TT2-SCT1/SCT2-WR2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用

tt2-sct1/sct2-wr2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用
技术领域
1.本发明属于植物学和农业学领域，更具体地，本发明涉及tt2-sct1/sct2-wr2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用。


背景技术：

2.在自然界条件下，由于不同的地理位置、气候条件以及人类活动等多方面原因，造成了各种不良环境，超出了植物正常生长、发育所能忍受的范围，致使植物受到伤害，甚至死亡。这些对植物产生伤害的环境称为逆境，或胁迫。逆境包括但不限于：冻、低温、高温、干旱、盐渍、土壤过湿和病害等各种逆境。植物虽经受逆境影响，但它通过生理反应而抵抗逆境，如果超过植物可忍受的范围，超出植物自身修复能力，损伤将变成不可逆的，植物将受害甚至死亡。
3.近些年来，随着人口的不断增长以及人类活动的不断加剧，全球气候变暖成为世界一大主要问题，众所周知农作物对于气候具有敏感性。气候变化会引起农作物的大规模减产，潜在地造成严重的粮食安全问题。随着全球平均气温的逐渐升高，将会对禾本科植物小麦、水稻等主要粮食作物造成不同程度的减产。
4.一直以来，提高植物的耐热能力是本领域的重要课题。本领域亟待探索更多的提高植物的耐热能力的有效途径。禾本科植物水稻是世界上最重要的粮食作物之一，养育着全世界半数以上的人口，同时它也是科学研究中最重要的单子叶模式植物之一。理解水稻是如何适应不断增加的高温环境，并且应用遗传工程的手段培育对环境温度变化适应性好的水稻优良品种有助于为本领域中水稻生产应用上提供新策略，对促进水稻产量持续、稳步提升具有深远意义。同时，对水稻环境温度适应性基因资源的挖掘及分子机理研究，也会为其他农作物的育种提供新的思路及借鉴。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供tt2-sct1/sct2-wr2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用。
6.在本发明的第一方面，提供一种增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的方法，包括：调节植物中tt2-sct1/sct2-wr2信号通路；较佳地所述调节包括：(a)下调tt2的表达或活性；(b)下调sct1/sct2的表达或活性；和/或(c)阻断sct1/sct2对wr2的调控，维持wr2稳态。
7.在一个或多个实施方式中，所述维持wr2稳态是指wr2为正常表达量/活性。
8.在一个或多个实施方式中，所述维持wr2稳态是指wr2不受到热环境(热诱导/热刺激)导致的钙离子流的变化的影响。
9.在一个或多个实施方式中，所述维持wr2稳态是指wr2不受到sct1和/或sct2的调控(钙调素与sct1/sct2相互作用，进而负调节wr2)。
10.在一个或多个实施方式中，(a)中，下调tt2的表达或活性，从而减少tt2对热诱导
的响应、减少热刺激下胞内钙浓度，调节钙调素与sct1的相互作用。
11.在一个或多个实施方式中，(b)中，下调sct1/sct2的表达或活性，从而下调sct1/sct2对于wr2的调控，维持wr2稳态(正常表达量/活性)。
12.在一个或多个实施方式中，(c)中，对于受热诱导wr2低表达或不表达的植物，通过回补wr2至正常量来维持wr2稳态，或通过改变wr2启动子区的sct1/sct2结合区、使其不与sct1/sct2发生相互作用。
13.在一个或多个实施方式中，(a)中，下调tt2的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默tt2的编码基因，或抑制tt2的活性；较佳地，包括：以特异性干扰tt2的编码基因表达的干扰分子来沉默tt2，以crispr系统进行基因编辑从而敲除tt2的编码基因，以同源重组的方法敲除tt2编码基因，或在含有tt2的植物中将tt2进行功能丧失性突变。
14.在一个或多个实施方式中，(b)中，下调sct1/sct2的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默sct1/sct2的编码基因，或抑制sct1/sct2的活性；较佳地，包括：以特异性干扰sct1/sct2的编码基因表达的干扰分子来沉默sct1/sct2，以crispr系统进行基因编辑从而敲除sct1/sct2的编码基因，以同源重组的方法敲除sct1/sct2编码基因，或在含有sct1/sct2的植物中将sct1/sct2进行功能丧失性突变。
15.在一个或多个实施方式中，(c)中，所述回补wr2包括：将wr2的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；对wr2自身启动子进行突变，消除sct1/sct2的结合位点；以组成型启动子或组织特异性启动子促进wr2表达；或，以增强子促进wr2表达。
16.在一个或多个实施方式中，(a)中，所述下调tt2的表达或活性包括：敲除tt2的编码基因，从而表达无活性的蛋白或不表达蛋白；较佳地，将tt2编码基因的第165位的核苷酸c突变成a，进而形成tga而提前终止tt2蛋白表达，或将tt2编码基因的第1位到第40位进行敲除、第85位到第90位进行敲除；第19位插入一个核苷酸、第87位到第90位进行敲除；第20位核苷酸进行敲除、第91位的核苷酸a突变成t，进而导致tt2编码区发生移码，进而形成终止密码子而提前终止tt2的表达(tt2
ko
)。
17.在一个或多个实施方式中，(b)中，所述下调sct1/sct2的表达或活性包括：将sct1编码基因的第267位到第268位敲除；第219位到第253位敲除；第222位插入1个核苷酸，进而导致sct1的编码区域移码而产生提前终止；将sct2编码基因的第218-248位核苷酸进行敲除；第231位插入一个核苷酸；第229-231位核苷酸进行敲除，进而导致sct2的编码区域受到破坏或移码。(sct1/sct2-knockout)。
18.在本发明的另一方面，提供一种tt2-sct1/sct2-wr2信号通路或其的调节剂的用途，用于增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量；其中，所述的调节剂包括：(a)下调tt2的表达或活性的下调剂；(b)下调sct1/sct2的表达或活性的下调剂；和/或(c)阻断sct1/sct2对wr2的调控，维持wr2稳态(正常表达量/活性)的试剂。
19.在一个或多个实施方式中，所述下调tt2的表达或活性的下调剂包括：敲除或沉默tt2的试剂，抑制tt2活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰tt2的编码基因表达的干扰分子，针对tt2的crispr基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将tt2进行功能丧失性突变。
20.在一个或多个实施方式中，所述下调sct1/sct2的表达或活性的下调剂包括：敲除或沉默sct1/sct2的试剂，抑制sct1/sct2活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰sct1/sct2
id no:14所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如seq id no:14所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与seq id no:14所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)seq id no:14所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在seq id no:14所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。
30.在一个或多个实施方式中，所述的wr2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如seq id no:18所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如seq id no:18所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与seq id no:18所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)seq id no:18所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在seq id no:18所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。
