植物细菌性维管束病害的人工接种方法

1.本发明涉及植物保护技术领域。更具体地说，本发明涉及一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法。


背景技术：

2.植物细菌性维管束病害是农业生产中常见的植物病害种类，由病原细菌引起，常见的有细菌性枯萎病和青枯病，病害严重时会导致绝产。细菌性维管束病害病原菌一般通过幼根或伤口侵入，在植物维管束中扩展蔓延，堵塞导管，同时分泌毒素，破坏导管，使水分运输受阻，进而导致地上部枯萎。
3.病害的有效防治，需对其病原进行准确鉴定，而人工接种方法是病原鉴定的常用手段。目前，植物细菌性维管束病害的人工接种方法一般为注射菌液法、针刺法、菌液灌根法等，但对于一些木本植物，注射菌液法的菌液不易注射到植物体内；针刺法携带的菌量有限，在温度干燥或湿度较小时，接种菌容易失去活性；而菌液灌根法往往不能使实生苗发病。因此，在植物细菌性维管束病害研究中，特别是对于木本植物，需要一种快速、有效和重现性好的人工接种方法。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
5.本发明还有一个目的是提供一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，能够对木本植株进行植物细菌性维管束病害的人工接种，具有操作简单，接种效果高效且稳定的有益效果。
6.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，包括以下步骤：
7.步骤1)、菌液的制备：将病原菌接种于na培养基上，30℃培养24h后再转接一次，用灭菌的0.2～0.3mol/l的pb缓冲液将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为0.5
×
108～1.5
×
108cfu/ml的菌悬液；
8.步骤2)、离体枝条的处理：从木本植物上剪取顶部带有4～5片展开叶片的新生的枝条，放入75％的乙醇溶液中消毒1～3min后，用灭菌水冲洗多次；
9.步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3～1/2体积菌悬液的三角瓶或玻璃杯中，并用棉花或海绵包住枝条封口固定，再置于人工气候箱中培养。
10.优选的是，步骤2)中，枝条从木本植物上剪取后，立即插入无菌水中，并避光放置24h，再选择长势一致且健康的枝条进行消毒。
11.优选的是，步骤1)中pb缓冲液的浓度为0.25mol/l。
12.优选的是，步骤1)中制备成的菌悬液的菌体浓度为1
×
108cfu/ml。
13.优选的是，所述木本植物为桑树。
14.优选的是，步骤3)中，人工气候箱内的温度为28～32℃，湿度为90～95％，光照为
第1天24h黑暗，第2天6h光照、18h黑暗，第3天后12h光照、12h黑暗；第2天后的光照强度为5000lx。
15.优选的是，步骤3)之前对枝条进行处理，首先用灭菌手术刀在枝条的中下部切开四个十字伤口，四个十字伤口沿竖直方向呈螺旋排布，再将浸泡有玉米素和赤霉素混合液的脱脂棉包住四个十字伤口，并用保鲜膜包裹保湿，保持1h后，拆除保鲜膜和脱脂棉，即完成对枝条的处理；马上将处理后的枝条插入菌悬液中，任一十字伤口不插入菌悬液中；其中，玉米素和赤霉素混合液的浓度为100mg/kg，玉米素和赤霉素的质量比为1:3。
16.优选的是，任一十字伤口的长度为枝条的周长的1/3～1/2，深度为3～5mm。
17.本发明至少包括以下有益效果：
18.一、本发明选用枝条作为接种材料置于菌悬液中进行接种，并使用pb缓冲液制备菌悬液，能够对木本植株进行植物细菌性维管束病害的人工接种，具有操作简单，实验周期短，接种效果高效且稳定的有益效果；
19.二、本发明的枝条从木本植物上剪取后，立即插入无菌水中，并避光放置24h，再选择长势一致且健康的枝条进行消毒，能够进一步降低实验误差，提高接种效果的稳定性和可靠性；
20.三、本发明的枝条在接种前进行处理，能够进一步提高接种效果的稳定性和高效性。
21.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
22.图1为实施例2方法接种桑枝3～7天的病害症状图。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
24.需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
25.<实施例1>
26.一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，包括以下步骤：
27.步骤1)、菌液的制备：将购买的桑肠杆菌接种于na培养基上，30℃培养24h后再转接一次，用灭菌的0.2mol/l的pb缓冲液将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为0.5
