一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰RNA（siRNA）

一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)
技术领域
1.本发明涉及靶向给药领域，尤其涉及一种rna干扰领域的小干扰rna(sirna)。


背景技术：

2.核酸类药物又称核苷酸类药物，是各种具有不同功能的寡聚核糖核苷酸(rna)或寡聚脱氧核糖核苷酸(dna)，主要在基因水平上发挥作用。当前有多种寡聚核苷酸类药物被开发用于疾病的治疗，如sirna，microrna，mrna，反义寡核苷酸(aso)，核酸适体药物等。自1998年fire和mello首次提出rnai(rna interference，rna干扰)概念以来，越来越多的人开始重视小rna的研究，之后rnai在基因功能的研究中也得到广泛应用。rnai是一种存在于真核生物中的转录后基因沉默现象，在生物进化过程中能够抵御病毒感染及防止基因组中由于逆转座子元件扩增引起的不稳定。在mirna(microrna)、sirna(small interfering rna)等小rna的介导下，rnai能够特异性地调控mrna基因在表观遗传学水平、转录水平及转录后水平的表达。
3.其中，sirna(small interfering rna；小干扰rna)近年来的研究应用受到广泛的关注。小干扰rna是一个长20到25个核苷酸的双股rna，在生物学上有许多不同的用途，例如，当前patisiran/onpattro已经被fda批准用于治疗患有遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的成年患者。目前已知sirna主要参与rna干扰(rnai)现象，小干扰rna可通过与互补序列的结合，启动rnai过程，引起相应基因mrna的降解，影响相应蛋白的表达，或以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与rnai相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。sirna具有明确定义的结构：具有磷酸化5'末端的短(通常20至24bp)双链rna(dsrna)和具有两个突出核苷酸的羟基化3'末端。该切酶酶催化生产的sirna由长的dsrna和小发夹rna。sirna也可以通过转染引入细胞。由于原则上任何基因都可以被具有互补序列的合成sirna敲低，因此sirna是在后基因组时代验证基因功能和药物靶向的重要工具。
4.但是，在临床试验及实践中，单独sirna药物的药物稳定性低，核酸与血浆蛋白之间的结合较弱，具有一定程度的脱靶性，因此，其靶向药物活性及成药性较低、肾清除率较高，最终导致该药物在体内的半衰期短，需要较频繁地进行给药。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题至少之一，本发明提供一种经过三氟甲基碱基类似物修饰改性的小干扰rna(sirna)，它克服了寡核苷酸在血清中易被核酸酶降解的特性。
6.上述的一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，所述小干扰rna的中间插入和/或末端连接修饰一个或多个双三氟甲基苯核苷酸。
7.上述的一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，所述小干扰rna末端连接修饰一个或多个双三氟甲基苯核苷酸。
8.上述的一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，所述小干扰rna末端连
接修饰两个双三氟甲基苯核苷酸。
9.上述的一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，所述小干扰rna的3’末端修饰两个双三氟甲基苯核苷酸。
10.上述的一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，所述小干扰rna的特异性靶基因为stat3，所述小干扰rna的序列如seq id no.:1、seq id no.:2、seq id no.:3、seq id no.:4所示的一种。
11.上述的一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，所述小干扰rna的特异性靶基因为pd-l1，所述小干扰rna的序列如seq id no.:5、seq id no.:6、seq id no.:7、seq id no.:8所示的一种。
