为20～30℃。
[0042]
得第一混合液后，本发明将所述第一混合液与cacl2和bsa混合，过滤除菌得酶解液。本发明制备上述酶解液时，冷却后加入cacl2和bsa能够减少或防止细胞壁酶解过程中对细胞器的破坏，使原生质体不受植物材料生理状态的限制，维持较好的生理状态。
[0043]
本发明还提供了基于上述技术方案所述酶解液制备穿心莲原生质体的方法，包括如下步骤：
[0044]
切碎穿心莲幼苗的下胚轴和叶组织后调节渗透压，得穿心莲幼苗下胚轴和叶的碎片；
[0045]
将所述碎片与上述酶解液混合酶解3～4h，得穿心莲酶解液；
[0046]
将所述穿心莲酶解液与w5溶液混合，分离得原生质体。
[0047]
本发明优选将穿心莲种子播种在ms培养基上培养，获得穿心莲幼苗。本发明将穿心莲种子播种在ms培养基上培养可以保证穿心莲种子可以很好的萌发。本发明对ms培养基的来源没有特殊要求，可自行配制或购买。
[0048]
本发明所述穿心莲种子优选选自岭南地区穿心莲种子，进一步优选为广西省贵港市穿心莲种子。
[0049]
本发明所述培养的光暗时间比优选为12h：12h；所述培养的光照强度优选为100μmol m
‑2s
‑1；所述培养的温度优选为20～30℃，进一步优选为24～28℃，更优选为25～26℃；所述培养的时间优选为20～40d，进一步优选为25～35天，更优选为28～32d。本发明培养得到的穿心莲幼苗下胚轴和叶组织生长状态良好，具有很好的活性，使用这一时期的穿心莲幼苗制备得到的原生质体转染效率更高。
[0050]
本发明将穿心莲种子播种在ms培养基前，优选将穿心莲种子浸泡在去离子水中。本发明所述去离子水的温度优选为室温，所述浸泡的时间优选为12h。
[0051]
本发明优选使用75％乙醇和3％次氯酸钠依次对浸泡后的穿心莲种子消毒。本发明使用75％乙醇消毒的时间优选为15s，使用3％次氯酸钠消毒的时间优选为20min。
[0052]
得穿心莲幼苗后，本发明优选剪取穿心莲幼苗的下胚轴和叶组织，切碎穿心莲幼苗的下胚轴和叶组织后调节渗透压，得含有穿心莲幼苗下胚轴和叶的浆液。本发明调节渗透压的方式优选包括将切碎植物幼苗的下胚轴和叶组织置于渗透压调节液中黑暗培养30min。本发明调节渗透压时，优选在黑暗环境下进行。本发明所述渗透压调节液优选为
0.6m甘露醇溶液。本发明使用0.6m甘露醇溶液调节渗透压能够维持细胞渗透压，尽可能减少穿心莲原生质体在转染过程中的皱缩或涨破，保证了原生质体的细胞形态，易于后期转染。
[0053]
得穿心莲幼苗下胚轴和叶的碎片后，本发明将所述碎片与上述酶解液混合酶解3～4h，得穿心莲酶解液。本发明所述酶解的时间优选为25～30℃，进一步优选为26～28℃。本发明进行酶解时，优选在黑暗环境下进行，增大原生质体的活性。前文已清楚说明所述酶解液与酶解液制备的各步骤，以及酶解液的效果，在此不再赘述。
[0054]
得穿心莲酶解液后，本发明将所述穿心莲酶解液与w5溶液混合，分离得原生质体。本发明所述酶解液与w5溶液的体积比优选为1:1。本发明所述w5溶液包括5mm kcl，154mm nacl，125mm cacl2和2mm mes。本发明所述穿心莲酶解液与w5溶液混合的方式优选为剧烈摇动，使穿心莲叶片切口处的原生质体掉落到液体里。本发明摇动的时间优选为10s。本发明所述分离优选为过滤，所述过滤优选使用40μm细胞过滤器。
[0055]
本发明所述穿心莲原生质体的制备方法简单高效，缩短了酶解时间，可以低成本地获得大量穿心莲原生质体，使穿心莲原生质体的制备方法更为高效。制备得到的穿心莲原生质体细胞生长状态良好，易于转染，适用于多种研究目的。
[0056]
本发明还提供了基于上述方法得到的穿心莲原生质体瞬时转染的方法，包括如下步骤：
[0057]
混合外源性质粒、穿心莲原生质体和peg溶液，黑暗反应12～15min，得反应液；
[0058]
利用w5溶液稀释反应液，分离得转染的原生质体。
[0059]
本发明混合外源性质粒、穿心莲原生质体和peg溶液。本发明所述穿心莲原生质体优选为mmg溶液重悬原生质体。所述穿心莲原生质体的浓度优选为1～2
×
