构建产L-丝氨酸大肠杆菌的方法与流程

构建产l
‑
丝氨酸大肠杆菌的方法
技术领域
1.本发明属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种构建产l
‑
丝氨酸大肠杆菌的方法以及该菌株的应用。


背景技术：

2.l
‑
丝氨酸，即β
‑
羟基丙氨酸，在生物体细胞内处于多种氨基酸和生物活性蛋白代谢中枢，对机体的生长至关重要，l
‑
丝氨酸还在化工、农药、化妆品等行业有着关键的应用。
3.目前，l
‑
丝氨酸生产方法通常有蛋白质水解提取法、化学合成法、生物酶法、发酵法等。蛋白提取法原料成本高，分离纯化工艺复杂，环境污染严重；化学合成法合成后为混旋丝氨酸，还需要进行拆分才能获得l
‑
丝氨酸；生物酶法一种是以混旋丝氨酸为前体进行酶法转化获得一种手性氨基酸，另外一种是以甘氨酸和甲醇为前体进行合成，这两种方法生成成本都比较高；发酵法制备l
‑
丝氨酸是一种经济可行的方法，但是目前发酵菌株产量不高，并且大部分需要添加前体甘氨酸，使得发酵成本较高。开发可利用廉价原料且能高产l
‑
丝氨酸菌株仍是研究开发的重点。
4.2016年，丹麦工业大学mundhada等以e.coli mg1655为出发菌株，敲除l
‑
丝氨酸降解路径相关基因tdcg、sdaa、sdab和glya，过表达sera
fbr
、serb、serc，在补料发酵中产l
‑
ser 11.7g/l，转化率为0.43g/g葡萄糖；随后再通过实验室进化最终可产37g/l产物，转化率为0.24g/g。2019年，丹麦工业大学rennig等采用基于可调控的抗生素标记的合成进化方法，对sera、serb、serc转录起始区进行定向进化，随后通过实验和计算机辅助设计，获得可产l
‑
丝氨酸50g/l的菌株，糖酸转化率达到0.36g/g。2020年，上海高研院发表文献报道以大肠杆菌为出发菌株，敲除glya和sdaa后，质粒过表达pgk、sera
fbr
、serb和serc，同时敲除l
‑
丝氨酸内运基因sdac、sstt、tdcc后，获得菌株在5l发酵罐发酵32h，终浓度达到34.8g/l，转化率达到32％。上述菌株敲除了glya基因，在发酵过程中同样要添加甘氨酸，发酵成本较高。


技术实现要素：

5.为了开辟一种无需在培养基中添加甘氨酸即可通过大肠杆菌发酵实现以葡萄糖为原料从头合成l
‑
丝氨酸的新途径，发明人通过代谢工程来改造工业上最常用的基因工程菌宿主大肠杆菌，最终获得了一株产l
‑
丝氨酸的工程菌。因此，本发明包括如下技术方案。
6.一种构建产l
‑
丝氨酸大肠杆菌的方法，其包括以下步骤：
7.a.在大肠杆菌基因组中整合t7rna聚合酶基因，以便促进t7rna聚合酶的表达，从而提高3
‑
磷酸甘油酸脱氢酶sera(h344a,n346a,n364a)突变体即seramut、磷酸丝氨酸磷酸酶serb和磷酸丝氨酸转氨酶serc的表达水平，得到菌株a；
8.b.敲减菌株a基因组中l
‑
丝氨酸降解途径相关基因包括丝氨酸羟甲基转移酶glya、高丝氨酸脱氢酶thra、丝氨酸脱水酶sdaa、丝氨酸脱水酶同工酶sdab和l
‑
丝氨酸转运蛋白sdac、丝氨酸脱水酶同工酶tdcg和苏氨酸脱氢酶tdcb中的一个以上、优选两个以上、更优选三个以上、更优选全部，得到菌株b；
9.c.在菌株b基因组中分别整合一个以上、优选两个以上、更优选三个以上拷贝的抗反馈抑制丝氨酸脱水酶突变体seramut、磷酸丝氨酸转氨酶serb和磷酸丝氨酸转氨酶serc基因，筛选阳性克隆，得到菌株c；
10.d.从菌株c中筛选出生产l
‑
丝氨酸的菌株。
11.上述sera、serb和serc基因都来源于大肠杆菌，其中sera发生(h344a,n346a,n364a)突变使sera抗反馈抑制。
12.步骤b中，术语“敲减”包括但不限于敲除、失活、下调表达。其中glya基因的失活/下调采用突变方式，例如glya起始密码子atg发生gtg突变，表示为glya
gtg
；thra基因的失活/下调采用突变方式，例如发生s357r突变，表示为thra
mut
；tdcg基因、sdaa基因和sdab基因和sdac可以敲除。
13.相对应地，步骤b可以为：敲减菌株a基因组中l
‑
