一种多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法

1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法。


背景技术：

2.多浪羊是新疆的一个优良肉脂兼用型绵羊品种，具有较高的繁殖能力。具有初情期早、肉质鲜嫩、产肉多等优良性状。初情期是动物获得繁殖能力的重要时期，在饲养过程中，初情期早的多浪羊可以增加母畜终生产羔数从而降低饲养成本，提高母畜利用率。
3.卵巢颗粒细胞作为卵巢的主要功能细胞，卵泡的生长发育和卵母细胞的生长都离不开卵巢颗粒细胞的支持，从卵泡生成到卵泡成熟排出从而达到初情期这整个发育过程中都起着重要作用。因此，采集卵巢颗粒细胞进行体外培养，是研究卵巢机制与初情期关系的基础，也是研究绵羊初情期启动相关基因功能的必备材料。
4.但目前已有的技术经常会出现颗粒细胞分离到采卵液中后会慢慢出现凝结现象，后续无法将颗粒细胞离心下来，收集获得的颗粒细胞较少。


技术实现要素：

5.为了解决技术中卵巢颗粒细胞分离获得率较低的技术问题，而提供一种多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法。本发明方法能够高效分离获得卵巢颗粒细胞，分离过程中采卵液不会发生凝结现象，本发明方法无污染、操作简单。
6.为了达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
7.一种多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法，包括如下步骤：
8.(1)卵巢采集：采集多浪羊健康的子宫两侧卵巢，消毒清洗；
9.(2)分离获得颗粒细胞：取上一步处理的所述卵巢每10
‑
15个置于盛有4
‑
5ml采卵液的无菌培养皿中，采用一次性手术刀片划破卵泡，并采用所述手术刀片按压所述卵泡促使卵泡中的细胞液流出，然后进行离心分离，弃去上清获得沉淀；将所述沉淀进行细胞重悬，再进行多次离心分离后获得颗粒细胞；
10.所述采卵液的组成为肝素钠、双抗、dmem，所述肝素钠、所述双抗、所述dmem的用量比例为(0.02
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0.05)g:(0.5
‑
1)ml:(49.5
‑
49)ml；所述双抗为青链霉素混合液；肝素钠可防止采卵液凝结，双抗具有抑菌功能；
11.(3)颗粒细胞培养：在上一步所得的所述颗粒细胞中加入1ml完全培养基进行重悬，然后再加入6
‑
8ml所述完全培养基进行培养48h后得到原代培养细胞，去培养液，用pbs缓冲液清洗贴壁细胞，弃清洗液，加入6
‑
8ml完全培养基置于培养箱中培养36h至细胞贴壁率达到70
‑
80％后，弃培养液，加入3mlpbs缓冲液清洗贴壁细胞1
‑
2次，弃清洗液；
12.加入1～2ml 0.25％胰酶，培养箱恒温消化2
‑
5min，加入与所述胰酶等量的完全培养基终止胰酶反应，混匀后于1500rpm下进行离心分离5min，弃上清液，于另外两个完全培养基中重悬细胞后进行培养箱培养获得传代培养细胞。
13.进一步地，步骤(1)中所述清洗消毒的过程是：所述卵巢经手术剪剪下后用75％酒精清洗以去除污血，放入预冷的pbs中，转移至无菌室中，再次采用75％酒精浸泡所述卵巢30s，取出后采用pbs缓冲液冲洗3
‑
5次。
14.进一步地，步骤(2)中经过采集所述细胞液的所述卵泡后置于另一新的所述采卵液中进行重复划破、按压操作以避免有遗漏的卵泡。
15.进一步地，步骤(2)中所述离心分离的速率为1500
‑
2000rpm、时间为4
‑
5min。
16.进一步地，步骤(2)中所述细胞重悬采用重悬液加入至所述沉淀中进行多次离心分离，所述重悬液为含有双抗的dmem，所述双抗与所述dmem的体积比为3:100。
17.进一步地，步骤(3)中所述完全培养基的组成为双抗、胎牛血清、dmem按照体积比为1:5:44进行配制获得。
18.进一步地，步骤(4)中所述培养箱培养的条件是37℃、5％co2。
19.有益技术效果：
20.本发明提供了一种能够高效分离获得卵巢颗粒细胞并培养的方法，本发明采用加有双抗和肝素钠的采卵液进行卵泡细胞液的采集，在采集过程中采卵液不会出现凝结现象，且采集过程无污染，能够高效、快捷的分离获得较多地卵巢颗粒细胞，为后续试验的开展提供高效帮助。
附图说明
21.图1为多浪羊卵巢卵泡实物图。
22.图2为实施例1采用手术刀片获取多浪羊卵巢卵泡的方式图。
23.图3为实施例1中分离出的颗粒细胞接种到培养皿中的显微状态图。
24.图4为实施例1获得的颗粒细胞在显微镜下观察贴壁24h、48h、72h以及贴壁已长满的细胞状态图，其中a为培养24h、b为培养48h、c为培养72h、d为培养96h。
25.图5为实施例1传代培养过程中恒温消化后的细胞状态显微镜图。
26.以上显微镜图中的标尺均为200μm。
具体实施方式
27.下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值不限制本发明的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
29.dmem、肝素钠、青链霉素混合液(俗称双抗)、pbs缓冲液、0.25％胰酶、胎牛血清fbs均购自gibco公司。
30.实施例1
31.一种多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法，包括如下步骤：
32.(1)卵巢采集：采集经颈部放血处死的多浪母羊，将位于子宫两侧的卵巢用无菌手术剪剪下，用75％酒精冲(喷)洗一遍消毒，去除污血，放入预冷的pbs缓冲液瓶中(泡沫保温箱内加冰袋预冷)，在4
‑
5h内迅速转移至无菌室操作；
33.取上述卵巢剪去卵巢周边多余的结缔组织后放入一个灭菌烧杯中，加入75％酒精浸泡30s，倒掉酒精，pbs缓冲液冲洗3