31.在本发明的另一方面，提供一种tt2-sct1/sct2-wr2信号通路及其中的通路基因的用途，用于：作为鉴定禾本科植物耐热能力或禾本科植物高温下产量的分子标记。
32.在本发明的另一方面，提供一种tt2-sct1/sct2-wr2信号通路及其中的通路基因的用途，用作定向筛选具有耐热能力或在高温下保持产量的禾本科植物的分子标记。
33.在本发明的另一方面，提供一种tt2-sct1/sct2-wr2信号通路及其中的通路基因的用途，用于筛选提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质。
34.在本发明的另一方面，提供一种定向选择禾本科植物的方法，包括：鉴定测试植物中的tt2-sct1/sct2-wr2信号通路及其中的通路基因的表达或序列特征或相互作用；若具有选自下组的一或多个特征，则该测试植物为具有耐热能力或在高温下保持产量的禾本科植物：该测试植物的tt2低表达或不表达；该测试植物的sct1/sct2低表达或不表达；该测试植物的wr2维持稳态。
35.在一个或多个实施方式中，该选择植物的方法可在高温下或常温下进行。
36.在一个或多个实施方式中，所述低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低。
37.在一个或多个实施方式中，所述高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高。
38.在本发明的另一方面，提供一种筛选提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达tt2-sct1/sct2-wr2信号通路的体系中；(2)检测所述体系，观测其中tt2-sct1/sct2-wr2信号通路蛋白的表达或活性：若tt2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；若sct1和/或sct2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；若添加候选物质后促进wr2维持稳态，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质。
39.在一个或多个实施方式中，还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中目标基因/
蛋白的表达或活性与对照组的差异。
40.在一个或多个实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对tt2、sct1、sct2蛋白或其编码基因或它们的上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。
41.在本发明的另一方面，提供一种用于提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的tt2-sct1/sct2-wr2信号通路基因的下调剂，其为crispr基因编辑试剂(如构建体/表达载体)，其下调tt2、sct1和/或sct2的表达。
42.在一个或多个实施方式中，所述crispr基因编辑试剂靶向于tt2编码基因的第165位，使核苷酸c突变成a，进而形成tga而提前终止tt2蛋白表达；或将tt2编码基因的第1位到第40进行敲除、第85位到第90位进行敲除；第19位插入一个核苷酸、第87位到第90位进行敲除；第20位核苷酸进行敲除、第91位的核苷酸a突变成t，进而导致tt2编码区发生移码，进而形成终止密码子而提前终止tt2的表达(tt2
ko
)；或靶向于sct1/sct2的表达或活性包括：将sct1编码基因的第267位到第268位敲除；第219位到第253位敲除；第222位插入1个核苷酸，进而导致sct1的编码区域移码而产生提前终止；将sct2编码基因的第218-248位核苷酸进行敲除；第231位插入一个核苷酸；第229-231位核苷酸进行敲除，进而导致sct2的编码区域受到破坏或移码(sct1/sct2-knockout)。
43.在本发明的另一方面，提供一种构建体(表达载体)或植物细胞、组织或器官，其中含有有外源的所述的用于提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的tt2-sct1/sct2-wr2信号通路基因的下调剂。
44.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
45.图1、tt2的图位克隆及转基因验证。
46.(a)hps32替换系与轮回亲本hjx的抗热表型(42℃，rh》90％，24hr)，比例尺4cm。(b)4个局部段片段的重组个体的抗热表型(42℃，rh》90％，24hr)。(c)tt2的位点被定为在25.22kb的范围内，黑色的箭头表示orf，右侧的柱状图表示相应的重组个体的成活率，n＝3样品。(d)在华粳籼的背景下敲除tt2使其在热胁迫耐受方面优于对照hjx，比例尺4cm。(e)在nil-tt2
hps32
的背景下过表达tt2使其热胁迫耐受能力消失，比例尺4cm。(f)在nil-tt2
hps32
的背景下互补tt2全长的gdna使其热胁迫耐受能力消失，比例尺4cm。(g)nil-tt2
hjx
和nil-tt2
hps32
成熟期表型鉴定(13hr，38℃，白天/11hr，35℃，黑夜；12天，恢复7天)，比例尺10cm。(h)不同转基因株系的粒长对比图。(i)tt2
ko
/hjx、pubi:tt2
hjx
/nil-tt2
hps32
、ptt2:tt2
hjx
/nil-tt2
hps32
在热处理后并恢复7天后的成活率统，n＝6样品。每个样品中有24株独立的植株数据为mean
±
sd，使用student’s t-test差异显著性检验，*表示p《0.05，差异显著，**表示p《0.01，差异极显著；或使用one-way anova差异显著性检验，相同字母表示p》0.05。图中，常规(normal)条件为28℃的温度(后同)。
47.图2、tt2
hps32
替换片段来自热带粳稻。
48.(a)替换系hps32替换片段来源确定，基于chr3:16662761
–
17212811，550kb。数据通过水稻3000基因组获得，本发明人通过不同背景下，每一个snp位点的碱基差异频率来指
示hps32的片段来源。(b)在水稻的不同亚种中，关键snp位点中两个碱基出现的频率差异呈现为柱状图。(c)10种热带粳稻抗热表型鉴定(gp5，7，55，86，112，536，629，640，641，and 642)，比例尺，4cm。(d)6种温带粳稻抗热表型鉴定(wyj:wuyunjing 7；ky131:kongyu131；zh11:zhonghua11；jiahua1；nip:nipponpare；and xiushui09).，比例尺，4cm。
49.图3、tt2
hps32
在热胁迫下保护水稻产量。
50.(a)nils的穗部表型(13hr，38℃，白天/11hr，35℃，黑夜；12天)，比例尺3cm。(b)nil-tt2
hjx
和nil-tt2
hps32
在正常条件和热胁迫下的单株产量。(c、d)nil-tt2
hjx
和nil-tt2
hps32
在正常条件和热胁迫下的结实率、千粒重。(e)热处理后nil-tt2
hjx
和nil-tt2
hps32
的i
2-ki染色，比例尺0.1mm。(f)在正常条件下nils的农艺性状考察，株高(n＝48)、粒长(n＝15)、粒宽(n＝15)、穗粒数(n＝～26)、每株穗数(n＝～26)数据为mean
±
sd，以nil-tt2
hjx
为对照，使用one-way anova差异显著性检验，相同字母表示p》0.05。
51.图4、tt2参与蜡质合成相关调控途径。
52.(a)基于kegg注释的基因集富集分析(罗列了以nes评分的前十位)，es，富集分数；nes，通过基因集大小均一化后的富集分数。对于角质，软木酯和蜡质合成通路的基因集富集分析，绿色表示这个基因集运行的富集分数；黑色的线表示在这个基因集中的每一个基因以及他们所对应的排序位置，红色的线表示在热胁迫下与nil-tt2
hps32
呈现正相关；蓝色的线表示在热胁迫下与nil-tt2
hjx
呈现正相关。(b)在不同处理条件下以及不同的nil背景下的聚类分析。fkpm值被换算为log2(fpkm+1)的形式呈现在纵坐标上，每一个基因的fpkm值在不同样品不同处理方式下的变化情况由灰色的线呈现，蓝色的线表示的为fpkm的平均值情况。(c)针对于subcluster 2和subcluster 3的kegg注释分析。(d)转录组分析不同时间的热处理下，近等基因系之间蜡质相关基因的差异表达情况，这个图中共涵盖了49个蜡质相关的基因。(e)热图呈现的是在热处理后近等基因系之间蜡质相关的deg表达情况，3个生物学重复，每个生物学重复中含有24株独立水稻幼苗。(f)蜡质组分在不同处理条件即不同近等基因系之间的差异，样品被提取蜡质组分并用gc-ms进行分析，热图呈现的是有显著性差异的蜡质代谢物。(g)扫描电镜观察在0、12、20、24小时处理时间下不同近等基因系中叶片表面的蜡质晶体状态，比例尺，1μm。右图是对应的在不同时间处理条件下并且恢复7天后的抗热表型，比例尺，5cm。(h)qpcr鉴定热诱导的oswr2表达量的变化。