丝氨酸降解途径相关基因丝氨酸羟甲基转移酶glya、丝氨酸脱水酶sdaa、丝氨酸脱水酶同工酶sdab、高丝氨酸脱氢酶thra、苏氨酸脱氢酶tdcb基因，得到菌株b。
14.上述步骤a、步骤b和步骤c可以采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术进行基因工程操作。
15.上述基因编辑技术可以采用crispr/cas系统(包括crispr/cpf1系统crispr
‑
cas9系统)、crispr
‑
cas相关的转座系统integrate系统或者cast系统。
16.上述integrate系统是指sam sternberg研究组开发的基因编辑工具(insertion of transposable elements by guide rna
‑
assisted targeting，引导rna辅助靶向的转座元件插入)；cast系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(crispr
‑
associated transposase，crispr相关转座酶)。
17.在一种实施方式中，上述crispr/cas系统可以是pcassac质粒(addgene 73227)与辅助质粒ptargetf(addgene 62226)的双质粒组合。
18.优选地，上述步骤a、步骤b和步骤c中基因组敲减/整合供体片段是以核苷酸序列为seq id no:1的质粒pet28a
‑
seramutcb为pcr模板制备的。
19.上述大肠杆菌可以是大肠杆菌mg1655。
20.在一种可选的实施方式中，上述基因编辑技术可以包括如下步骤：
21.1.以质粒ptargetf(addgene 62226)为模板，构建不同基因组编辑位点的ptargetf相关质粒ptargetf
‑
lacz、ptargetf
‑
sdabc、ptargetf
‑
tdcg、ptargetf
‑
thramut、ptargetf
‑
glyamut、ptargetf
‑
sdaa、ptargetf
‑
yjit；
22.2.制备基因整合/敲除供体片段，包括；t7rna聚合酶整合片段、sdaa位点的sera
mut
cb整合片段、yjit位点的sera
mut
c整合片段、敲除sdabc整合片段、敲除tdcg整合片段、thra(s357r)突变整合片段、glya
gtg
突变整合片段，其中sera
mut
是sera发生氨基酸h344a/n346a/n364a突变；
23.3.制备含pcassac质粒的mg1655/pcassac菌株，包括将pcassac质粒转入大肠杆菌mg1655感受态细胞中；
24.4.分别将步骤1中制备的ptargetf相关质粒和步骤2中制备的基因整合/敲除供体片段导入mg1655/pcassac菌株中，得到基因组中整合/敲除了各目的基因的mg1655/pcassac菌株；
25.5.消除步骤4中得到的mg1655/pcassac菌株中的质粒pcassac，得到产l
‑
丝氨酸的工程菌。
26.本发明的第二个方面提供了一种l
‑
丝氨酸生产菌，其通过上述的方法构建得到。
27.本发明的第三个方面提供了上述l
‑
丝氨酸生产菌用于生产l
‑
丝氨酸的用途。
28.具体而言，通过上述l
‑
丝氨酸生产菌的发酵来生产l
‑
丝氨酸。
29.在一种实施方式中，发酵培养基中不添加甘氨酸，碳源包括葡萄糖。由于避免了甘氨酸的添加，能够大大节约生成成本，在经济上显然是有利的。
30.本发明构建的基因工程菌能够以葡萄糖为原料通过一步发酵来实现l
‑
丝氨酸的从头合成，且培养基中无需添加甘氨酸作为合成前体。在5l发酵罐中发酵72h，产物浓度达到12.6g/l，糖酸转化率为0.31g/g。
附图说明
31.图1是用于构建宿主菌基因组改造靶点的ptargetf质粒图谱，长度为2118bp，由中科院分子植物卓越中心杨晟课题组惠赠(addgene 62226)。
32.图2是用于构建在宿主菌基因组中敲减/整合的dna供体片段的pet28a
‑
seramutcb质粒图谱，核苷酸序列为seq id no:1，委托南京金唯智生物科技有限公司合成。