12.上述的一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，所述小干扰rna用于肺癌治疗。
13.上述的一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，所述三氟甲基碱基类似物通过固相合成的方式插入和/或修饰在小干扰rna的中间和/或末端位置。
14.本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含上述任一项所述的含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，和一种或多种医学和/或药学上可接受的赋形剂。所述药物组合物用于靶向给药。
15.本发明的优点和有益效果在于：
16.本发明提供了一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，采用三氟甲基苯核苷酸对小干扰rna(sirna)进行插入或连接修饰，最终增强小干扰rna对与血浆蛋白之间的结合，由于与血浆蛋白的结合，既保护其不被剪切也可改善其极易被肾清除的情况，延长其在体内的循环时间，增强其在靶标部位的富集，达到了改善小干扰rna稳定性、成药性及药物半衰期的目的。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1是本发明实施例1小干扰rna(sirna)血清稳定性测试结果示意图；
19.图2是本发明实施例1小干扰rna(sirna)干扰效果测试结果示意图；
20.图3是本发明实施例1小干扰rna(sirna)在标靶部位浓度测试结果示意图；
21.图4是本发明实施例1小干扰rna(sirna)在标靶部位浓度测试结果示意图；
22.图5是本发明实施例1小干扰rna(sirna)细胞毒性测试结果示意图；
23.图6是本发明实施例1小干扰rna(sirna)动物靶向治疗结果示意图；
24.图7是本发明实施例2小干扰rna(sirna)血清稳定性测试结果示意图；
25.图8是本发明实施例2小干扰rna(sirna)干扰效果测试结果示意图；
26.图9是本发明实施例2小干扰rna(sirna)在标靶部位浓度测试结果示意图；
27.图10是本发明实施例2小干扰rna(sirna)在标靶部位浓度测试结果示意图；
28.图11是本发明实施例2小干扰rna(sirna)细胞毒性测试结果示意图；
29.图12是本发明实施例2小干扰rna(sirna)动物靶向治疗结果示意图。
具体实施方式
30.下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
31.小干扰rna(sirna)
32.本发明记载了一种含有三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)，可将一个或多个双三氟甲基苯核苷酸插入此种小干扰rna序列中，或者在其序列末端进行连接修饰。其中，本领域操作人员可根据实际需求决定插入或连接修饰的双三氟甲基苯核苷酸基团数量。在一种实施例中，可将小干扰rna末端连接修饰一个双三氟甲基苯核苷酸。
33.在上述实施例基础上，本发明设计出特异性针对stat3靶基因(实施例2)的含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)序列：seq id no.:1、seq id no.:2、seq id no.:3及seq id no.:4(具体序列可参见后文表1)；及特异性针对pd-l1靶基因(实施例1)的含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)序列：seq id no.:5、seq id no.:6、seq id no.:7、seq id no.:8(具体序列可参见后文表1)，但不排除本领域操作人员可以在本发明所记载的序列基础上进行本领域惯用的其他修饰和设计方法设计出本发明所记载的序列的替代序列。