53.图5、oswr2作用于tt2调控的抗热通路下游。
54.(a)在nil-tt2
hps32
的背景下敲除oswr2，与野生型的比对后的敲除情况。(b)在nil-tt2
hps32
的背景下的oswr2敲除转基因植株(wr2/nil-tt2
hps32
)与nil-tt2
hps32
的抗热表型；比例尺，5cm。(c)在热胁迫下，转基因植株及其野生型的成活率统计。(d)甲苯胺蓝染色，表征植物表皮层透水性，12天的幼苗叶片在热条件下在tb的溶液中染色1小时后清洗掉多余着色，颜色越深，表明表皮层透水性越强。比例尺，2cm。
55.图6、sct1作为一个转录了因子结合oswr2的启动子。
56.(a)sct1在作物(水稻、小麦、玉米、大豆)及拟南芥中同源基因进化分析。(b)体外的chip-qpcr实验证明halo-sct1-nt蛋白可以结合到oswr2的启动子区域，这个cg1-like元件位于oswr2转录起始位点上游293bp左右，黑色的线表示通过qpcr扩增的区域，富集倍数通过input来作为内参，halo的空载蛋白作为对照。(c)凝胶迁移实验证明sct1/sct2可以结合到cg1-like的顺式元件，正常探针和突变探针的序列在图的顶端呈现，每一条探针都是
在5’端标记上cy5；检测结合的特异性，结合竞争实验通过加未标记的冷探针(5x，25x，50x)来实现。(d)在烟草中瞬时表达sct1-yfp、sct2-yfp、cam-mcherry，比例尺20μm。
57.图7、sct1负向调控蜡质合成和水稻耐热。
58.(a)sct1/sct2突变体和野生型zh11热处理后恢复7天的耐热表型，比例尺，5cm。(b)sct1/sct2突变体与zh11在灌浆期的抗热表型，37℃/33℃处理7天后恢复5天。比例尺，10cm。(c)在zh11的背景下敲除sct1/sct2，敲除后的基因组dna与野生型的对比结果。(d)基因植株与对应的野生型在热处理后的成活率统计，3个样品，每个样品包含24棵独立的水稻幼苗。数据为mean
±
sd，one-way anova分析，相同字母表示p》0.05。(e)qpcr检测oswr2在sct1/sct2突变体和野生型zh11，在正常条件和热胁迫下的表达模式，3个生物学重复。每个样品包含24棵独立的水稻幼苗。数据为mean
±
sd，student’s t-test分析，分析后的p值标注在图上。(f)转录组测序数据基于kegg的分析显示蜡质相关调控途径在未处理的条件下在突变体和野生型的差异基因中富集，3个生物学重复。每个生物学重复包含24棵独立的水稻幼苗。(g)热处理条件下，gc-ms呈现蜡质的含量和组分在sct1/sct2突变体和野生型zh11之间的变化，4个生物学重复。
59.图8、tt2参与调控热刺激下的胞内钙信号。
60.(a)siet检测水稻根部分生区(n＝6)、地上部叶肉细胞(n＝6)在热刺激下的钙流变化情况。数据为mean
±
sem，以nil-tt2
hjx
为对照。(b)siet检测的热刺激条件下nils的钙流速度变化曲线与时间的积分(曲线净面积)定量统计。数据为mean
±
sd，以nil-tt2
hjx
为对照。(c)siet检测水稻在热刺激下的最大钙内流定量统计。数据为mean
±
sd，以nil-tt2
hjx
为对照。(d)在根、中热诱导的胞内钙动态变化曲线，基于nes-yc3.6的转基因材料。胞内的钙是通过标准化的荧光强度比例(cpvenus/ecfp)来评估的，数据为mean
±
sem，以nil-tt2
hjx
为对照。(e)峰面积(以y＝1作为基线)。(f)最高峰值(cpvenus/ecfp)。n＝6，数据为mean
±
sd，以nil-tt2
hjx
为对照。(g)在整株幼苗内，热诱导的胞内钙浓度动态变化曲线，基于ubq10-aequorin的转基因材料。n＝21～22，数据为mean
±
sem，以nil-tt2
hjx
为对照。(h)钙浓度曲线积分，以处理前的静息钙浓度作为基线计算曲线下的净峰面积，数据为mean
±
sd。n＝21～22。(i)
△
[ca
2+
]
cytpeak-rest
([ca
2+
]
cyt peak-[ca
2+
]
cyt rest
)的定量结果显著性分析。数据为mean
±
sd，n＝21～22。
[0061]
图9、cam/sct1响应于钙信号负向调控下游oswr2的表达。
[0062]
(a)酵母双杂实验，空载ad、截短的sct1(
△
cambd)(1-670aa)、全长的sct1与cam-bd共同转入y2hgold的酵母菌株中，空载ad作为阴性对照。(b)sflc实验验证烟草体内sct1与cam的互作，空载作为阴性对照。(c)pull down实验来检测sct1-cambd与gst-cam或gst-hal3的互作，gst-hal3作为阴性对照，gst和mbp的抗体用于western blot的检测。(d)spr实验，在有无钙或者egta的条件下检测sct1-cambd的互作。基线上的信号值代表互作两个蛋白互作的强度，kd值是基于三个梯度浓度下的cam的信号曲线计算出来的。(e)sct1中cambd核心区域蛋白多肽的凝胶迁移实验，选用了sct1中第897-917位的氨基酸合成的肽段，设置梯度的肽段与cam的摩尔比，并且0.1mm的cacl2以及2mm的egta电泳液中进行实验。样本在非变性的page中进行分离，并通过考马斯亮蓝染色。在突变的肽段区域，第900位的缬氨酸和第907位的色氨酸被突变为精氨酸。(f)sct1对于oswr2的转录调控，5个拷贝的16bp的oswr2启动子区域(含acgcgc元件)作为报告载体，cam抑制sct1的转录活性，并且是cam浓度
依赖的，将转入空载effector时的luc/ren的比值标准化为1。(g)突变的cam
1234
缺少了结合钙的能力，同时也无法抑制sct1的转录激活活性。(h)在水稻原生质体中通过镧离子处理抑制ca
2+
条件下的双荧光检测实验。报告系统为5个拷贝的uas，effector为gal4-sct1。(i)oswr2在正常条件和热处理下，同时在水、氯化镁、氯化镧的处理下的表达模式。100μm mgcl2作为阴性对照，两个不同浓度的lacl3被用来抑制钙通道。
具体实施方式
[0063]
本发明首次研究及揭示了一种新的参与植物耐热性的信号通路：tt2-sct1/sct2-wr2信号通路；其中，tt2为调控植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的负调控因子，sct1/sct2也为调控植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的负调控因子，而wr2则为发挥作用的正调控因子，其在植物中维持稳态是有利的。本发明对于植物性状的遗传改良具有重要的理论意义。
[0064]
术语
[0065]
如本文所用，所述的“耐热能力/耐热性”、“热胁迫耐受(性)”与“抗热能力/抗热性”可互换使用。
[0066]
如本文所用，所述的“信号通路”与“调控通路”可互换使用。
[0067]
如本文所用，所述的“植物”为基因组中包含有本发明的tt2-sct1/sct2-wr2信号通路或参与该信号通路的基因/蛋白的同源物(同源基因/同源多肽(蛋白))的植物，所述的植物可包括单子叶植物或多子叶植物；如：禾本科植物、十字花科植物、豆科植物等。优选地包括禾本科植物。在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物。较佳地，所述禾本科植物如禾本科稻属植物水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米等。例如包括：水稻、高粱、玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦。本领域技术人员应理解，适用于本发明的技术方案的植物不仅限于上述列举的，可通过鉴定其中tt2-sct1/sct2-wr2信号通路的存在情况来确定适当的植物。
[0068]
如本文所用，所述的“在高温下保持产量”、“保护禾本科植物高温下产量”或“维持禾本科植物高温下产量”是指植物在高温(高于其常规培养条件的温度)环境下，保持存活、保持正常生长，并具有相对正常或基本正常的产量。在一些方式中，所述“在高温下保持产量”是指特定植物在高温环境下被培育后，其产量与“非高温环境(正常/适宜温度环境)”的产量相比，维持在后者的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上等；较佳地维持在后者的70％以上、80％以上、90％以上。
[0069]
如本文所用，所述的“高温”或“热(环境)”是指显著高于植物生长适宜温度(如对于水稻而言26～30℃、较佳地28～30℃为适宜温度)的温度；例如所述的“高温”或“热(环境)”是指35℃或更高、38℃或更高、40℃或更高、42℃或更高。
[0070]
