用于组织块培养的固定装置、组织块培养系统及培养方法与流程

1.本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种用于组织块培养的固定装置、组织块培养系统及培养方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)是一种成体干细胞，它存在于脐带、骨髓、脂肪和脐带血等一些组织中，具有很强的自我更新及多胚层分化能力。研究表明它在免疫调节和促进组织修复方面疗效显著，已经大量用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、移植物抗宿主病、肝纤维化等多种重大疾病的临床研究和治疗上。
3.脐带间充质干细胞从足月分娩断脐后的新生儿脐带中提取，具有来源丰富、不伤及身体、增殖能力强、具有多胚层分化能力、免疫原性低等优点，已经得到了越来越多专业人士的认可和应用。
4.脐带间充质干细胞可采取组织块培养法进行培养，培养时常用的分离方法为华通氏胶钝性剥离法，首先同时去除脐动脉和脐静脉；接着将剥离的华通氏胶均匀剪碎；然后用mscs培养基重悬剪碎的华通氏胶，重悬后接种于培养皿中，最后直接置于co2培养箱培养。
5.但是，目前的组织块培养法存在以下缺陷：组织块利用率较低，原代细胞产量较低。具体到脐带间充质干细胞组织培养中，则为华通氏胶利用率较低，原代脐带间充质干细胞产量较低。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于组织块培养的固定装置，能够确保组织块在培养过程中贴壁生长。
7.本发明的目的之二在于提供一种组织块培养系统。
8.本发明的目的之三在于提供一种组织块培养方法。
9.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
10.用于组织块培养的固定装置，包括：
11.衔接件，所述衔接件用于与培养槽可拆卸连接；
12.固定件，所述固定件至少设置有平面底部，所述固定件用于固定组织块，以使所述组织块夹持固定在所述固定件的平面底部和所述培养槽的槽底之间；
13.连接件，所述连接件的首端与所述衔接件活动连接，所述连接件的尾端与所述固定件连接。
14.进一步地，所述衔接件设置有卡槽，所述卡槽与所述培养槽的侧壁卡接。
15.进一步地，所述连接件包括对称而设的第一连接臂和第二连接臂，所述衔接件设置在所述第一连接臂的首端和所述第二连接臂的首端之间；所述第一连接臂的首端与所述衔接件转动连接，所述第二连接臂的首端与所述衔接件转动连接；所述固定件设置在所述第一连接臂的尾端和所述第二连接臂的尾端之间。
16.进一步地，所述第一连接臂的首端和所述第二连接臂的首端之间设置有连接柱；所述连接柱插入所述衔接件与所述衔接件转动连接。
17.进一步地，所述第一连接臂的首端设置有第一凸柱，所述第二连接臂的首端设置有第二凸柱，所述第一凸柱和所述第二凸柱均与所述衔接件转动连接。
18.进一步地，所述第一连接臂包括第一倾斜件和第一平置件，所述第二连接臂包括第二倾斜件和第二平置件；所述第一倾斜件与所述衔接件转动连接，所述第二倾斜件与所述衔接件转动连接；所述固定件设置于所述第一平置件和所述第二平置件之间。
19.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
20.一种组织块培养系统，包括至少一个培养单元，所述培养单元包括：
21.培养槽，所述培养槽用于承装细胞培养液和组织块；
22.至少一个所述固定装置，所述固定装置包括衔接件、固定件和连接件；
23.所述衔接件用于与所述培养槽可拆卸连接；
24.所述固定件至少设置有平面底部，所述固定件用于固定所述组织块，以使所述组织块夹持固定在所述固定件的平面底部和所述培养槽的槽底之间；
25.所述连接件的首端与所述衔接件活动连接，所述连接件的尾端与所述固定件连接。
26.进一步地，还包括培养容器，所述培养容器用于收容所述培养单元。
27.进一步地，还包括盖体，所述盖体用于遮蔽所述培养槽的槽口；或者，所述盖体用于遮蔽所述培养容器的容器口。
