用于SBDS基因突变检测的引物组及基因扩增方法与流程

用于sbds基因突变检测的引物组及基因扩增方法
技术领域
1.本发明专利涉及一种用于sbds基因突变检测的引物组及基因扩增方法，属于生物技术领域。


背景技术：

2.shwachman
‑
diamond综合征（sds，omim260400），也称shwachman
‑
bodian
‑
diamond综合征（sbds），是一种罕见的常染色体隐性遗传病，由shwachman于1964首次报道。sds主要临床表现为骨髓衰竭和胰腺外分泌功能障碍.多数患者伴身材矮小,骨骼畸形,肝功能不全,重症感染等。尽管sds的发病率只有1：77000，但它是胰腺外功能不全和骨骼功能障碍的常见原因之一，90%的sds患者存在sbds基因突变。
3.sbds基因位于染色体7q11，全长7907bp，包含5个外显子。sbdsp是sbds的假基因，两者之间的dna序列有97%的同源性，这种高度同源的序列对sbds基因突变的正确检出产生极大的干扰。使用sanger测序和商业化的捕获探针高通量测序均不能有效区分sbds和sbdsp的序列，从而降低了sbds基因突变的检出率，并存在一定的假阳性。因此本领域亟需提供一种可以有效检测sbds基因突变的新方法，以提高检测准确率，简化操作流程，提高时效性。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于重组酶的基因捕获方法。
5.本发明采取的技术方案为：一种用于sbds基因突变检测的引物组，包括1对长片段pcr引物和5对巢氏pcr引物，长片段pcr引物sbds
‑
l的序列如seq id no.1
‑
2所示，第一对巢氏pcr引物sbds
‑
1的序列如seq id no.3
‑
4所示，第二对巢氏pcr引物sbds
‑
2的序列如seq id no.5
‑
6所示，第三对巢氏pcr引物sbds
‑
3的序列如seq id no.7
‑
8所示，第四对巢氏pcr引物sbds
‑
4的序列如seq id no.9
‑
10所示，第五对巢氏pcr引物sbds
‑
5的序列如seq id no.11
‑
12所示。
6.本发明还公开了一种用于sbds基因突变检测的基因扩增方法，其步骤包括：提取样本基因组dna，以样本基因组dna为模板，以长片段pcr引物sbds
‑
l为引物进行长链pcr反应，再以长链pcr反应产物为模板，以5对巢氏pcr引物中任一对或几对为引物，进行pcr反应，得到sbds基因扩增片段。
7.优选的，长链pcr反应采用kod fx neo聚合酶。
8.优选的，长片段pcr引物sbds
‑
l在长链pcr反应体系中的浓度为0.15μm。
9.本发明的有益效果为：本发明提供了一种用于sbds基因突变检测的引物组，包括一对扩增sbds全长基因的长片段pcr引物，扩增产物长达约13kb。并针对每个外显子设计了共5对巢氏pcr引物，能有效区分sbds和sbdsp序列，大幅提高了sbds基因突变检测的准确率。本发明提供的序列和方法能有效区分sbds及其假基因sbdsp序列，检测准确率高，操作方便快捷，成本低廉。
附图说明
10.图1为sbds
‑
l长片段pcr产物琼脂糖凝胶电泳图，图中条带1：1kb dna ladder 、2：sbds
‑
l长片段扩增产物。
11.图2为sbds
‑
1、sbds
‑
2、sbds
‑
3、sbds
‑
4、sbds
‑
5巢氏pcr产物琼脂糖凝胶电泳图，图中条带 1：1kb dna ladder、 2：sbds
‑
1巢氏扩增产物、 3：sbds
‑
2巢氏扩增产物、 4：sbds
‑
3巢氏扩增产物、 5：sbds
‑
4巢氏扩增产物、 6：sbds
‑
5巢氏扩增产物。
12.图3 为sbds疑似病例sbds
‑
2引物巢氏pcr产物琼脂糖凝胶电泳图，图中条带1：1kb dna ladder、 2：sbds疑似病例sbds
‑
2巢氏 扩增产物。
13.图4为样本中sbds基因chr7:66994210(grch38/hg38)，t突变为c的sanger测序结果。
14.图5为样本中sbds基因chr7:66994286
‑
66994287(grch38/hg38)，ta突变为ct的sanger测序结果。
具体实施方式
15.通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本发明采用的引物序列如下：长片段引物sbds
‑
l forward primer：5
’‑
gtcaattttccccatgcttaggg
‑3’
(seq id no.1)长片段引物sbds
‑
l reverse primer：5
’‑
cagaaataagcacctcccagagt
‑3’
(seq id no.2)巢氏引物sbds
‑
1 forward primer：5
’‑
gtaaaacgacggccagtaggaatgttccatttcctcccc
ꢀ‑3’
(seq id no.3)巢氏引物sbds
‑
1 reverse primer：5
’‑
caggaaacagctatgacaaatacgccaaggaaaagcacc
ꢀ‑3’
(seq id no.4)巢氏引物sbds
‑
2 forward primer：5
’‑
gtaaaacgacggccagttagaagtgacactgtgcagttca
ꢀ‑3’
(seq id no.5)巢氏引物sbds