如本文所用，术语“tt2-sct1/sct2-wr2信号通路”中，“sct1/sct2”表示“sct1和sct2”或“sct1或sct2”。sct1与或sct2高度同源，两者在功能上具有一定的冗余。
[0071]
如本文所用，所述的“上调”包括：促进、过表达、提高、增强等，其是统计学意义的或显著性的上调、促进、提高或增强，如上调、促进、提高或增强20％、40％、60％、80％、90％或更高。
[0072]
如本文所用，所述的“下调”包括：弱化、减弱、降低、抑制；表示显著性的下调、减
弱、降低、抑制，如下调、减弱、降低、抑制或下调20％、40％、60％、80％、90％或更低。
[0073]
如本文所用，所述的“耐热能力”是指植物耐受热环境的能力。通常，通过将测试植物与对照植物进行同一温度环境下的比较，来判断测试植物的耐热能力。当测试植物在高的温度下存活率更高、维持存活的时间更长，则通常认为其具有更好的耐热能力。
[0074]
如本文所用，所述的“耐热能力高”是指某一植物(例如经改造的植物)与同类或同种植物的耐热能力相比，有统计学意义的耐热能力的增强，如存活率提高5％、10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
[0075]
如本文所用，所述的“高表达或高活性”，是针对某一目标基因/蛋白，其在某特定植物(例如经改造的植物)中的表达或活性，与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
[0076]
如本文所用，所述的“低表达或低活性”，是针对某一目标基因/蛋白，其在某特定植物(例如经改造的植物)中的表达或活性，与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
[0077]
如本文所用，所述的“功能丧失性突变”包括：使得目标蛋白的功能丧失，例如其蛋白链的关键区域发生突变、缺失或插入导致功能丧失。在一些方式中，通过基因编辑，在目标蛋白编码基因中进行碱基的插入、缺失或突变，使得目标蛋白的翻译提前终止。
[0078]
如本文所用，所述的“功能获得性突变”包括：使得原本表达受限或不表达的目标蛋白正常表达；在一些方式中，通过基因编辑，在目标蛋白编码基因中进行碱基的回复(如回复到与野生型相同或简并的序列)，使得目标蛋白回复表达。
[0079]
如本文所用且本领域人员能够理解，选择合适的“对照植物”是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
[0080]
tt2-sct1/sct2-wr2信号通路
[0081]
本发明中，所述的“(信号)通路”是指由一系列蛋白或基因发生相互制约或相互作用而形成的信号系统，其一般会导致一些细胞事件的发生。所述的tt2-sct1/sct2-wr2信号通路包括(但不限于)：tt2(thermotolerance 2)基因(和/或其编码的蛋白)、sct1/sct2(ca
2+
sensing transcription factor 1/2)(和/或其编码的蛋白)、wr2基因(和/或其编码的蛋白)。
[0082]
所述的tt2的基因全长序列例如如seq id no:1所示，其编码区序列例如如seq id no:3所示，其蛋白序列例如如seq id no:6所示。
[0083]
所述的sct1基因全长序列例如如seq id no:7所示；其编码区序列例如如seq id no:9所示；其蛋白氨基酸序列例如如seq id no:10所示。
[0084]
所述的sct2基因基因全长序列如seq id no:11所示；其编码区序列例如如seq id no:13所示；其蛋白氨基酸序列例如如seq id no:14所示。
[0085]
所述的wr2基因全长序列例如如seq id no:15所示；其编码区序列例如如seq id no:17所示；其蛋白氨基酸序列例如如seq id no:18所示。
[0086]
当用于作为人工调控的靶标时或人为建立筛选系统时，以上的蛋白或编码基因可
以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物；也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的蛋白。此外，任何不影响这些蛋白的生物活性的变化形式都是可用的，如它们的功能未发生改变的衍生物或变异体。
[0087]
以上所述的信号通路蛋白的变异形式也被包含在本发明中，它们包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的多肽同源性高(比如与seq id no:4所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。来源于水稻以外其它物种的与所述多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的调控通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。
[0088]
以上所述的信号通路基因/蛋白的同源物也被包含在本发明中。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种水稻的相应信号通路基因/蛋白，但是获自其它物种的与所述信号通路基因/蛋白同源(如具有60％以上，如70％，80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。
[0089]
本发明还包括一种突变形式的tt2多肽截短体，编码其的基因序列在相应于seq id no:3的第165位发生突变，形成如seq id no:4的序列，从而该tt2多肽突变体发生显著性截短。所述截短体不具有野生型tt2多肽的功能，存在该突变的植物，耐热性能发生显著性变化，转变为耐热型的植物。
[0090]
编码所述多肽的多核苷酸(基因)可以是来自植物的天然基因，也可以是它们的简并的序列或经密码子优化的序列。
[0091]
包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含合适的表达载体。
[0092]
宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。
[0093]
植物改造
[0094]
本发明中，所述的“植物”包括表达tt2或包含tt2-sct1/sct2-wr2信号通路的植物。根据本领域的知识，存在tt2或包含tt2-sct1/sct2-wr2信号通路的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。
[0095]
在本发明的具体实施例中，以耐热的水稻品种为供体亲本，以产量优异的华粳籼74(hjx)作为轮回亲本构建了一套染色体片段替换系(cssl)，通过对cssl的抗热表型鉴定、筛选，筛选到了一个抗热株系hps32。本发明人将hps32与hjx杂交以构建f2定位群体，发现有一个显著影响水稻耐热能力的qtl位点，将其命名为tt2。通过图位克隆的方法，成功定位到了控制水稻耐热表型的tt2基因。通过测序，发现来自hps32亲本的tt2
hps32
基因的第165位的核苷酸c突变成a，进而形成tga而提前终止，从而编码了一个截短形式的蛋白。通过转基因鉴定，证实tt2确实是控制水稻高温耐受的功能基因。通过序列比对分析，本发明人证实tt2
hps32
位点来源于热带粳稻品种。tt2编码一个g蛋白γ亚基。本发明人构建选育了携带来
自hps32的tt2基因位点的近等基因系nil-tt2
hps32
和其对应的对照nil-tt2
hjx
。本发明人对nils的成熟期表型进行抗热鉴定，发现tt2
hps32
在高温下可以保护水稻产量，尤其是对于结实率的保护，并最终使得其在高温下的产量比对照提高了54.6％。tt2
hps32
会削弱热诱导的转录水平上的响应，并且差异基因富集到蜡质合成的相关通路。通过对蜡质代谢层面的研究，发现热会在nil-tt2
hjx
中诱导蜡质降低，但是在nil-tt2
hps32
中热却不会诱导蜡质降低、因此耐热能力增强。通过对一个重要的响应于热的蜡质正向调控基因wr2的转基因分析，发现在耐热的nil-tt2
hps32
敲除wr2会使得其耐热表型消失。通过对wr2启动子元件的分析，本发明人筛选到了一个转录因子sct1。进一步研究发现，sct1可以作为一个钙的感受器，其转录调控活性受到钙调素的影响，并且钙调素与sct1的互作是受到胞内钙浓度的影响，tt2参与热刺激下胞内钙流的增加，功能缺失的tt2
hps32
会减弱该过程，sct1可以感知在不同nils的背景下，热刺激诱导的胞内钙浓度的差异，并最终将其反映到对于wr2转录水平的调控。
[0096]
sct1/sct2可以作为一个钙离子的感受器，胞内钙离子浓度的变化，会被cam识别结合并将信号记录下来，形成ca
2+-cam的形式，从而促进了cam与sct1的互作，并抑制sct1的转录活性，从而导致下游基因如oswr2的表达量的下降，从而调控蜡质的含量和耐热性。
[0097]
因此，本发明人解析了一条从胞外热刺激到胞内钙信号，以及钙信号被解码转导为转录水平的响应，并且最终影响到蜡质代谢层面的调控通路，进而调控抗热性。