28.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
29.一种组织块培养方法，包括以下步骤：
30.将组织块接种在培养槽中，并使所述组织块的一面贴附于所述培养槽的槽底；
31.将所述固定装置与所述培养槽进行组装，其中所述衔接件与所述培养槽进行可拆卸连接，所述固定件压在所述组织块上；
32.向所述培养槽中添加原始培养液，然后置于培养箱中培养。
33.进一步地，所述培养箱中co2的浓度为5％～15％。
34.进一步地，培养过程中需要更换培养液，更换培养液后每45
‑
50h向所述培养槽中加入半胱氨酸，半胱氨酸的加入量为所述原始培养液体积的0.02％
‑
0.2％，半胱氨酸的储液为浓度1μmol/l。
35.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
36.(1)本发明所提供的用于组织块培养的固定装置，利用组织块进行细胞培养时，组织块是夹持固定在固定件的平面底部和培养槽的槽底之间的，更换培养液时，组织块处在固定位置，不会发生位移，因此不会影响细胞继续从固定件的平面底部和培养槽的槽底之间游出，并保持贴壁生长，从而提高了组织块的利用率较，提高了原代细胞的产量。
37.(2)本发明所提供的用于组织块培养的固定装置，是独立的新型装置，其与培养槽是两个独立的器件，方便清洗和存放。此固定装置可与现成的培养槽(例如培养皿)灵活组装，如果培养过程中需要固定装置时，将固定装置和培养槽进行组装即可；如果培养过程中不需要固定装置时，就按常规培养法操作即可，灵活性强。也就是说，使用者不需要另行对培养槽(例如培养皿)进行重新设计，此固定装置的通用性强，具有很好的应用前景。
附图说明
38.图1为本发明实施例所提供的固定装置的示意图；
39.图2本本发明实施例所提供的固定装置的另一示意图；
40.图3为本发明实施例所提供的固定装置与培养槽的连接示意图；
41.图4为本发明实施例所提供的培养系统的示意图；
42.图5为本发明实施例1所提供的有固定装置和无固定装置时的细胞生长情况示意图；
43.图6为本发明实施例1所提供的在不同co2浓度条件下细胞生长情况示意图；
44.图7为本发明实施例1所提供的在补加半胱氨酸和不加半胱氨酸条件下的细胞生长情况示意图。
45.图中：10、衔接件；11、第一卡臂；12、第二卡臂；20、连接件；21、第一连接臂；22、第二连接臂；23、第一倾斜件；24、第二倾斜件；25、第一平置件；26、第二平置件；30、固定件；40、培养槽；50、培养容器；60、盖体。
具体实施方式
46.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过商业渠道购买获得。
47.如图1
‑
2所示，本发明一实施方式提供了一种用于组织块培养的固定装置，包括用于与培养槽40可拆卸连接的衔接件10、用于固定组织块的固定件30、以及用于连接衔接件10和固定件30的连接件20。
48.在其中的一个实施例中，本发明实施例的固定装置是透明的，优选采用透明树脂材料制作，透明树脂材料形成的固定装置可用75％乙醇浸泡除菌，操作方便。
49.具体地，衔接件10用于与培养槽40可拆卸连接，即需要使用本发明实施例的固定装置时，将衔接件10与培养槽40连接，不需要使用时，衔接件10可以从培养槽40中拆除。可拆卸连接的方式可以包括多种，例如包括但不限于卡接、夹设、凹凸匹配连接、磁性连接等。
50.作为优选的实施方式，衔接件10与培养槽40通过卡接的方式进行可拆卸连接，例如可以在衔接件10上设置卡槽，通过卡槽与培养槽40的侧壁卡接。具体地，衔接件10上设置有第一卡臂11和第二卡臂12，第一卡臂11和第二卡臂12之间形成卡槽，连接时，卡槽从培养槽40的侧壁边缘往下插入即可。
51.作为可选的实施方式，当衔接件10与培养槽40采用夹设的连接方式时，可以将衔接件10设置为夹子；当衔接件10与培养槽40采用凹凸匹配的连接方式时，可以在衔接件10上设置凸块，培养槽40上设置与凸块匹配的凹槽，或者在衔接件10上设置凹槽，在培养槽40上设置与凹槽匹配的凸块；当衔接件10与培养槽40采用磁性连接方式时，分别在衔接件10和培养槽40上设置相应的磁铁即可，但细胞培养器件一般为玻璃器件、树脂器件等，磁性连接的方式可选，但不是最优的。