106个细胞/ml。本发明所述mmg溶液包括0.6m甘露醇，15mm mgcl2和4mm mes(ph5.7)。本发明所述外源质粒的浓度优选为1～2μg/μl；所述外源质粒优选为拟南芥puc
‑
gfp质粒。
[0060]
本发明混合外源性质粒、穿心莲原生质体和peg溶液后，黑暗反应12～15min，得反应液。本发明黑暗反应12～15min，使获得的穿心莲原生质体细胞具有很好的活力，保证其可用于基因瞬时表达研究。
[0061]
得反应液后，本发明利用w5溶液稀释反应液，分离得转染的原生质体。本发明所述分离的方式优选为离心；所述离心的时间优选为3min；所述离心的转速优选为500rpm。
[0062]
本发明所述外源性质粒、穿心莲原生质体和peg溶液的体积比优选为1：10：11。本发明所述外源性质粒优选带有标记基因，进一步优选为带有标记基因的拟南芥质粒。本发明对所述标记基因没有严格要求，可以为荧光标记基因、抗性基因。
[0063]
利用本发明上述转染后的原生质体可以直接进行亚细胞定位、蛋白互作和代谢物检测。
[0064]
本发明制得的原生质体采用peg介导转染法，成功转染外源性质粒，建立穿心莲原生质体基因瞬时表达体系，为在分子层面解析穿心莲的药理价值提供技术支持。
[0065]
本发明重悬上述方法得到的转染的原生质体，在黑暗条件下培养12～16小时，即可获得瞬时表达基因的原生质体。本发明所述重悬液优选为wi溶液，所述wi溶液优选包括0.6m甘露醇，20mm kcl和4mm mes(ph5.7)。
[0066]
本发明提及的ms培养基需121℃20min高温高压灭菌后使用；所述酶解液、w5溶液、
peg溶液、mmg溶液和wi溶液均均经过0.45μm滤膜过滤除菌。
[0067]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的原生质体酶解液及制备方法、穿心莲原生质体制备和瞬时转染的方法及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0068]
本发明实施例中所用材料及试剂如下：
[0069]
1、种子选择
[0070]
选取广西省贵港市穿心莲种子。
[0071]
2、试剂配制：
[0072]
w5溶液：5mm kcl，154mm nacl，125mm cacl2，2mm mes(ph5.7)，0.45μm滤膜过滤除菌。
[0073]
peg溶液：40％(w/v)peg4000，0.3m甘露醇，0.1m cacl2。
[0074]
mmg溶液：0.6m甘露醇，15mm mgcl2，4mm mes(ph5.7)，0.45μm滤膜过滤除菌。
[0075]
wi溶液：0.6m甘露醇，20mm kcl，4mm mes(ph5.7)，0.45μm滤膜过滤除菌。
[0076]
ms培养基：nh4no3(825mg/l)，kno3(950mg/l)，h3bo3(3.1mg/l)，cocl2·
6h2o(0.0125mg/l)，cuso4·
5h2o(0.0125mg/l)，na2edta
·
2h2o(18.63mg/l)，feso4·
7h2o(13.9mg/l)，mgso4(90.35mg/l)，mnso4·
h2o(8.45mg/l)，na2moo4·
2h2o(0.125mg/l)，ki(0.415mg/l)，kh2po4(85mg/l)，znso4·
7h2o(4.3mg/l)，cacl2(166.1mg/l)，mes(500mg/l)，蔗糖(30％)，用koh调ph至6.0，加入琼脂粉(7g/l)即可制成固体ms培养基。121℃20min高温高压灭菌后使用。
[0077]
实施例1
[0078]
酶解液的制备：
[0079]
按照以下质量和摩尔浓度备料：1.5wt.％纤维素酶r
‑
10、0.75wt.％离析酶r
‑
10、0.6m甘露醇、20mm mes、20mm kcl、10mm cacl2和0.1wt.％bsa。
[0080]
混合所述纤维素酶r
‑
10、离析酶r
‑
10、甘露醇、mes和kcl，在55℃的条件下温育10min，冷却至室温后加入10mm cacl2和0.1％bsa，0.45μm滤膜过滤除菌。