[0098]
基于本发明人的新发现，本发明提供了一种改良植物的方法，所述方法包括：调控植物体内tt2-sct1/sct2-wr2信号通路，进而调控植物耐热能力或高温下产量。
[0099]
一方面，提供一种增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的方法，包括下调tt2的表达或活性。
[0100]
另一方面，提供一种增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的方法，包括下调sct1/sct2的表达或活性。
[0101]
再一方面，提供一种增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的方法，包括阻断sct1/sct2对wr2的调控，维持wr2稳态。
[0102]
应理解，在得知了所述tt2-sct1/sct2-wr2信号通路(可选地，也包括其上下游基因)的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的tt2-sct1/sct2-wr2信号通路。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低tt2表达或使之缺失表达。
[0103]
本发明中，所述的tt2-sct1/sct2-wr2信号通路蛋白或其编码基因的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”，且它们为具有统计学意义的“上调”、“促进”。任何可提高所述信号通路蛋白的活性、提高所述信号通路蛋白的稳定性、上调所述信号通路基因的表达、增加所述信号通路蛋白有效作用时间的物质、增加各个蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于上调tt2或信号通路有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。
[0104]
本发明中，所述的tt2-sct1/sct2-wr2信号通路蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低tt2-sct1/sct2-wr2信号通路蛋白的活性、降低信号通路蛋白或其编码基因的稳定性、下调它信号通路蛋白的表达、减少信号通路蛋白有效作用时间、抑制信号通路基因的转录和翻译的物质、或降低各个蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调tt2有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可
以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰所述信号通路基因表达的干扰rna分子或反义核苷酸；或是特异性编辑tt2的基因编辑试剂，等等。
[0105]
本发明还提供了一种下调植物中tt2-sct1/sct2-wr2信号通路中tt2或sct1/sct2的方法，包括对其进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。对于tt2而言，作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使tt2转变为其截短体，从而改变植物的性状。作为一种更为具体的实施例方式，采用crispr/cas9系统进行基因编辑，从而敲除或下调靶基因。合适的sgrna靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。
[0106]
作为本发明的另一种实施方式，提供了一种下调植物中tt2的表达的方法，包括：(1)将干扰tt2基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。
[0107]
本发明中发现，所述信号通路中，wr2发挥正调控的作用，其启动子区与sct1/sct2发生相互作用，从而受到后者的转录调控。为了维持wr2稳定地发挥作用，可以阻断sct1/sct2对wr2的调控；或者，可以通过改变wr2启动子区的sct1/sct2结合区、使其不与sct1/sct2发生相互作用。如此操作，在热环境刺激下，胞内钙流的变化导致的变化将不再影响到wr2的正常功能的发挥，不影响蜡质的合成。
[0108]
植物定向筛选或靶向性筛选
[0109]
在得知了tt2-sct1/sct2-wr2信号通路及其通路基因/蛋白的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控植物耐热能力或在高温下产量的物质或潜在物质。
[0110]
因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的tt2-sct1/sct2-wr2信号通路及其中的通路基因的表达或序列特征或相互作用；若具有选自下组的一或多个特征，则该测试植物为具有耐热能力或在高温下保持产量的禾本科植物：该测试植物的tt2低表达或不表达；该测试植物的sct1/sct2低表达或不表达；该测试植物的wr2维持稳态。
[0111]
本发明提供了一种筛选提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达tt2-sct1/sct2-wr2信号通路的体系中；(2)检测所述体系，观测其中tt2-sct1/sct2-wr2信号通路蛋白的表达或活性：若tt2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；若sct1和/或sct2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；若添加候选物质后促进wr2维持稳态，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质。
[0112]
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序
列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
[0113]
经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于tt2-sct1/sct2-wr2信号通路或其中的通路基因/蛋白，对植物耐热性状、产量性状有调控作用的潜在物质。
[0114]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0115]
材料和方法
[0116]
1、实验材料和定位克隆
[0117]
本发明人利用耐热水稻品种作为供体亲本，以产量优异的感热品种华粳籼74作为轮回亲本构建了一套染色体片段替换系(cssl)，然后筛选获得了一个具有优秀抗热能力的株系hps32，再将其与华粳籼74回交纯化背景产生f1代，自交得到f2分离群体用于后续定位。首先通过观察f2代分离情况，通过图位克隆的方法将tt2基因初定位到水稻3号染色体短臂端，分子标记caps-0到indel8956之间。然后本发明人利用7820株f2水稻将其精细定位在分子标记caps-3和caps-4之间。这段基因候选区约25.22kb。通过比对网上日本晴参考序列发现该区域含有3个候选基因loc_os03g29370，os03g0407400，loc_os03g29389。通过设计引物扩增这三个基因全长基因组序列，比较野生型及突变体序列的差异，发现候选基因os03g0407400编码区的第165位碱基由c突变成a，进而导致第55位氨基酸突变为提前终止。因此，本发明人猜测候选基因os03g0407400就是tt2。同时利用bc5f2代植株构建了目标区段包含很小一段hps32染色体片段(携带有tt2
hps32
)、其他大部分遗传背景为hjx的近等基因系nil-tt2
hps32
及其对照nil-tt2
hjx
。所用的引物序列如下表1。
[0118]
表1、构建所用引物
[0119][0120]
2、转基因互补验证、过表达及互补验证和crispr/cas9基因编辑
[0121]
为了进一步确认os03g0407400就是造成tt2
hps32
表型的基因，本发明人将来源于野生型hjx74的os03g0407400启动子2.5kb、全长cds、500bp 3’utr构建到pcambia1300互补载体上，通过根癌农杆菌eha105介导的水稻种子诱导愈伤组织转化方法进行遗传转化，筛选转基因阳性株系。另外，本发明人通过构建了将野生型来源的tt2基因全长cds、玉米泛素启动子驱动下过表达tt2基因的载体。利用crispr/cas9基因编辑技术对目的基因(tt2、sct1/sct2、oswr2)分别设计基因敲除载体，用于目的基因的敲除。以上遗传性实验都是通过根癌农杆菌eha105介导的水稻种子诱导愈伤转化法进行遗传转化，通过遗传筛选转基因阳性株
系，获得稳定t2代转基因植株并考察表型。载体构建所用的引物序列如下表2。
