一种异养硝化-好氧反硝化细菌及其应用的制作方法

一种异养硝化
‑
好氧反硝化细菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及含氮污水处理领域，具体是一种异养硝化
‑
好氧反硝化细菌及其应用。


背景技术：

2.工农业的迅速发展和人类的生产活动给水体环境带来了严重的污染。氮超标是水体污染中最常见的一类污染问题，会引起水体富营养化，导致藻类大量繁殖，水体溶氧降低，水生生物大量死亡，不仅危及人类的用水安全，还会严重影响水体的生态平衡；另外，氮排放过量还会导致氮平衡被破坏，从而造成水体失去自净功能。因此，富含氮的污水需要经过脱氮处理达标后才能排放到自然环境中。
3.生物脱氮是目前应用广泛的含氮污水处理方法，具备处理效果好、处理过程稳定可靠和操作管理方便等优点。生物脱氮污水处理技术主要通过氨氧化细菌、硝化细菌和反硝化细菌等功能菌群的作用将污水中的氨态氮还原为氮气进而达到脱氮的目的。在处理过程中，硝化细菌、亚硝化细菌将氨氮转化为硝酸盐氮，硝态氮化学势能低、稳定高，易造成硝氮累积。反硝化细菌作用于水体中的硝氮，将其逐步还原为亚硝氮、一氧化氮、氧化亚氮，最后被还原为氮气释放到大气中，完成氮元素的循环，是污水脱氮的重要环节。传统的生物脱氮是利用硝化菌的好氧自养硝化作用和反硝化菌的厌氧异养反硝化作用共同完成，该过程需要分别提供有氧和无氧的两个独立的反应空间分别进行硝化作用和反硝化作用，从而达到脱氮的目的。故这样的处理方法所占空间较大，运行成本较高，工艺较为繁琐。
4.自paracoccus denitrificans被首次鉴定为好氧反硝化细菌以来，好氧反硝化技术被认可并进一步推广。好氧反硝化细菌能够在有氧条件下，以氧气和硝氮为电子受体，同时进行硝化
‑
反硝化反应，实现有机氮的快速脱除，在有机物生物脱氮技术中具有重要的应用价值。该领域的研究已经开展了三十余年，多种好氧脱氮微生物菌种被分离鉴定，其生长特性及在异氧硝化
‑
好氧反硝化生物脱氮过程中的处理能力差异很大。因此，筛选到高效的、能同时进行硝化
‑
反硝化的菌株对污染水体脱氮具有重要的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明目的是针对现有技术中污水处理运行成本较高，工艺较为繁琐的不足，提供一种异养硝化
‑
好氧反硝化不动杆菌及其应用。
6.本发明采用的技术方案是：一种异养硝化
‑
好氧反硝化细菌，保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），地址：中国，武汉，武汉大学，分类命名为印度不动杆菌b2
‑
1（acinetobacter indicus strain b2
‑
1），保藏编号为cctcc no：m 2020965，保藏日期2020年12月24日。
7.本发明异养硝化
‑
好氧反硝化不动杆菌zjb20129，其生物学特征：经鉴定为革兰氏阴性菌，菌落为乳黄色圆形，表面湿润易挑起，菌体为杆状。菌株生长适宜碳源为丁二酸钠或乙酸钠，适宜c/n为15~18，适宜ph为7.0~9.0，适宜生长温度为30~40℃。
8.本发明还涉及所述异养硝化
‑
好氧反硝化细菌在制备脱氮生物菌剂中的应用。所
述脱氮生物菌剂，包含所述的异养硝化
‑
好氧反硝化细菌。
9.本发明还涉及所述异养硝化
‑
好氧反硝化细菌在含氮污水脱氮处理中的应用。
10.本发明还涉及利用权所述异养硝化
‑
好氧反硝化细菌对含氮污水进行脱氮处理的方法，所述方法包括：将所述异养硝化
‑
好氧反硝化细菌接种至含氮污水中，添加碳源至c/n比值为15~18，于ph 7~9、30~40℃、80~200rpm下进行培养，去除废水中的氨氮。
11.优选的，所述碳源为丁二酸钠、乙酸钠中的一种或两种。更稳优选的，所述碳源为丁二酸钠。
12.优选的，所述培养在c/n比值为15、ph为8、温度为35℃、转速为160rpm的条件下进行。
13.本发明的有益效果本发明的异养硝化
‑
好氧反硝化印度不动杆菌（acinetobacter indicus strain）zjb20129可以利用丁二酸钠和乙酸钠为碳源，并在丁二酸钠为最优碳源、c/n为15、ph为8、温度为35℃、转速为160rpm的条件下好氧培养36h时有最优脱氨氮效果，为99.27%。同时该菌株对硝氮和亚硝氮均有很好清除效果，这对开发高效脱氮生物菌剂具有重要的实际意义。
附图说明
14.图1为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129的光学显微镜图。
15.图2为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129 16s rdna的系统发育树。
16.图3为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129对氨氮降解能力的示意图。