34.需要指明的是，本发明所记载的靶基因pd-l1为程序性死亡分子1(programmed death-1，pd1)，pd-l1及其适配体(programmed death ligand，pdl)属于b7家族的共刺激分子，其可介导免疫反应的负性调节信号，在肿瘤发生、病毒感染以及自身免疫病中可发挥特异性的调节作用。本发明所记载的靶基因stat3是位于17号染色体的基因，其所编码的蛋白质为信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription)家族的一员，能与dna结合而发挥作用。stat家族包括7个结构和功能相关的蛋白stat1、stat2、stat3、stat4、stat5a、stat5b及stat6。其通常对各种细胞外的细胞因子和生长因子信号做出应答，是一类含有能与磷酸化酪氨酸结合的sh2信号分子。该蛋白响应细胞刺激而介导多种基因的表达，因此在许多细胞过程(例如细胞生长和凋亡)中起关键作用。该基因的突变与婴儿发作的多系统自身免疫疾病和高免疫球蛋白e综合征有关。[参见stat3 gene-genecards|stat3 protein|stat3antibody]
[0035]
同时，本领域操作人员也可用类似原理设计出特异性针对其他靶基因的序列，如特异性针对巨细胞病毒cytomegalovirus(cmv)、抑癌基因p53(tp53)的含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)序列。
[0036]
合成方式
[0037]
本发明采用固相合成的方式将三氟甲基碱基类似物插入、连接修饰于小干扰rna(sirna)序列的中部或末端(具体位置及数量可根据实际需要进行优化及调整)。
[0038]
体内稳定性测试
[0039]
在一个实施例中，为了测试三氟甲基碱基类似物修饰的小干扰rna(sirna)序列在体内的稳定性，可使用荧光分子化合物再次对该小干扰rna(sirna)进行修饰，之后通过荧光测试观察体内荧光信号强度，从而对其体内稳定性进行评价。作为为一种优选方案，荧光分子化合物可选用cy5(cyanine5)(具体操作步骤见后文实施例)。
[0040]
药物组合物
[0041]
本发明另一方面还涉及了一种药物组合物，该药物组合物包含上文所述的任何一种含三氟甲基碱基类似物的小干扰rna(sirna)以及一种或多种医学和/或药学上可接受的赋形剂药物组合物。
[0042]
本文所用的“药物组合物”涉及生理上可耐受的组合物和分子实体。
[0043]
术语“赋形剂”是指在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；中药丸剂中的酒、醋、药汁等；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
[0044]
术语“医学和/或药学上可接受”，一般是指此赋形剂与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。
[0045]
优选地，上述药物组合物在临床治疗中可用于靶向给药。
[0046]
在临床试验中，可使用荧光分子化合物，如cy5(cyanine5)再次对该反义寡核苷酸进行修饰，之后通过荧光测试观察体内荧光信号强度，从而对其体内稳定性进行评价(具体操作步骤见后文实施例)，从而进一步判断此种药物组合物的药物半衰期，以确定治疗时的给药间隔及给药剂量。
[0047]
实施例
[0048]
本专利通过固相合成的方式将三氟甲基碱基类似物连接修饰于小干扰rna(sirna)的末端，构建了一系列不同的寡核苷酸，如表1所示。
[0049]
名称靶基因序列sirna-1s(seq id no.:1)stat3aacaucugccuagaucggcuauu-ffsirna-1a(seq id no.:2) aauagccgaucuaggcagauguu-ffsirna-2s(seq id no.:3)stat3cagggugucagaucacaugggcuaa-ffsirna-2a(seq id no.:4) uuagcccaugugaucugacacccug-ffsirna-3s(seq id no.:5)pdl1uaugguggugccgacuacaa-ffsirna-3a(seq id no.:6) uuguagacggcaccaccaua-ffsirna-4s(seq id no.:7)pdl1agaccuugauacuuucaaauu-ffsirna-4a(seq id no.:8) aauuugaaaguaucaaggucu-ff
[0050]
表1
[0051]
实施例1
[0052]
基于三氟甲基碱基类似物改性的特异性靶基因为pd-l1小干扰rna(sirna)——pdl1-sirna：(seq id no.:5and seq id no.:6)
[0053]
1、产品血清稳定性
[0054]
如图1所示，通过琼脂糖凝胶实验考查三氟甲基碱基类似物修饰后的针对pd-l1的sirna序列的稳定性，将不同的sirna序列分别与含有10％血清的培养基孵育0-72小时，通过10％的page胶检测剩余的核酸量。结果显示修改后的sirna血清稳定性明显增加。