[0122]
表2、构建所用引物
[0123][0124]
构建方法：
[0125]
pcambia1300互补载体：以水稻华粳籼基因组为模板，以表2相应引物扩增，获得的扩增产物克隆入pcambia1300中。
[0126]
pcambia1301过表达载体：以水稻华粳籼cdna为模板，以表2相应引物扩增，获得的扩增产物克隆入pcambia1300中。
[0127]
crispr/cas9敲除tt2载体：该载体引入细胞后，将tt2编码基因的第1位到第40敲除、第85位到第90位敲除；第19位插入一个核苷酸，第87位到第90位敲除；第20位核苷酸进行敲除，第91位的核苷酸a突变成t，进而导致tt2编码区发生移码，进而形成终止密码子而提前终止tt2的表达。
[0128]
crispr/cas9敲除sct1/sct2载体：该载体引入细胞后，将sct1编码基因的第267位到第268位敲除；第219位到第253位敲除；第222位插入1个核苷酸，进而导致sct1的编码区域移码而产生提前终止；将sct2编码基因的第218-248位核苷酸进行敲除；第231位插入一个核苷酸；第229-231位核苷酸进行敲除，进而导致sct2的编码区域受到破坏或移码。
[0129]
crispr/cas9敲除oswr2载体：该载体引入细胞后，oswr2编码基因中第148～169位核苷酸和第526位核苷酸被敲除；第166位被插入一个核苷酸，第526位核苷酸被敲除；第165位核苷酸和第522～526位核苷酸被敲除，导致oswr2蛋白编码区域移码，进而提前形成终止密码子而提前终止oswr2的表达。
[0130]
3、热刺激下的钙检测实验
[0131]
tt2编码的是一个g蛋白γ亚基，根据已有的研究，本发明人猜测tt2可能参与热刺激下的钙信号的调控。因此利用三种不同原理的实验来检测热刺激下胞外钙流、胞内钙信号和胞内钙浓度的变化(图8)。scanning ion-selective electrode technique(siet)技术广泛用于非损伤检测植物胞外离子在不同处理条件下的流速变化，负值表示内流，正值表示外排，通过监测胞外的离子流速及方向的变化，来确定热刺激下钙信号的变化情况。通过将流速曲线与时间的积分获得单位面积上的流量以及最大钙流来评估热刺激下nils之
间钙流的差异。借助nes-yc3.6(钙离子的传感器)的稳定转基因水稻材料，来检测热刺激下胞内钙水平的变化，其原理是借助荧光共振能量转移，当胞内钙水平升高时，供体cfp与受体yfp的距离被拉近，因此被cfp激活的yfp(fret)信号增强，最终以yfp/cfp的比值来直接表示胞内钙离子的水平。借助在不同nil背景下稳定转入ubq10-aequorin的转基因植株用于监测热刺激下胞内钙浓度的变化情况，其原理是借助生物发光来探测胞内的钙浓度，并最终通过相应的计算公式得到相对钙浓度。
[0132]
4、蛋白互作检测
[0133]
为了证明sct1和cam的互作，利用酵母双杂交技术进行体外的蛋白互作验证。将cam和sct1这2个基因都构建到pgbkt7及pgadt7载体上，然后分别共转酵母y2hgold感受态菌株。让其在二缺、三缺及四缺的sd培养基上生长3天后根据菌斑的大小及颜色判断这三个基因是否两两互作。基于酵母双杂交的结果，本发明人发现sct1和cam可以互作。为了确认该结果的可靠性，利用荧光素酶互补技术(split firefly luciferase complementation assay)进一步在烟草体内进行验证。分别将sct1、cam这两个基因的编码区构建在firefly luciferase的n端及c端，分别转化根癌农杆菌gv3101后，再混合两两共转化烟草，暗下培养48小时后，均匀luciferase的底物到叶片表面，然后用带有制冷模块的ccd成像仪拍摄。结果显示，sct1与cam之间确实能发生互作。本发明人又利用烟草做共定位判断发生互作的具体亚细胞场所。本发明人将sct1基因的编码区连接在venus载体上，将cam连接在mcherry的载体上。结果显示sct1和cam共定位在细胞核中。本发明人分别将tt2和sct1的n端构建到原核表达载体，pmal-c5x(mbp-sct1-cambd)以及pgex4t-2(gst-cam)的载体上，转入到大肠杆菌表达感受态中，加入iptg在10-16℃的环境下诱导表达24小时左右，然后通过亲和mbp蛋白的beads纯化蛋白，并检测是否能将gst融合蛋白拉下来。实验结果表明，gst-cam可以被mbp-sct1-cambd拉下来，因此证明sct1与cam互作。载体构建所用的引物序列如下表3。
[0134]
表3、构建所用引物(扩增模板：水稻cdna)
[0135]
[0136]
5、emsa及体外chip-qpcr
[0137]
sct1编码一个与钙调素蛋白结合的转录因子。因此，本发明人在体外用pmal原核表达载体转化大肠杆菌，纯化了mbp-sct1-nt融合蛋白，公司体外合成50bp左右带cy5化学发光基团的dna链(来自oswr2的启动子区域)与对应蛋白及冷探针结合，之后用tbe-page及非变性胶电泳，用拍胶仪拍照。本发明人发现sct1-nt是可以与oswr2的启动子区域结合的。本发明人也进行了体外chip-qpcr的实验，分别表达了halo的空载蛋白和halo-sct1-nt蛋白，然后将其与hjx背景下的片段化的dna孵育，然后通过halo的磁珠纯化蛋白，并对纯化下来的样品进行qpcr检测，以确定sct1与oswr2启动子区域的结合，实验结果表明，oswr2启动子区域内含cg1 motif的一段区域会明显的被sct1蛋白富集下来，因此证明sct1可以与oswr2的启动子区域发生互作(图6)。构建所用的引物/探针序列如下表4。
[0138]
表4、构建所用引物(模板：水稻基因组)/探针
[0139][0140]
6、表面等离子共振(spr)和凝胶迁移检验在不同钙环境下的蛋白互作强度
[0141]
将sct1-cambd蛋白固定在羧基传感器芯片(nicoya，sca0815)上制备蛋白质传感器芯片。将分析蛋白(cam)以20ml/min的流速注入不同的hbs缓冲液(10mm hepes，150mm，nacl，0.01％tween)中，加入ca
2+
或egta，然后记录响应曲线。当在同一芯片上测试多个蛋白质时，除非另有说明，否则在注射下一个蛋白质之前，通道被清洗。至少采用3种梯度分析物浓度(1.05、2.10、4.20μmol/l cam)得到准确的动力学数据。分析通过openspr生成的数据的，tracedrawer
tm
会选择合适的数学模型，并最终计算亲和力结合常数(kd值)，kd值越小表示两个蛋白的互作强度越强。实验结果表明，egta会抑制cam和sct1-cambd的互作，钙会增强cam和sct1-cambd的互作。凝胶迁移实验，人工体外合成一段位于长21个氨基酸的肽段，将其与钙调素孵育，并通过非变性胶进行分离，分别设置钙环境和egta环境的电泳液，通过凝胶迁移的改变来确定两者之间的互作情况。实验结果表明，钙对于sct1与cam之间的互作是十分重要的(图9)。
[0142]
7、细胞学检测
[0143]
nil-tt2
hjx
和nil-tt2
hps32
在热处理后蜡质含量有很大的变化，因此本发明人通过扫描电镜观察热处理前后表层蜡质晶体的状体，将处理前后的近等基因系的叶片速冻到液氮中，并通过冷冻干燥对样品进行固定，然后在场发射的扫描电镜下进行观察，在处理前，nil-tt2
hjx
和nil-tt2
hps32
表层片状蜡质晶体的排布及分布密度并没有差异，但是在处理20小时后，明显地感觉到nil-tt2
hjx
中的片状晶体排布变得稀疏，在处理24小时候，nil-tt2
hjx
的表皮受到严重损害，并且蜡质乳突皱缩，因此断定tt2可以参与热胁迫下，蜡质组分的调控(图4)。甲苯胺蓝(tb)染色，tb是一种水溶性的染料，被用来快速观察植物表层蜡质的含量情况，当表层蜡质含量降低时，tb溶液会快速的进入植物内，使得植物着色增强。实验结
果表明，在oswr2敲除的背景下，tbo染色程度是要深于其对应的野生型的，因此证明oswr2敲除使得表层蜡质组分降低(图5)。
[0144]
8、双荧光转录活性检测
[0145]
为了更精确了解ca
2+
/cam是如何调控sct1的转录活性的。本发明人首先将sct1和cam的编码区域分别构建到pgreen-62sk的载体上，以oswr2启动子上包含cgl元件在内的16个bp的区段串联重复5次，构建到0800的载体上作为报告载体(pro：5xcgl：luc)，将水稻的叶鞘细胞制备成原生质体，通过peg将上述载体共转到水稻原生质体中，室温孵育16h后，进行检测。sct1是一个正向调控转录水平的激活因子，本发明人在原生质体中转入sct1的同时还共转入了不同浓度cam，然后对sct1的转录活性进行检测，结果表明，随着cam的加入，sct1的转录活性被抑制了，并且该过程是cam浓度依赖的(图9)。通过对cam的钙结合区域进行突变，从而获得丧失钙结合能力cam
1234
，cam
1234
无法发挥对sct1转录活性的抑制作用，钙在cam-sct1的转录调控中发挥着重要的作用。用氯化镧(钙离子通道的抑制剂)处理原生质体，结果表明减少胞内钙离子可以一定程度上解除cam对于sct1转录活性的抑制作用。