‑
5次；
34.(2)分离获得颗粒细胞：将经处理的、每10
‑
15个卵巢放入一个6cm无菌培养皿中，该无菌培养皿中事先盛有4
‑
5ml采卵液，该采卵液的配方：0.035g肝素钠与1ml双抗溶于49ml dmem中；用无菌手术刀片将每一个卵巢的透明卵泡(多浪羊卵巢卵泡实物图如图1所示，图1中箭头所指即为透明的卵泡)划破并用刀片按压促使卵泡中的细胞液流出到采卵液中(采用手术刀片获取多浪羊卵巢卵泡的方式如图2所示)，检查划过的卵巢是否有遗漏的卵泡未进行处理，若有遗漏可将该卵巢放入一个全新的加有采卵液的6cm无菌培养皿中，重复上述操作按压释放卵泡中的细胞液；
35.将每个无菌培养皿中得到的采卵液分别置于15ml离心管中，2000rpm离心4min，弃上清液，得到沉淀；
36.然后配置含3％双抗洗涤液(含双抗1.5ml、dmem 48.5ml)，在上述沉淀的离心管中加入2ml的3％双抗洗涤液进行细胞重悬，然后在1500rpm下离心分离5min，弃上清液。此步骤重复操作3遍，获得颗粒细胞沉淀；
37.(3)颗粒细胞培养：
38.配制完全培养基：dmem 44ml、fbs 5ml、双抗1ml；
39.原代培养：将步骤(2)得到的颗粒细胞沉淀加入1ml完全培养基重悬，然后全部转移至含有6
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8ml完全培养基的10cm无菌培养皿中，放入37℃、5％co2培养箱内培养，在培养皿的边缘标注细胞种类、日期等信息。(图3所示为分离出的颗粒细胞接种到培养皿中的显微状态图。)
40.分别在显微镜下观察不同培养时间(24h、48h、72、96h或更长时间)下细胞贴壁状态，结果如图4所示，其中a为培养24h、b为培养48h、c为培养72h、d为培养96h，培养96h时贴壁细胞已长满。由图4可知本发明方法分离出的颗粒细胞纯度较高且细胞活性好。
41.传代培养：得到原代细胞后先弃去培养液，用2ml pbs缓冲液清洗贴壁细胞(上下左右晃动)，将漂浮杂质洗去,弃清洗液，加入6
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8ml完全培养基置于37℃、5％co2的培养箱中培养36h至细胞贴壁率达到70
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80％后，弃培养液；加入3ml pbs缓冲液清洗贴壁细胞2次，弃清洗液；加入1ml 0.25％胰酶，培养箱恒温消化3
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5min，待细胞全部皱缩变圆(如图5所示)，开始出现大量流动状态，加入与胰酶等量的完全培养基终止胰酶消化反应，混匀后将混合液全部转移至15ml离心管，1500rpm下进行离心分离5min，弃上清液；再次加入2ml完全培养基重悬细胞，然后分配到两个10cm无菌培养皿中(1传2)于培养箱中进行传代培养24h后得到传代培养细胞。
42.对比例1
43.本对比例的多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤(2)的采卵液为50ml dmem。
44.对比例2
45.本对比例的多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤(2)的采卵液为49ml dmem+1ml双抗。
46.对比例3
47.本对比例的多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤(2)的采卵液为49ml dmem+1ml双抗+0.035g肝素钠+0.05g pva。
48.对比例4
49.本对比例的多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤(2)中对卵巢用吸有3
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4ml采卵液(dmem 49ml+双抗1ml+肝素钠0.035g)的10ml无菌注射器进行抽吸,针孔向下，边扎边吸卵巢中卵泡的细胞液，尽量不让内部细胞液流出。
50.以上实施例及对比例的操作过程及结果见表1。
51.表1实施例及对比例的操作过程及结果
[0052][0053]
由表1可知，对比例1采用手术刀片分离卵巢颗粒细胞的过程中出现采卵液凝结现象，分离过程中细胞液中纤维蛋白酶合成了纤维蛋白(为一种胶状物)导致采卵液凝结，使得颗粒细胞获取极少，不加双抗的细胞污染的较大。
[0054]
对比例2中在分离卵巢颗粒细胞的过程中，采卵液也出现凝结现象，同样形成纤维蛋白胶状物，使得细胞获取极少。
[0055]
实施例1采用双抗+肝素钠+dmem的采卵液在分离卵巢颗粒细胞的过程中，采卵液未发生凝结现象，能够分离获取较多颗粒细胞，获取的颗粒细胞可分装在2
‑
3个10cm的培养皿中，且后续无污染出现。
[0056]
对比例3采用双抗+肝素钠+pva+dmem的采卵液在分离卵巢颗粒细胞的过程中，采卵液也未发生凝结现象，也能够分离获取较多颗粒细胞，获取的颗粒细胞可分装在2
‑
3个10cm的培养皿中，且后续无污染出现。
[0057]
对比例4采用注射器抽吸法进行采卵相较于本发明采用刀片划割的方法，对比例4获取的颗粒细胞相较于实施例1少的多，所获得的颗粒细胞可培养于1个10cm培养皿，后续无污染出现。
[0058]
本发明采用双抗+肝素钠+dmem的采卵液配方能够分离获得更多的颗粒细胞，无需加pva分散剂也能够高效、快捷的分离出较多卵巢颗粒细胞，也无需采用操作方式较为复杂的注射器抽吸法进行就能获得分离率较多的卵巢颗粒细胞。
[0059]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。