×
108cfu/ml的菌悬液；
28.步骤2)、离体枝条的处理：从桑树上剪取顶部带有4片展开叶片的新生的枝条，放入75％的乙醇溶液中消毒1min后，用灭菌水冲洗3次；
29.步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3体积菌悬液的三角瓶中，并用无菌棉花包住枝条封口固定，再置于人工气候箱中培养。
30.<实施例2>
31.一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，包括以下步骤：
32.步骤1)、菌液的制备：将购买的桑肠杆菌接种于na培养基上，30℃培养24h后再转接一次，用灭菌的0.25mol/l的pb缓冲液将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为1
×
108cfu/ml的菌悬液；
33.步骤2)、离体枝条的处理：从桑树上剪取顶部带有4片展开叶片的新生的枝条，放入75％的乙醇溶液中消毒2min后，用灭菌水冲洗3次；
34.步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3体积菌悬液的三角瓶中，并用无菌棉花包住枝条封口固定，再置于人工气候箱中培养。
35.<实施例3>
36.一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，包括以下步骤：
37.步骤1)、菌液的制备：将购买的桑肠杆菌接种于na培养基上，30℃培养24h后再转接一次，用灭菌的0.3mol/l的pb缓冲液将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为1.5
×
108cfu/ml的菌悬液；
38.步骤2)、离体枝条的处理：从桑树上剪取顶部带有4片展开叶片的新生的枝条，放入75％的乙醇溶液中消毒3min后，用灭菌水冲洗3次；
39.步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3体积菌悬液的三角瓶中，并用无菌棉花包住枝条封口固定，再置于人工气候箱中培养。
40.<实施例4>
41.与<实施例2>不同在于，一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，步骤2)中，枝条从桑树上剪取后，立即插入无菌水中，并避光放置24h，再选择长势一致且健康的枝条进行消毒；其他步骤及参数与实施例2相同。
42.<实施例5>
43.与<实施例2>不同在于，一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，步骤3)之前对枝条进行处理，首先用灭菌手术刀在枝条的中下部切开四个十字伤口，四个十字伤口沿竖直方向呈螺旋排布，再将浸泡有玉米素和赤霉素混合液的无菌脱脂棉包住四个十字伤口，并用保鲜膜包裹保湿，保持1h后，拆除保鲜膜和脱脂棉，即完成对枝条的处理；马上将处理后的枝条插入菌悬液中，任一十字伤口不插入菌悬液中；其中，玉米素和赤霉素混合液的浓度为100mg/kg，玉米素和赤霉素的质量比为1:3，任一十字伤口的长度为枝条的周长的1/3，深度为4mm；其他步骤及参数与实施例2相同。
44.<实施例6>
45.与<实施例2>不同在于，一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，步骤2)中，枝条从桑树上剪取后，立即插入无菌水中，并避光放置24h，再选择长势一致且健康的枝条进行消毒；步骤3)之前对枝条进行处理，首先用灭菌手术刀在枝条的中下部切开四个十字伤口，四个十字伤口沿竖直方向呈螺旋排布，再将浸泡有玉米素和赤霉素混合液的无菌脱脂棉包住四个十字伤口，并用保鲜膜包裹保湿，保持1h后，拆除保鲜膜和脱脂棉，即完成对枝条的处理；马上将处理后的枝条插入菌悬液中，任一十字伤口不插入菌悬液中；其中，玉米素和赤霉素混合液的浓度为100mg/kg，玉米素和赤霉素的质量比为1:3，任一十字伤口的长度为枝条的周长的1/3，深度为4mm；其他步骤及参数与实施例2相同。
46.<对比例1>
47.采用注射菌液法进行接种，与<实施例2>不同在于，步骤3)、接种：将枝条插入装有
1/3体积0.25mol/l的pb缓冲液的三角瓶中，用无菌棉花包住枝条封口固定，用灭菌注射器抽取菌悬液，并在第2～4张叶片的叶腋处注射约0.02ml菌悬液；其他步骤及参数与实施例2相同。
48.<对比例2>
49.采用针刺法进行接种，与<实施例2>不同在于，步骤1)、菌苔的制备：将购买的桑肠杆菌划线或涂布于na培养基上，30℃培养24h后再转接一次，待菌苔长出备用；