52.在其中的一个实施例中，培养槽40用于承装培养液和组织块，培养槽40的材料为树脂、玻璃或塑料等，优选颜色为透明的培养槽40，通过透明培养槽40可以直观观察细胞培养过程。培养槽40的形状可以有多种选择，包括但不限于方形、锥形、圆形等，具体地可以选
用玻璃培养皿。
53.在其中的一个实施例中，培养槽40的槽底为平底，设有平底的培养槽40有利于组织块铺平。
54.本发明实施例的固定件30至少设置有平面底部，固定件30用于固定组织块，以使组织块夹持固定在固定件30的平面底部和培养槽40的槽底之间。采取这种方式，在组织块培养过程中，能够保证细胞贴壁生长并向外迁移；并在更换培养液时，组织块的位置不易发生变化，细胞的贴壁情况和迁移速率不会受到影响，能够提供组织块的利用效率，提高原代细胞的产率。
55.在其中的一个实施例中，固定件30的形状包括但不限于为长方体、圆柱体、圆台、圆锥、棱柱(三棱柱、五棱柱、六棱柱等)，固定件30能够至少提供平面底部，组织块的一面贴附于培养槽40的槽底，固定件30的平面底部则压在组织块的另一面上。
56.在其中的一个实施例中，固定件30的大小、重量需要根据实际情况(例如培养槽40大小、组织块的类型)等进行合理设计，以能够固定住组织块，又不至于产生过大压强造成组织块和细胞的损坏为原则。例如，当组织块为华通氏胶时，可以设置固定件30施加给华通氏胶的压强约为500
‑
1000pa，根据华通氏胶的特性和承受能力计算，500
‑
1000pa压强既可固定住华通胶，又不至于压强过大造成华通胶和干细胞的损坏。
57.在其中的一个实施例中，可以将整个固定装置的重量设置为约3.71g，连接件20的底部和固定件30的底部均为平面底部，它们共同组成一个平台，平台的面积约为1cm2，平台重量约1g，产生0.0098n的力，平台底部华通氏胶的面积约10
‑
20mm2，承受压强p＝f/s，约为500
‑
1000pa，根据华通氏胶的特性和承受能力计算，500
‑
1000pa压强既可固定住华通胶，又不至于压强过大造成华通氏胶和干细胞的损坏。而当培养的组织块并非华通氏胶时，固定装置的重量、平台的大小、平台的重量等则需要根据实际的情况进行灵活调整。
58.本发明实施例的连接件20用于连接衔接件10和固定件30，连接件20的首端与衔接件10活动连接，活动连接的方式使得衔接件10与连接件20之间的角度可以发生变化，便于调整连接件20的位置，便于整个固定装置与培养槽40的连接；连接件20的尾端与固定件30连接。连接件20与固定件30的连接方式可以为固定连接、也可以为活动连接。
59.在本发明的其中一个实施方式中，连接件20包括对称而设的第一连接臂21和第二连接臂22，衔接件10设置在第一连接臂21的首端和第二连接臂22的首端之间；第一连接臂21的首端与衔接件10转动连接，第二连接臂22的首端与衔接件10转动连接；固定件30设置在第一连接臂21的尾端和第二连接臂22的尾端之间。整个装置采取左右对称的设置方式，能够为组织块提供均匀受力，且装置美观大方。
60.作为优选的实施方式，第一连接臂21的首端和第二连接臂22的首端之间设置有连接柱，连接柱的一端与第一连接臂21连接，连接柱的另一端与第二连接臂22连接，连接柱插入衔接件10与衔接件10转动连接。
61.又或者，作为优选的实施方式，第一连接臂21的首端设置有第一凸柱，第二连接臂22的首端设置有第二凸柱，衔接件10与第一连接臂21相对应的侧面上设置有与第一凸柱匹配的第一凹槽，衔接件10与第二连接臂22相对应的侧面上设置有与第二凸柱匹配的第二凹槽，第一凸柱与第一凹槽转动连接，第二凸柱与第二凹槽转动连接，从而使得第一连接臂21和第二连接臂22均与衔接件10转动连接。第一凸柱和第二凸柱优选为圆柱形凸柱，第一凹
槽和第二凹槽优选为圆柱形凹槽。
62.作为优选的实施方式，第一连接臂21包括第一倾斜件23和第一平置件25，第二连接臂22包括第二倾斜件24和第二平置件26；第一倾斜件23与衔接件10转动连接，第二倾斜件24与衔接件10转动连接；固定件30设置于第一平置件25和第二平置件26之间。衔接件10与培养槽40的侧壁连接后，倾斜设置的连接件20自然向培养槽40的底部倾斜。