33.图3是用于基因编辑的pcassac质粒图谱，长度为14605bp，由中科院分子植物卓越中心杨晟课题组惠赠(addgene 73227)。
34.图4为本发明构建的大肠杆菌中生物合成l
‑
丝氨酸的代谢路线图。
具体实施方式
35.本发明根据大肠杆菌内在氨基酸代谢途径(如图4所示)，运用代谢工程强化了l
‑
丝氨酸合成，弱化或阻断l
‑
丝氨酸的进一步代谢转化，使得大肠杆菌可通过发酵将葡萄糖经过一系列生化反应合成l
‑
丝氨酸，并排出体外。简而言之，该代谢工程是对大肠杆菌de3进行如下基因工程改造：以mg1655菌株为出发菌株，首先进行t7rna聚合酶整合，然后敲除或调低l
‑
丝氨酸降解途径相关基因表达，然后在染色体上整合一个以上拷贝的抗反馈抑制的丝氨酸脱水酶突变体基因seramut、磷酸丝氨酸磷酸酶基因serb和磷酸丝氨酸转氨酶基因serc。
36.应理解，作为一种具体实施方式，上述步骤a、步骤b和步骤c之间的排序并非固定不变，它们可以交叉、颠倒、或者同时进行，只要每个步骤的结果都能顺利实现即可。
37.在大肠杆菌中，pet系统被广泛用来表达外源重组蛋白，构建时一般将目标蛋白基因置于t7启动子下游，而t7启动子只能由t7rna聚合酶起始转录。t7rna聚合酶具备高催化活力，它的转录速度比大肠杆菌内源的rna聚合酶的转录速度快约8倍。当t7rna聚合酶被充分诱导时，能够利用细胞中的大部分材料来起始目的蛋白的转录，且在数小时后，目标蛋白能够超过细胞总蛋白的50％。
38.在本发明中，目标蛋白是指抗反馈抑制的丝氨酸脱水酶seramut、磷酸丝氨酸转氨酶serb和磷酸丝氨酸转氨酶serc。
39.上述的pet系统比如是载体pet22b、pet24a、pet28a等，但并不受限于此。
40.大肠杆菌mg1655的上述基因工程改造可以采用基因编辑技术来实施，比如采用比
较成熟和经典的crispr
‑
cas系统。已经报道了几种在大肠杆菌中建立基于ii型crispr
‑
cas系统的基因组编辑工具，pcas连用ptargetf或ptargett是目前应用最为广泛的一套质粒。中国科学院分子植物科学卓越创新中心杨晟课题组建立的pcas/ptargetf或ptargett双质粒系统(eccrispr1.0)能在大肠杆菌mg1655中实现迭代的基因组编辑，已经分享到addgene上(参见cn112980891a)。
41.在本文中，为描述方便起见，可以将一个基因簇进行简写，比如可以将基因簇seramut、serb和serc缩写为seramutbc，或者将基因簇sera、serb和serc缩写为serabc。这是本领域技术人员能够理解的。
42.在本文中，为了描述简便，有时会将某种酶比如sera与其编码基因(dna)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于sera，用于描述丝氨酸脱水酶的功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该酶的基因sera。
43.以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
44.实施例
45.本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
46.材料和方法
47.实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金唯智生物科技有限公司完成。
48.实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
49.pcr扩增实验根据质粒或dna模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
50.lb培养基：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠。(lb固体培养基另加20g/l琼脂粉。)
51.摇瓶发酵培养基：2g/l酵母粉，9g/l葡萄糖6.8g/l na2hpo4，3g/l kh2po4，0.5g/l nacl，1g/l nh4cl，0.49g/l mgso4·
7h2o，0.015g/l cacl2·
2h2o，2.8