[0055]
2、产品功效
[0056]
如图2所示，通过定量pcr实验考查三氟甲基碱基类似物修饰的sirna序列对pdl1
的干扰效果。将sirna序列(10nm)通过转染试剂转染入h460细胞(肺癌细胞)内，孵育72小时，提取细胞内的rna，通过定量pcr考查pd-l1的干扰效果，结果显示相较于单纯的sirna，三氟甲基碱基类似物修饰的aso保持了其干扰效果。
[0057]
3、产品体内稳定性
[0058]
如图3、图4所示，通过小鼠体内实验考查三氟甲基碱基类似物修饰的sirna序列体内稳定性。将cy5修饰的f(三氟甲基碱基类似物)-sirna序列(50um，100ul)通过尾静脉注射入荷瘤小鼠(h460细胞(肺癌细胞))体内，观察0-48小时内小鼠体内肿瘤部位荧光变化。结果显示，三氟甲基碱基类似物修饰的sirna序列在肿瘤部位逐渐富集，且在48小时肾脏荧光消失后，肿瘤部位依然有很强的荧光信号。
[0059]
4、产品对细胞毒性的影响
[0060]
如图5所示，接种h460细胞(肺癌细胞)至96孔板，分别加入三氟甲基碱基类似物修饰的sirna序列及单纯的sirna序列。孵育48小时后，通过cck-8检测细胞活性。结果显示，三氟甲基碱基类似物修饰不影响细胞活性。
[0061]
5、抗肿瘤测试
[0062]
如图6所示，接种h460细胞至4-6周的小鼠皮下，待瘤体长至200mm3时开始注射药物。将小鼠随机分五组，dpbs，stat3，stat3-f，stat3+5fu，stat3-f+5fu，每周通过尾静脉给药两次。观察小鼠的体重及瘤体大小。靶向治疗结果显示，三氟甲基碱基类似物修饰的si rna显示出更好的抗肿瘤活性。
[0063]
实施例2
[0064]
基于三氟甲基改性的特异性靶基因为stat3的小干扰rna(sirna)——stat3-sirna(seq id no.:3and seq id no.:4)
[0065]
1、产品稳定性
[0066]
如图7所示，通过琼脂糖凝胶实验考查三氟甲基碱基类似物修饰后的针对stat3的sirna序列的稳定性，将不同的sirna序列分别与含有10％血清的培养基孵育0-72小时，通过10％的page胶检测剩余的核酸量。结果显示改性后的sirna血清稳定性明显增加。
[0067]
2、产品功效
[0068]
如图8所示，通过定量pcr实验考查三氟甲基碱基类似物修饰的sirna序列对stat3的干扰效果。将sirna序列(10nm)通过转染试剂转染入h460细胞(肺癌细胞)内，孵育72小时，提取细胞内的rna，通过定量pcr考查stat3的干扰效果，结果显示相较于单纯的sirna，三氟甲基碱基类似物修饰的aso保持了其干扰效果。
[0069]
3、产品体内稳定性
[0070]
如图9-10所示，通过小鼠体内实验考查三氟甲基碱基类似物修饰的sirna序列体内稳定性。将cy5修饰的f(三氟甲基碱基类似物)-sirna序列(50um，100ul)通过尾静脉注射入荷瘤小鼠(h460细胞(肺癌细胞))体内，观察0-48小时内小鼠体内肿瘤部位荧光变化。结果显示，三氟甲基碱基类似物修饰的sirna序列在肿瘤部位逐渐富集，且在48小时肾脏荧光消失后，肿瘤部位依然有很强的荧光信号。
[0071]
4、产品对细胞的影响
[0072]
如图11所示，接种h460细胞(肺癌细胞)至96孔板，分别加入三氟甲基碱基类似物修饰的sirna序列及单纯的sirna序列。孵育48小时后，通过cck-8检测细胞活性。结果显示，
三氟甲基碱基类似物修饰不影响sirna的功能，且在较低浓度下可引起细胞死亡。
[0073]
5.抗肿瘤测试
[0074]
如图12所示，接种h460细胞至4-6周的小鼠皮下，待瘤体长至200mm3时开始注射药物。将小鼠随机分五组，dpbs，stat3，stat3-f，stat3+5fu，stat3-f+5fu，每周通过尾静脉给药两次。观察小鼠的体重及瘤体大小。靶向治疗结果显示，三氟甲基碱基类似物修饰的sirna显示出很好的抗肿瘤活性。
[0075]
对所公开的实施例的上述说明，以便本技术领域的专业技术人员能够实现或使用本技术。针对这些实施例的多种修改，对本技术领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本技术的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本技术将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。