63.作为优选的实施方式，第一平置件25设置有平面底部，第二平置件26设置有平面底部，固定件30夹设于第一平置件25和第二平置件26之间；第一平置件25的平面底部、固定件30的平面底部和第二平置件26的平面底部三者依次相接且在同一个水平面上，第一平置件25的平面底部、固定件30的平面底部和第二平置件26的平面底部共同组成一个平台，此组织块培养过程中，此平台压在组织块上。而在另外的实施例当中，连接件20也可以仅提供连接作用，用于连接衔接件10和固定件30，仅由固定件30提供用于压设固定组织块的平面。
64.在本发明的其中一个实施方式中，连接件20也可以只设置一个连接臂，通过一个连接臂与固定件30连接。此时，为了受力更加均匀，连接臂与固定件30的顶面中央连接，或者连接臂与固定件30相对的侧面的中央连接。
65.在本发明的其中一个实施方式中，连接件20和固定件30可以是分开制作的两个部件，制作完成后进行组装；连接件20与固定件30也可以是一体成型的部件。
66.本发明实施例所提供的用于组织块培养的固定装置，利用组织块进行细胞培养时，组织块是夹持固定在固定件30的平面底部和培养槽40的槽底之间的，更换培养液时，组织块处在固定位置，不会发生位移，因此不会影响细胞继续从固定件30的平面底部和培养槽40的槽底之间游出，并保持贴壁生长，从而提高了组织块的利用率较，提高了原代细胞的产量。
67.如图3
‑
4所示，本发明一实施方式还提供了一种组织块培养系统，包括至少一个培养单元，培养单元包括：
68.培养槽40，培养槽40用于承装细胞培养液和组织块；
69.至少一个固定装置，固定装置包括衔接件10、固定件30和连接件20；
70.衔接件10用于与培养槽40可拆卸连接；
71.固定件30至少设置有平面底部，固定件30用于固定组织块，以使组织块夹持固定在固定件30的平面底部和培养槽40的槽底之间；
72.连接件20的首端与衔接件10活动连接，连接件20的尾端与固定件30连接。
73.在本发明的其中一个实施方式中，组织块为华通氏胶。
74.作为优选的实施方式，还包括培养容器50，培养容器50用于收容培养单元。例如，包括多个培养单元，多个培养单元一一排列设置在培养容器50内；具体地，也可以仅设置一个培养单元，一个培养单元设置在一个培养容器50内。培养容器50的体积应当大于培养槽40的体积，以便于收容培养单元。培养容器50的选择包括但不限于方形容器、圆柱形容器等。
75.作为优选的实施方式，还包括盖体60，盖体60用于遮蔽培养槽40的槽口；或者，盖体60用于遮蔽培养容器50的容器口。
76.本发明一实施方式还提供了一种组织块培养方法，包括以下步骤：
77.将组织块接种在培养槽40中，并使组织块的一面贴附于培养槽40的槽底；
78.将固定装置与培养槽40进行组装，其中衔接件10与培养槽40进行可拆卸连接，固定件30压在组织块上；
79.向培养槽40中添加原始培养液，然后置于培养箱中培养。
80.在本发明的其中一个实施方式当中，组织块为华通氏胶，原始培养液为dmem
‑
f12无酚红培养基。
81.在本发明的其中一个实施方式当中，培养过程中2
‑
3天更换一次培养液，更换培养液时华通胶仍然处在固定位置，不影响细胞继续从中游出并贴壁生长。更加优选地，培养过程中每3天更换一次培养液。
82.作为优选的实施方式，在培养过程中，设置培养箱中co2的浓度为5％～15％，优选地为8％～12％，具体地可以设置为5％、7％、8％、10％、12％或15％，更加优选地co2的浓度为10％。
83.作为优选的实施方式，培养过程中需要更换培养液，更换培养液后每45
‑
50h向培养槽40中加入半胱氨酸，半胱氨酸的加入量为原始培养液体积的0.02％
‑
0.2％，半胱氨酸的储液为浓度1μmol/l。在添加半胱氨酸时，半胱氨酸按照储液浓度加入，不需要经过稀释，即半胱氨酸的加入浓度为1μmol/l。加入半胱氨酸既能提高华通胶的利用效率，又提高了细胞的增殖和迁移速率。