×
10
‑4g/l feso4·
7h2o。
52.发酵培养基：8g/l葡萄糖，2g/l酵母粉，3g/l mgso4·
7h2o，0.017g/l cacl2·
2h2o，1g/l nacl，5g/l(nh4)2so4，0.07g/l feso4·
7h2o，0.11g/l na
‑
citrate
·
2h2o，1.5ml/l 1000
×
微量元素。微量元素：7g/l cocl2·
6h2o，2.5g/l cuso4·
5h2o，25g/l h3bo3，16g/l mncl2·
4h2o，1.5g/l na2moo4·
2h2o，and 3g/l znso4·
7h2o。
53.补料培养基：600g/l葡萄糖，40g/l硫酸铵，2.5g/l mgso4·
7h2o，5g/l kh2po4，1x微量元素和100μm iptg。
54.l
‑
丝氨酸检测方法：使用柱前衍生氨基酸分析法用hplc测定发酵液中l
‑
丝氨酸含量。氨基酸与氯甲酸
‑9‑
芴甲酯(fmoc)反应生成fmoc
‑
氨基酸，生成的氨基酸衍生物经反相
高效液相色谱分离后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。
55.hplc检测条件：
56.仪器设备安捷伦高效液相色谱仪1260，vwd检测器色谱柱依利特bds
‑
c18色谱柱流动相a40mm乙酸钠溶液流动相b乙腈a：b70:30流速(ml/min)1ml/min进样量(ul)5μl柱温(℃)40波长(nm)340nm运行时间(min)30min稀释液纯水l
‑
丝氨酸保留时间3.4min
57.实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
58.表1、引物序列
59.[0060][0061]
注：表中引物名称后缀
‑
f代表正向引物，
‑
r代表反向引物。
[0062]
实施例1：宿主菌改造靶点质粒构建
[0063]
ptargetf相关质粒构建：以质粒ptargetf(addgene 62226)为模板，使用引物对lacz
‑
n20
‑
f/univers
‑
r进行pcr环扩。
[0064]
pcr扩增体系为：kod fx 1μl、2
×
kod fx buffer 25μl、dntp 3μl、模板质粒0.5μl、上下游引物各1μl(50μm)、ddh2o 18.5μl。
[0065]
pcr扩增程序为：95℃5min；94℃30s，60℃30s，68℃2min，31个循环；68℃10min；16℃10min。
[0066]
扩增产物加入1μl dpni酶切1h，转化dh5α感受态细胞，挑取3个转化子送测序鉴定，获得ptargetf
‑
lacz质粒。
[0067]
按同样方法，分别用引物对sdaa
‑
n20
‑
f/univers
‑
r、sdabc
‑
n20
‑
f/univers
‑
r、tdcg
‑
n20
‑
f/univers
‑
r、thra
‑
n20
‑
f/univers
‑
r、ptarget
‑
glyagtg
‑
f/univers
‑
r和
ptarget
‑
yjit
‑
f/univers
‑
r进行pcr环扩，获得不同基因组编辑位点的ptargetf质粒包括ptargetf
‑
sdabc、ptargetf
‑
tdcg、ptargetf
‑
thramut、ptargetf
‑
glyamut、ptargetf
‑
sdaa、ptargetf
‑
yjit。
[0068]
实施例2：宿主菌基因组敲除/整合供体片段制备
[0069]
引物对lacz
‑
up
‑
f/lacz
‑
up
‑
r和lacz
‑
dn
‑
f/lacz
‑
dn
‑
r以mg1655基因组为模板，pcr扩增450bp和500bp大小片段；
[0070]
引物对t7rnap
‑
f/t7rnap
‑
r以bl21(de3)基因组为模板，pcr扩增2.7kb大小片段，获得t7rna聚合酶整合片段t7rnap；
[0071]
引物对lacz
‑
up
‑
f/lacz
‑
dn
‑
r以上述pcr扩增lacz
‑
up、t7rnap和lacz
‑