17.图4为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129对硝氮降解能力的示意图。
18.图5为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129对亚硝氮降解能力的示意图。
19.图6为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129在不同碳源下的氨氮降解示意图。
20.图7为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129在不同碳氮比下的氨氮降解示意图。
21.图8为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129在不同ph下的氨氮降解示意图。
22.图9为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129在不同温度下的氨氮降解示意图。
23.图10为本发明异养硝化
‑
好氧反硝化细菌zjb20129在不同转速下的氨氮降解示意图。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：一种异养硝化
‑
好氧反硝化细菌的筛选及鉴定取2~3g杭州某污水处理公司的生物转盘泥样加入到装有100ml无菌水的锥形瓶中，于摇床上震荡3h后，用移液枪吸取2ml液体接种于已灭菌的lb培养基中，于30℃，180rpm条件下培养2~3d。
25.上述lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000ml，自然ph；若需固体培养基，则加入1.5~2%琼脂。
26.取菌种培养液接入装有无菌水的试管中，按比例进行稀释，分别得到菌种浓度为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7和10
‑8梯度的细菌悬浮液；然后采用平板涂布法，分别从各梯度细菌悬浮液中吸取100μl涂布于lb固体培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养，分别挑取不同形态的菌落进行划线分离，分离纯化3次以上直至菌落特征基本一致，然后接种于斜面培养基上并保存于4℃冰箱。
27.将初筛所得的15株菌株在lb培养基中培养至对数生长期，分别吸取100μl涂布于溴百里酚蓝（btb）固体培养基上，30℃培养4d，选取变蓝最快的固体培养基上的菌落进行保藏和保护，可得所述的菌株zjb20129，作为后续研究的目的菌株。
28.所述溴百里酚蓝（btb）固体培养基按如下组成配制：硝酸钾（kno3）1.01g，丁二酸钠（c4h4na2o4）8.5g，七水硫酸镁（mgso4·
7h2o）1.0g，磷酸二氢钾（kh2po4）1.0g，七水硫酸亚铁（feso4·
7h2o）0.59g，氯化钙（cacl2）0.09g，1%溴百里酚蓝乙醇溶液1ml，蒸馏水定容至1000ml，琼脂20g，用1mol/l naoh调至ph 7.0
‑
7.3。
29.如图1所示，菌株zjb20129的生理生化测试为革兰氏阴性，乳黄色圆形，表面湿润易挑起，菌体为杆状。用基因组试剂盒提取目的菌株的细菌基因组；利用细菌通用引物27f：5
′‑
agagtttgatcmtggctcag
‑3′
，1492r：5
′‑
tacggytaccttgttacgactt
‑3′
对其进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳（1％）验证；电泳检测，切胶纯化测序，由擎科生物进行序列测定。
30.pcr反应条件：94℃条件下预变性3min；变性30s；54℃条件下退火30s；72℃条件下延伸1min30s；从第二步开始重复30个循环。
31.菌株zjb20129的16s rdna序列长度为1415bp，其基因序列见seq id no. 1。
32.将菌株序列结果上传至ncbi数据库，与数据库中已有的细菌16s rdna基因序列进行比对，结果表明该菌为acinetobacter indicus strain。通过mega.7.0软件的邻位连接法构建系统发育树，分析菌株的遗传学特征、确定其的种属情况及在遗传学上的进化地位，结果见图2。
33.菌株zjb20129命名为印度不动杆菌b2
‑
1（acinetobacter indicus strain b2
‑
1），株号zjb20129，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2020965，保藏日期为2020年12月24日，地址为中国武汉市武汉大学。
34.实施例2：菌株zjb20129对不同氮源培养基的硝化/反硝化能力鉴定硝化培养基配方为：硫酸铵（(nh4)2so4）0.47g，丁二酸钠（c4h4na2o4）5.06g，硫酸镁（mgso4）0.1g，磷酸二氢钾（kh2po4）0.1g，微量元素溶液2ml，蒸馏水定容至1000ml，ph值7.0