‑
2 reverse primer：5
’‑ꢀ
caggaaacagctatgacatttgttgtgtcttgccgttcat
‑3’
(seq id no.6)巢氏引物sbds
‑
3 forward primer：5
’‑
gtaaaacgacggccagtcctcaagcaatcctcccatctt
ꢀ‑3’
(seq id no.7)巢氏引物sbds
‑
3 reverse primer：5
’‑
caggaaacagctatgactgggattacagatgtgagccac
ꢀ‑3’
(seq id no.8)巢氏引物sbds
‑
4 forward primer：5
’‑
gtaaaacgacggccagtctgagatagcaccactgcactc
ꢀ‑3’
(seq id no.9)巢氏引物sbds
‑
4 reverse primer：5
’‑
caggaaacagctatgacacctggccttcactttct
tcat
ꢀ‑3’
(seq id no.10)巢氏引物sbds
‑
5 forward primer：5
’‑
gtaaaacgacggccagtggtgtttacaagtacaggccct
ꢀ‑3’
(seq id no.11)巢氏引物sbds
‑
5 reverse primer：5
’‑
caggaaacagctatgaccgccctacccattgtcttatct
ꢀ‑3’
(seq id no.12)为了便于sanger测序，在巢氏引物 forward primer的 5’均增加了测序引物m13f：5
’‑
gtaaaacgacggccagt
‑3’
，在巢氏引物reverse primer 的5’均增加了测序引物m13r：5
’‑
caggaaacagctatgac
‑3’
。
16.实施例1使用molpure
® blood dna kit (yeasen 18730)提取人血基因组dna，并去除rna。提取的dna od260/280在1.8
‑
2.0之间。
17.长片段pcr扩增试剂选用kod fx neo dna聚合酶(toyobo kfx
‑
201)。巢氏pcr扩增试剂选用2
×
hieff
®
pcr master mix(with dye) (yeasen 10102)。
18.表1 长片段pcr反应体系：组分体积μl2
×
pcrbufferforkodfxneo12.52mmdntp5sbds
‑
lf(10μm)0.35sbds
‑
lr(10μm)0.35kodfxneo(1u/μl)0.5基因组25ngddh2oupto25μl所述长片段pcr扩增程序为94℃预变性 2min，然后进行30个循环，每个循环94℃ 15s，68℃ 13min，最后10℃保温直到使用。
19.取1μl长片段pcr扩增产物跑电泳，琼脂糖凝胶浓度为0.7%，电泳条件为120v，40min，marker选用1kb dna ladder (yeasen 10510)，电泳结果如图1所示。可以看出，成功扩增出目的片段，目的片段的长度为12896bp。
20.将一轮长片段pcr产物用ddh2o稀释1000倍，作为模板进行二轮巢氏pcr。
21.表2 巢氏pcr反应体系：组分体积μl2
×
hieff
®
pcrmastermix(withdye)12.5primerf(10μm)0.5primerr(10μm)0.5一轮扩增产物稀释模板1ddh2oupto25μl所述巢氏pcr引物包括sbds
‑
1、sbds
‑
2、sbds
‑
3、sbds
‑
4、sbds
‑
5，对应的pcr产物片段长度分别为597、405、591、589、1118bp。
22.所述巢氏pcr扩增程序为94℃预变性 5min，然后进行30个循环，每个循环94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃ 延伸30s，循环结束后72℃ 10min，4℃保温。
23.取1μl扩增产物跑电泳，引物分别使用sbds
‑
1、sbds
‑
2、sbds
‑
3、sbds
‑
4、sbds
‑
5，琼脂糖凝胶浓度为2%，电泳条件为120v，30min，电泳结果如图2所示，扩增出来的片段和目标片段大小一致。
24.实施例2使用本发明检测1例 sbds疑似病例的血液样本。该病例血液dna经高通量测序分析sbds或其同源区域存在两个突变位点。疑似突变位点1：chr7:66994210(grch38/hg38)，t突变为c，该位点位于sbds内含子2的末2位，为可变剪接位点；疑似突变位点2：chr7:66994286
‑
66994287(grch38/hg38)，ta突变为ct，该位点位于sbds外显子2。由于高通量测序reads的读长较短（双端150bp），不能准确分辨同源区域，检测的突变仍需另一种方案进行确定。
25.该样本dna经sbds
‑
l进行长片段pcr后，选用sbds
‑
2巢氏引物进行二轮扩增，pcr产物跑电泳确定扩增产物和目标片段大小一致，电泳结果如图3所示。外送进行sanger测序验证，检测相关区域是否存在突变。
26.sanger测序结果如图4和图5所示，表明该样本确实存在chr7:66994210 t＞c（剪切位点突变c.258+2t＞c），chr7:66994286
‑
66994287 ta＞ct(无义突变c.183_184 ta＞ct) 突变。这两种突变是sbds最常见的两种突变形式。