dn片段为模板，进行overlap pcr，获得3.7kb大小lacz位点整合t7rnap片段，pcr扩增条件和pcr体系同实施例1。
[0072]
引物对seracb
‑
f/seracb
‑
r以pet28a
‑
sera
mut
cb(seq id no:1)为模板，pcr扩增3.5kb大小片段，作为sdaa位点的sera
mut
cb整合片段；
[0073]
同样地，引物对serac
‑
f/serac
‑
r以pet28a
‑
sera
mut
cb为模板，pcr扩增2.5kb大小片段，作为yjit位点的sera
mut
c整合片段，pcr扩增方法同实施例1。
[0074]
引物对sdabc
‑
ko
‑
f/sdabc
‑
ko
‑
r进行引物对扩，获得约140bp大小的敲除sdab和sdac的整合片段。
[0075]
按同样方法获得tdcg敲除、thra(s357r)突变、glya
gtg
突变整合片段，大小皆为140bp左右，pcr扩增方法同上。
[0076]
实施例3：基因工程菌株构建
[0077]
3.1制备mg1655/pcassac菌株：大肠杆菌mg1655菌株lb平板划线，37℃过夜培养；挑2
‑
3个单克隆到lb摇瓶(20ml/250ml三角瓶)，220rpm振荡培养4
‑
5h，离心收集菌株，用10％甘油洗涤两遍，然后加入500μl 10％甘油，悬浮，然后每管100μl分装到1.5ml ep管中，
‑
80℃冰箱保存备用。
[0078]
吸取2μl pcassac质粒(100ng以上)到上述电转感受态细胞中，混匀后转移至2μm电转杯中，在2.5kv的条件下进行电击，电击时间为5.2
‑
5.8ms之间，电击后立即转入800μl lb液体培养基中，然后置于恒温摇床中，37℃，220rpm培养1h，取100μl涂lb平板(含50mg/l卡纳霉素)。
[0079]
3.2制备mg1655(de3)/pcassac菌株：按照步骤3.1的方法制备mg1655/pcassac电转感受态细胞，与步骤3.1不同的是，要在菌体接种摇瓶时加入终浓度50mg/l卡纳霉素和10mm的阿拉伯糖。电转感受态制备完成后加入实施例1中制备的ptargetf
‑
lacz(3μl，1μg以上)和整合片段lacz:t7rnap(7μl，0.5μg以上)，按照步骤3.1电转程序进行电击，摇床复苏后取200μl涂布到加入卡那霉素(kan，50mg/l)和壮观霉素(spec，100mg/l)的lb平板上，37℃培养箱过夜培养。过夜培养平板挑单克隆进行菌落pcr鉴定，鉴定引物为lacz
‑
t7
‑
v
‑
f/lacz
‑
t7
‑
v
‑
r，阳性克隆子大小为0.89kb，野生型无条带。挑2株阳性转化子接lb液体(kan 50mg/l)试管，加入10mm的鼠李糖，37℃摇床220rpm过夜培养，lb(kan 50mg/l)平板划线分单菌，划线平板挑单克隆分别在lb+kan和lb+spec平板点板，在lb+kan上生长在lb+spec不能生长的单克隆保菌，获得mg1655(de3)/pcassac菌株，并用于下一步的基因编辑。
[0080]
3.3制备mg1655(de3)δsdabcδtdcgthra
mut
glya
gtg
/pcassac菌株：参考de3整合步
骤，依次进行了sdabc、tdcg、thra、glya这4个靶点的基因编辑。mg1655(de3)δsdabc转化子平板用sdabc
‑
ko
‑
v
‑
f/sdabc
‑
ko
‑
v
‑
r进行菌落pcr鉴定，阳性转化子可以获得0.5kb大小条带，野生型可以扩增得到3.0kb大小片段，ptargetf
‑
sdabc质粒消除方法同步骤3.2。
[0081]
mg1655(de3)δsdabcδtdcg转化子平板用tdcg
‑
ko
‑
v
‑
f/tdcg
‑
ko
‑
v
‑
r进行菌落pcr鉴定，阳性转化子可以获得0.85kb大小条带，野生型可以扩增得到1.55kb大小片段，ptargetf
‑
tdcg质粒消除方法同步骤3.2。
[0082]
mg1655(de3)δsdabcδtdcgthra
mut
转化子平板用thramut
‑
ko
‑
v
‑
f/thramut
‑
ko
‑
v
‑