‑
7.5；其中微量元素溶液包括：edta 50g，七水硫酸锌（znso4·
7h2o）3.92g，氯化钙（cacl2）5.5g，四水氯化锰（mncl2·
4h2o）5.1g，七水硫酸亚铁（feso4·
7h2o）5.0g，四水钼酸铵（(nh4)6mo7o
24
·
4h2o）1.1g，五水硫酸铜（cuso4·
5h2o）1.6g，六水氯化钴（cocl2·
6h2o）1.6g，用蒸馏水定容至1000ml。反硝化培养基将硝化培养基中的硫酸铵（(nh4)2so4）0.47g替换为硝酸钾（kno3）0.72g或亚硝酸钠（nano2）0.49g，其余配方保持不变。
35.处理方式为：接种2%种子液（种子液为lb培养基30℃，160rpm培养12h的菌悬液），30℃、160rpm培养。定期取样分别测定上清液中的中nh
4+
‑
n、no3⁻‑
n、no2⁻‑
n和od
600
值，结果见图3至5。
36.由图3可知，当培养条件为30℃、160rpm时，菌株zjb20129在36h内将氨氮浓度从103.8mg/l降至1.32mg/l，降解率为98.73%，od
600
最大为2.08，表明zjb20129对氨氮有良好的降解能力。48h时od
600
下降，氨氮浓度略微上升，可能是由于部分菌体死亡，细胞内含氮有机物释放到培养基中所致。
37.由图4可知，当培养条件为30℃、160rpm时，菌株zjb20129在48h内将硝氮浓度从109.1mg/l降至4.00mg/l，降解率为96.33％，od
600
最大为2.03，表明zjb20129对硝氮有良好的降解能力。
38.由图5可知，当培养条件为30℃、160rpm时，菌株zjb20129在60h内将亚硝氮浓度从101.0mg/l降至4.03mg/l，降解率为96.01％，od
600
最大为2.08，表明zjb20129对亚硝氮有良好的降解能力。
39.实施例3：zjb20129高效反硝化条件的确定（1）不同碳源对zjb20129氨氮降解率的影响：改变实施例2中硝化培养基的碳源分别为乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、蔗糖和葡萄糖，固定碳源含量为1.5g/l（以c计），接种2% zjb20129种子液，在30℃、160rpm的条件下，培养36h，测定其氨氮降解能力，结果如图6所示。表明以乙酸钠为碳源时氨氮清除率为98.26%，而以丁二酸钠为碳源时氨氮清除率为99.01％，远高于含量相同（以c计）的葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠作为碳源时的清除率。
40.（2）不同碳氮比对zjb20129氨氮降解率的影响：改变实施例2中的硝化培养基丁二酸钠含量，使培养基中c/n质量比值分别为6、9、12、15和18，接种2% zjb20129种子液，在30℃、160rpm的条件下，培养36h，测定其氨氮降解能力，结果如图7所示。表明当c/n质量比值为15时，氨氮清除率最高，达到98.31%。
41.（3）不同ph对zjb20129氨氮降解率的影响：改变实施例2中硝化培养基的ph分别为5、6、7、8和9，接种2% zjb20129种子液，在30℃、160rpm的条件下，培养36h，测定其氨氮降解能力，结果如图8。培养基的ph在8时，氨氮清除率达到99.27%，可见该菌株在ph为8附近时，脱氮能力最强。
42.（4）不同温度对zjb20129氨氮降解率的影响：使用实施例2中的硝化培养基，改变培养温度分别为20、25、30、35和40℃，接种2% zjb20129种子液，在160rpm的条件下，培养36h，测定其氨氮降解能力，结果如图9所示。当温度为35℃时氨氮清除率最高，达到98.94%。
43.（5）不同转速对zjb20129氨氮降解率的影响：使用实施例2中的硝化培养基，改变培养转速分别为40、80、120、160和200rpm，接种2% zjb20129种子液，在30℃的条件下，培养36h，测定其氨氮降解能力，结果如图10所示。当转速为160rpm时氨氮清除率最高，达到99.05%。
44.实施例4：一种异养硝化
‑
好氧反硝化细菌在污水处理中的应用污水样品取自杭州某污水处理厂。取1l上述污水水样，接种2%种子液（zjb20129种子液为实施例2中lb培养基在30℃，160rpm条件下培养12h后的菌悬液），在30℃、160rpm下摇床培养36h。取样测定污水处理前后总氮、氨氮和亚硝氮浓度，测定结果如表1所示。
45.表1污水样品处理前后氮元素浓度变化
由表1可知，本菌种对污水中的氨氮和硝氮均有很好的清除效果，且不产生亚硝氮的积累。因此相较于现有的菌种，本菌种应用范围广，能够丰富环境微生物的菌种库，提供高效脱氮的环境微生物，为不同程度的污染水体提供了解决方案。