[0146]
将sct1的启动子区域构建到dbd-gal4的载体上作为effector载体，将cam构建到pgreen-62sk的载体上作为plus载体，报告系统选择7x uas驱动的luciferase的载体，用35s驱动的renilla作为内参。将上述不同组合的载体分别转入水稻原生质体，来观察在不同la处理的条件下，cam对于sct1转录活性的影响。实验结果显示，cam对于sct1的转录活性有明显的抑制作用，但是在la处理的条件下，cam对于sct1的抑制作用受到了一定程度的解除。载体构建所用的引物序列如下表5。
[0147]
表5、构建所用引物
[0148][0149]
9、非生物胁迫处理
[0150]
对于温度处理，先把各个样种，催芽，待正常温度28℃生长12天后，对应进行温度(42℃)处理，处理后恢复20-24小时，恢复7天后观察表型。并对其成活率进行统计。
[0151]
10、序列信息
[0152]
tt2基因全长序列如seq id no:1(来源：hjx)：
[0153]
》gatcatctccattatcggaacttcggagtgacatggcaatggcggcggcgccccggcccaagtcgccgccggcgccgcccgacccatgcggccgccaccgcctccagctcgccgtcgacgcgctccaccgcgagatcggattcctcgaggtacaatctatctctatctgtctatatcactaccattcatactccttcgatcttgcttcaaaacaaaaaaatatatatttcctacttcatattcatatacacacgtacggcttgctatctgtcgaattgtttgcttctgcatgcat
gcatcactctcattgtaagtttttcccagcttaaaaccactccttttatcttcgttcttcttccttcttgtttttttttaaaaaaacaacaactcatttaatcttcatatagtgtatcatgcatcatttgcttctttgatcagttccccaaaaactgctcctctcttcccagccaaataattaaacttaagcaaacaagcaagttgaactgatgatccaataaaacaaaacaaaaccgatcgaataggaagtcaatggcatataccagctgctatagctgaagccacgaatgcttagcttagctctagtcgatccctgttgactgttcaacacactgcactaacacaccagttaatgagctgattaattaaaccattaaatgagcttaacgggcggctagcttcttcctctgggcccgtgccgatcgtaccatcggtttgcgcgtccctccacctaaactctctgccttgttattccctttgcctagtactacatgcatttgcatcatcatcccatcaccaatagtactacgtttcaactggattttggtggtgtccaaccatatcatatttggttttgttctctagtttactcctacattagtctctagcggttttgtggagtactaaagaaaacaactaatcagccagggtttaacgtttaatcggttggtggttttgttaattaatttcatctactattttagacttcacaggtcttcgagctataagcatcgattgccatgcatcaatcgatgctggtccacgctagtttctgagttctgactagctctcttaattgtgctttgacctactttaattaattaaccagtggctgcgtcactcattgaccaacattgtcatgttacccggactgattttttttttctttaaaaaaacaccggatatattattagttagtgtatatatatgtctgctcaagaagcgcatgcatatagtttctcgtcaaacaaaaaatgtactgtatgctcaaagcatctgttttggaattgtcatattcgcctttataattaaaataattaaaatggtgatgcccagctttttttttcctccaataatttatttattggcttgatttcctgtgctattaggagtaaaactactccgttttaattagcaccatttttaaagcttctaaaattaacctaagtaaagtacgacagtacttgctgtctagctttaaatgttttgggtgttaaaatatccctcagacatcacctgaaaagttgacaggctaaacacatgcccatctccctcgtttacttaaattaattcgaacaaacaactgtatatatatttcttgcagggtgaaataaattcaatcgaagggatccacgctgcctccagatgctgcagagagtaagccagcctgctgtttctttttgtactacttccatttcttctcgtctttactcttaccatgcattcacaaaatatacttacttaccccagtttttgatcatgaactttgaccgttatctttttaagcaacttcaataaaataggtttaaatgcaaatgttatgtacaccattgattataaaaccttggcaaatgaaagtaaaaaaccagcacatttaatttctgaacgttgggagtattattatttttatatcttttactatcatttaatcatagtatcgtgcaagctttttgagtgtaattaggttgcttaaggtaaaaaaatgtaactaggttacatttagtactaaactgaacatttaattagtaatgtttcgttaagtaactgtaatttcaatgcatgcatgtcctcccgtaagagcaagtttaatagtatagccaactactagctccaatttatttatagacaatctaatagctcattcatacaataattacatactacactattaatatctgatcccacctgtcatacacatactgcattttggagtccgtgctatagctgactacaaatctatagtccgctgctcttctctctctttatttatctccttaaaatatgtttgcagctggcttatagcctgctattgtacctgctctgaaaatagtgcagagactgttcaaaaagtcattgcacaataactattcacatggaactgtgaaaagtatatattggaacttactagctagatccttttgggaacatgggaaaagccaagtcacgtgtggaatccctattccctgtgttcttcagctagaagagtgaaaataatgtactactactatacggagatgaaattacagcaggagcagaaagcgggaaaaaaactttaaatcaattaaacaaacctctctctgcaaaattcaacaccagcaacgaacaactcatcaagttcttgtgttatgtaccggccggtaactaattgttgtttgcataagcgaaacggtatatttgcaaacaaaaaataatttatgaataaaacttttatatacatgttcttaattatctcaaaacaaaggttgaaaaataaacttcgatgaaaaaatctcaaaatcaattccaaatttatggtgaaaattttaaattttgtctgataaacataagtataagcaaaaaaaaaagtaaagcaatgtcactatgttaatggtattggtatatatacctttgagtttctgtctgtactttaggagtacatgctacgaacatgttttcttggcttctatttcgttggaattacttgcgtattgtgggccagacgcctggtgaacttcgtcgattgtgtggactaattaagctcacctgaaataagtggttgaaaacaaggctaaagatgattttaatcatggattttggcttggaaatttttttgtagggttgacgaattcatcggaagaactcctgatccattcataacgatgtatggattttcaggtcgagaatttgtctttaacttcgcacgactgttattttttttcttattaattctctgtttacaagcagttcatcggagaagcgaagt