[0081]
实施例2
[0082]
1)将穿心莲种子室温去离子水浸泡12h，加入75％乙醇消毒15s，3％次氯酸钠消毒20min，超净台内去离子水洗净；
[0083]
2)在350ml培养瓶中放置80ml ms培养基，将消毒后的种子均匀地播种在ms培养基上，每个培养瓶5～6颗种子，培养期间，光照12小时，之后黑暗处理12小时，如此交替处理培养40d，光照的光强度约为100μmol m
‑2s
‑1，培养温度为26℃；
[0084]
3)剪取20～30株如图1和图2a所示的穿心莲幼苗的下胚轴和叶组织用于原生质体制备，用锋利的刀片将下胚轴和叶组织切碎，放入0.6m无菌甘露醇中黑暗处理30min调节渗透压，如图2b所示；
[0085]
4)收集处理后的下胚轴和叶组织，投入酶解液置于黑暗处轻摇(60rpm)酶解3h，使细胞游离；
[0086]
5)酶解后，加入与酶液等体积的w5溶液，用手剧烈摇动5～10s，然后通过40μm细胞过滤器收集在圆底离心管中；
[0087]
6)用w5溶液反复洗脱3～5次，洗脱液收集到的原生质体溶液置于水平离心机中离
心500rpm，5min，留有少量上清后重悬，即得穿心莲原生质体，利用荧光显微镜观察穿心莲原生质体，观测结果图3所示。
[0088]
实施例3
[0089]
同实施例2，区别在于步骤4)酶解4h。
[0090]
实施例4
[0091]
同实施例2，区别在于步骤2)ms培养基的体积为100ml。
[0092]
实施例5
[0093]
同实施例2，区别在于步骤2)ms培养基的体积为100ml，交替培养20d。
[0094]
测试例1
[0095]
穿心莲原生质体活性检测
[0096]
将实施例2制得的穿心莲原生质体冰浴静置30min，去除上清，用mmg溶液重悬，定量至1～2
×
106个细胞/ml。使用0.01％二乙酸荧光素(fda)染色，利用荧光显微镜观测穿心莲原生质体活细胞显色情况。显色结果如图4所示。
[0097]
由图3可以看出穿心莲活细胞显示绿色，说明制备得到的穿心莲原生质体具有生理活性。
[0098]
实施例4
[0099]
穿心莲原生质体瞬时转染
[0100]
1)离心管中加入10μl 1～2μg/μl拟南芥35s::gfp质粒puc
‑
gfp(4.5kb)；
[0101]
2)将实施例2制得的穿心莲原生质体冰浴静置30min，去除上清，用mmg溶液重悬，定量至1～2
×
106个细胞/ml，加入100μl至离心管中轻轻混合；
[0102]
3)加入110μl peg溶液，上下颠倒充分混合，黑暗反应12～15min；
[0103]
4)用440μl w5溶液稀释上述液体，充分混合终止转染反应。水平离心500rpm，3min，去除上清；
[0104]
5)加入300μl～1ml wi溶液重悬原生质体，转移到24/12/6细胞培养板中在黑暗条件下培养12～16小时。
[0105]
6)培养结束后，直接利用培养板中的wi溶液吹吸重悬原生质体，转移到离心管中，水平离心500rpm，3min，留有上清轻弹悬起原生质体，得转染后的原生质体。
[0106]
测试例2
[0107]
利用thunder宽场高分辨成像系统(倒置)观察，并拍摄实施例4 gfp、叶绿素自发荧光(chl)、二者整合(merged)和明场通道(bright)的成像图，成像结果如图4。
[0108]
由图4可以看出，本发明制得的原生质体采用peg介导转染法，成功转染puc
‑
gfp，成功建立了穿心莲原生质体基因瞬时表达体系。
[0109]
由以上实施例可知本发明提供的技术方案可以更好地将穿心莲细胞壁去除，使细胞游离出来，同时细胞维持很好的生理状态。本发明通过调整甘露醇浓度，维持细胞渗透压，减少了原生质体在转染过程中的皱缩或涨破，保证了原生质体的细胞形态。利用本发明所述酶解液能够缩短原生质体制备时的酶解时间，保证了原生质体的高活性和高产量，成功建立了穿心莲原生质体基因瞬时表达体系。
[0110]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施
例都属于本发明保护范围。