50.步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3体积0.25mol/l的pb缓冲液的三角瓶中，用无菌棉花包住枝条封口固定，用灭菌的牙签蘸取菌苔，刺入第2～4张叶片的叶腋处，刺入深度约3mm，刺伤后将牙签拔出；其他步骤及参数与实施例2相同。
51.<对比例3>
52.采用菌液灌根法进行接种，与<实施例2>不同在于，步骤2)、桑苗的培育：将消毒后的桑种子于28℃的恒温箱中催芽，再将幼苗移栽于装有灭菌育苗土培养袋中，1个培养袋中移栽1株幼苗，直至桑苗长出5～6片真叶；
53.步骤3)、接种：在桑苗的一侧距根基部1cm处用无菌刀造成根部伤口，再在伤口部位灌注约50ml菌悬液，每隔1d灌注1次，共灌注3次；其他步骤及参数与实施例2相同。
54.<对比例4>
55.与<实施例2>不同在于，步骤1)中，用灭菌的0.25mol/l的pbs缓冲液将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为1
×
108cfu/ml的菌悬液；其他步骤及参数与实施例2相同。
56.<对比例5>
57.与<实施例2>不同在于，步骤1)中，用灭菌水将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为1
×
108cfu/ml的菌悬液；其他步骤及参数与实施例2相同。
58.<接种效果评价>
59.采用实施例1～6和对比例1～5的方法进行接种处理，桑树的品种为桂桑优12，每个处理20个重复，以接种0.25mol/l的pb缓冲液为对照组1，接种0.25mol/l的pbs缓冲液为对照组2，接种无菌水为对照组3；人工气候箱内的温度为32℃，湿度为95％，光照为第1天24h黑暗，第2天6h光照、18h黑暗，第3天后12h光照、12h黑暗；第2天后的光照强度为5000lx；
60.结果观察与病情调查：接种培养后每天观察发病情况，接种培养7天后进行病情调查，统计并计算发病率和病情指数，其中，病情调查采用的病害分级标准为：
61.0级，无症状；
62.1级，1张叶片萎蔫或枯萎坏死；
63.2级，2张叶片萎蔫或枯萎坏死；
64.3级，3张叶片萎蔫或枯萎坏死；
65.4级，4张叶片萎蔫或枯萎坏死；
66.发病率(％)＝(发病株数/接种总株数)
×
100％；
67.病情指数＝[∑(各级病级代表值
×
该级病株数)/(调查总株数
×
4)]
×
100。
[0068]
表1桑树细菌性枯萎病病原菌采用不同人工接种方法的致病率的比较
[0069]
组别发病率(％)病情指数实施例180.31
±
2.3280.32
±
2.13实施例282.15
±
2.2784.45
±
2.02
实施例381.42
±
2.4183.63
±
2.25实施例483.01
±
0.9884.78
±
0.74实施例592.52
±
1.9491.51
±
1.77实施例693.21
±
0.6995.32
±
0.53对比例145.74
±
2.5255.19
±
2.42对比例235.46
±
2.4358.91
±
2.18对比例300对比例475.12
±
2.2664.45
±
1.95对比例573.32
±
2.1562.25
±
1.87对照组100对照组200对照组300
[0070]
从表1可知，相较于对比例1～3，实施例2的发病率和病情指数均显著提高，由此可见，本发明选用枝条作为接种材料置于菌悬液中进行接种，能够对木本植株进行植物细菌性维管束病害的人工接种，具有操作简单，实验周期短，接种效果高效且稳定的有益效果；而且，相较于对比例4～5，实施例2的发病率和病情指数均明显提高，使用pb缓冲液制备菌悬液，接种效果更好；
[0071]
相较于实施例2，实施例4的发病率的标准差和病情指数的标准差均明显降低，且相较于实施例5，实施例6的发病率的标准差和病情指数的标准差也均明显降低，由此可见，枝条从木本植物上剪取后，立即插入无菌水中，并避光放置24h，再选择长势一致且健康的枝条进行消毒，能够进一步降低实验误差，提高接种效果的稳定性和可靠性；
[0072]
相较于实施例2，实施例5的发病率和病情指数均显著提高，由此可见，枝条在接种前通过玉米素和赤霉素溶液对十字伤口进行处理，有利于促进枝条内有机物质的转运，维持枝条的生长活性，从而能够进一步提高接种效果的可靠性、稳定性和高效性；
[0073]
另外，实施例1～4和对比例4～5的枝条在接种3天后，叶片开始出现明显的萎蔫症状，接种7天后，叶片卷曲、焦枯(图1)，剥开枝条表皮，枝条木质部变褐色；实施例5～6的枝条在接种2天后，叶片开始出现明显的萎蔫症状，接种7天后剥开表皮，枝条木质部呈褐色；对比例1～2的枝条在接种后4天，叶片开始出现萎蔫症状，接种7天后剥开表皮，枝条木质部变褐色，对比例3和对照组1～3均叶片均未出现明显的萎蔫症状，剥开表皮，枝条木质部未出现褐色；由此可见，本发明具有接种效果高效且稳定的有益效果。
[0074]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。