84.更加优选地，更换培养液后每48h向培养槽40中加入半胱氨酸(cystenie)，补加半胱氨酸量为原始培养液体积的0.1％cysteine，半胱氨酸的储液为浓度1μmol/l。
85.本发明实施例所提供的组织块培养方法，组织块利用率较高，原代细胞产量较高，且能够保证细胞细胞的增殖速率和迁移速率。
86.实施例1
87.一种采用固定装置的组织块培养系统，具体方案如下：
88.取直径为6mm培养皿，在培养皿的侧面卡上本发明实施例的固定装置，固定装置包括衔接件10、固定件30和连接件20，连接件20包括第一连接臂21和第二连接臂22，第一连接臂21和第二连接臂22的尾端均提供了平面底部，固定件30为长方体固定件30，两个连接臂的平面底部和长方体固定件30的底面共同形成一个小的平台(1cm
×
1cm)，固定装置利用自身重力产生的压力，使平板和培养皿底部贴紧。将脐带中剥离的华通胶小段夹在平板和培养皿底部之间，形成了一个培养单元，然后将培养单元放在直径为10mm的培养皿(培养容器50)中，形成一个培养系统，然后将培养系统用盖体60覆盖住即可。
89.整个固定装置的重量为3.71g，1cm2平台的重量约1g，产生0.0098n的力，平台底部华通氏胶面积约10
‑
20mm2，承受压强p＝f/s，约500
‑
1000pa，根据华通胶的特性和承受能力计算，500
‑
1000pa压强既可固定住华通氏胶，又不至于压强过大造成华通氏胶和干细胞的损坏。实施例1的固定装置由透明树脂材料制作而成，可直接用75％乙醇浸泡除菌。
90.实施例1的组织块培养方法包括以下步骤：
91.同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎；用mscs培养基(含15％血清的dmem
‑
f12无酚红培养基)重悬剪碎的华通氏胶，然后接种于6cm培养皿中，mscs培养基深度超过华通胶即可，接着放入10cm培养皿中并盖上盖体，最后将整个培养系统直接放于co2培养箱中静置培养，细胞在培养皿底部和平台底部皆可贴壁生长，并向外迁移，待细胞生长融合至80％
‑
90％时进行消化传代。整个培养系统是透明的，由透明树脂材料制成，操
作人员可直接在显微镜下观察细胞生长情况。
92.华通氏胶固定后，培养过程中2
‑
3d更换一次培养基，更换培养基时华通氏胶仍旧处在固定位置，不影响细胞继续从中游出并贴壁生长。但由于固定位置通气性较差，细胞迁移和培养速率较正常培养生长缓慢。如图5所示，图5a为无固定装置相同培养条件下，培养12天后细胞生长状态；图5b为使用实施例1固定装置培养12天后细胞生长状态。
93.因此，我们对在使用实施例1固定装置的情况下对细胞培养条件进行优化，改变培养时co2浓度，探索co2浓度为5％，10％和15％时，细胞的生长情况，培养时间为12天。结果如图6所示，图6a为5％co2条件下细胞生长状态；图6b为10％co2条件下细胞生长状态；图6c为15％co2条件下细胞生长状态。可见，在co2浓度为10％时，细胞迁移和生长速度较快。
94.接着，我们在10％co2培养条件的基础上对培养基成分进行优化，初始培养基为含15％血清的dmem
‑
f12无酚红培养基，培养过程中每3天更换一次培养基，更换培养基后每48h向体系中加入初始培养基体积0.1％的cysteine(cystenie储液浓度1μmol/l)，细胞增殖和迁移速率进一步提高，细胞生长状态较佳。如图7所示，图7a为不添加cysteine的时细胞生长状态图，图7b为添加0.1％(v/v)cysteine时细胞生长状态图，可见，添加0.1％(v/v)cysteine后细胞生长状态较佳。
95.综上，利用华通氏胶进行组织块培养时，加入本发明实施例的固定装置，且优化培养条件，设置培养箱co2浓度为10％，并在培养时每48h加入原始培养液体积0.1％的cysteine(cystenie储液浓度1μmol/l)，既能提高华通氏胶的利用效率，又提高了细胞的增殖和迁移速率。使用了本发明实施例的固定装置，华通氏胶得到固定，大大方便了换液时操作。
96.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。