r进行菌落pcr鉴定，扩增获得0.6kb大小片段，挑取6株送测序，测序正确转化子消质粒，ptargetf
‑
thramut质粒消除方法同步骤3.2。
[0083]
mg1655(de3)δsdabcδtdcgthra
mut
glya
gtg
转化子平板用glyagtg
‑
v
‑
f/glyagtg
‑
v
‑
r进行菌落pcr鉴定，扩增获得0.75kb大小片段，挑取6株送测序，测序正确转化子消质粒，ptargetf
‑
glyamut质粒消除方法同步骤3.2。
[0084]
3.4制备mg1655(de3)δsdabcδtdcgthra
mut
glya
gtg
δsdaa:t7seramutcb/pcassac菌株：引物对seracb
‑
f/seracb
‑
r以pet28a
‑
seramutcb质粒为模板，pcr扩增sdaa位点整合t7
‑
seramutcb片段，然后和ptarget
‑
sdaa一起电转入mg1655(de3)δsdabcδtdcgthra
mut
glya
gtg
/pcassac菌株中，转化子用sdaa
‑
v
‑
f/sera
‑
v
‑
r进行菌落pcr验证，阳性转化子大小0.96kb，野生型菌株无条带，然后将ptargetf
‑
sdaa质粒消除，该菌株基因组中整合了基因簇seramutcb。
[0085]
mg1655(de3)δsdabcδtdcgthra
mut
glya
gtg
δsdaa:t7seramutcbδyjit:t7seramutc/pcas sac菌株制备：引物对serac
‑
f/serac
‑
r以pet28a
‑
seramutcb质粒为模板，pcr扩增yjit位点整合t7
‑
seramutc片段，然后和ptargetf
‑
yjit一起电转入mg1655(de3)δsdabcδtdcgthra
mut
glya
gtg
δsdaa:t7seramutcb/pcassac菌株中，转化子用yjit
‑
v
‑
f/sera
‑
v
‑
r进行菌落pcr验证，阳性转化子大小0.92kb，野生型菌株无条带。然后挑2株阳性转化子接lb液体(kan 50mg/l)试管，加入10mm的鼠李糖，37℃摇床220rpm过夜培养，lb(kan 50mg/l)平板划线分单菌，划线平板挑单克隆分别在lb、lb+kan和lb+spec平板点板，在lb平板上能生长，在lb+kan和lb+spec不能生长的单克隆保菌，获得目的菌株，该菌株基因组中整合了两拷贝基因簇seramutc。
[0086]
按照与步骤3.2相同的方法消除菌株mg1655(de3)δsdabcδtdcgthra
mut
glya
gtg
δsdaa：t7seramutcbδyjit:t7seramutc/pcassac中的质粒pcassac，获得不含pcassac质粒的工程菌mg1655(de3)δsdabcδtdcgthra
mut
glya
gtg
δsdaa:t7seramutcbδyjit:t7seramutc菌株，命名为zhr030
‑
1。
[0087]
实施例4：工程菌zhr030
‑
1的发酵验证
[0088]
发酵罐发酵：从工程菌zhr030
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1的lb平板上挑2
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3个单菌落到lb摇瓶中，37℃、230rpm振荡培养12
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14h；按照1:20(v/v)比例接种5l发酵罐中，发酵初始温度35℃，待od600到20左右时，加入终浓度100μm的iptg，降温到30℃进行发酵。氨水控制ph6.8，溶氧控制在30％以上。待初糖完全耗光，进行补料发酵，维持葡萄糖在3g/l以下。
[0089]
根据发酵罐实验结果，以葡萄糖为原料进行发酵，在不补加甘氨酸的情况下，发酵72h时的产物l
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丝氨酸浓度达到12.6g/l，糖酸转化率为0.31g/g，显示出较好的开发潜力。