catgatcattctcaccacttcttgaagaagtttcggtactcacttcattcccggatcttaatgtatatatgcatatctgcactgtgctaattggtgtacacattatgtgatcatcagtccaagttaattattacttacaaaactgaactaataaacactagaaaatatgtaacttgcaaagtacatattgaatcagggattcatatatagaactccacctgcagatttcttccaatatatatatgctgtcaccatgttttcacttgtcacctagtacacctttgactgggagactttccttgatgatcgacgtggtcatattcttcagattgatttaatttcagatagaaaaaaatattgtttacttagtttctctccttcagtaagagagatgtgcaagaccagcgatcaaactatatgaactgttcgtttcatgataaaaaaaacatgatatggaataactaggtgattcaacatataatggctgataatccctcgtttcaggagataccatcagttttctacttttctacttttctccatgttctctttttcatgtttgaggtggatcggagcttgtattagatgtttgctcagctcaattattgctgcagatttccctatatagcctccactgtatatatactccctccgattccataatttaatgatattttgaacaatgacgctgtctccaaaatatatctttcactttgttttcctattataatatatacaataaaaaaaatacatatttacttttcttataaatagtttcaaagacaaatctatatatgttgttatataactcttttaaactaaatatttttaaagttatagtcaaagttacaaaagttggacctcaaacatgtataaaacgtcgagaattgtatatctgatcaaccaataatttgtagtgcattgtcttaaaaaaattgcatttctagctatgtatctagataattacaagaaccaggtgaaatcacattttatttttactggaccacgaactcattgtttaattacttccagccttgcactaaataacaataattgaacctggcatcacctgcacaattaatttggacacaaagtaaacatgaatgcaacatacttcgtttcatattgtttgttggtgtaggatttaaattttgtgtcaaaatacttgccgttcttactacattcttaagcactttgagaactaaccttctcttcctacccttcatcaatacagtcatactaactaattggctcttatgccttgaaaaactaattaggatgtatttaatgagggtaaccatgtaatctgccaccagtgaatgcaattttggttcaaaatttcgggcccccgccctaaaaagtcattatctcgatagaatttttttgaatttagtcaaaatttattcaaatttagccaaattgtgttaaatttcaaataatttcagtctaaaaagtgctgaaaatcccgaaatttaggttctaccgaaatggccggaaattttcagcgaaaatcaaacatgaaaaccttgtctgccacatttgttagtttgtgtaaagatttgctagaacgataagtaatttgaagcggatgtatattatatatcccacaaaaccatcaacttgttaattacatgtatatttgtgcatgatgctttcaccactttgtggttgttaacgattaaatcacacgttttattttctcacagctgtttgtgcagagcaagtgcgtgctgcctcagctacctctcctggatctgctgctgcagcagcgccgccggcggctgctcatcctcctcctcctcctccttcaacctcaagaggccgagctgctgctgcaactgcaactgcaactgctgctcctcctcctcctcctcatgtggggcggcgttaacgaagagtccgtgtcgctgccgccgccgcagctgctgctgccgtcgctgctgctgcggcggcgtcggcgtccgcgcgtgcgcgagctgcagctgctccccgccgtgcgcgtgctgcgcgccgccgtgcgcgggatgctcgtgccgctgcacctgcccgtgcccgtgccccggcggctgctcctgcgcgtgcccggcgtgcaggtgctgctgcggcgtccctcgttgctgccccccctgcttgtgatcgatcgatcgattgagcgaagctgcactgattggttaattaattagttctcgatgatgatcgatcgagctgcgcgcgtacttaattagctagctaggttctggtgttaattagttcctcatcgatgcatatgttgattgccttgctctgcttgcggttatctgtaatttggctttgctgccatgatgagtacgtgattgctgatttattttac
[0154]
tt2启动子序列如seq id no:2(来源：水稻hjx)：
[0155]
》actttttaaccaacgtttgaccactcgtattattcaaaaattttatgtaaatataaaaatacttatgtcatgcttaaagaacatttgatgataaatcaagtcacaataaaataaattataattacaaattttttttgaataagacgaaaggtcaaacgtttgtaaaaaagtcaacggcgtcatacattaaaatacggagggagtacataatactccatccatttttttagtacgacattatttagttaaaatgtggaaaaaacttagagaaagtagactataaaaaggttgaatggtgcaaagtaagcatagctaaactggttttttatgttacttgttgtggaccctatctacttggattcaaggtttaaacttggtatgggtgcacgtatttacggctaattatttttaaatggtaggtgatgtactgttgacagcgagacgctctcatgatgactttatcaatctaaacatatatatgttggtgcaactttttcaaaggtacttaattcaaaggatagga
tatttatgtatgagtttgttcataagaacgaatatgccttgataggttgtgcatgggtatctataagagtgagtgtgtgtataatatgatagggtgtgtgtgtgtttttataagaacgactacgcgcatctctatatttcggtacatcccgggtatgccttctctaaaaatgtcttgtgctaaagttgaagacaacttctaaggaaggtatctctcatcttccttgtgtgtccctactagaaaatatttttacaggcggccaaaatatttttttttgcaggcgtccataacctccgcctacacccaaagtcatgcaaaaatcaataatttttgtaggtggctaaatccacccgtttgcgaaaatattttcagcgtaaagaaaattcgccgccctcagccctacccaccgccgccctccccttcggccggatctagggttatggttttgggaggaagagggaggggaggggagctgcgtcaccatcactgaatctggtaggtgagagcgccgccatgagctcaccggtgctgccgccgacctcctgcctacgtgccgccttctccgctgcaagtcgccgctgctgccctccccacgacacagctggatccgggaggggagggcagggaaggttcgctgtcgccgccgccaccctccctacgacgtagccagatatgggtggagaggtaagcgccgccgccgctgcacaacccacgatgccgccgctgcacaacccgcgatgccgtcggccggatttgggaggtggagcgtcgccgccctccgccccgcgccatgtctgaggaaagagagcgatgggagcgccgccggccaccaccgtccccccttccccctccaaccagatctgggaggaagggagggagggaggggagccatcacgtcgttgggagtagatgccgccaccgccctccccctccctgcggccaccacactggggtgcaccgccaccgctaggtagccgcctctggctggatccacgccgaggagaggaaggagagggagagggagagggaggggaggggagatgtggaagttgacttagaaaattttgacgcccggtggtttttaagatactttacctttttgcaggcggatttattaaagaggtccgtctgcaaaaataatgatattttcacggtcggacctcttaagatatctacatgtagaaatctatatttttttacttaaattactgccagggctttgcctcgtagtataattttcataaaaactcaaaatatttacaaattacaaaagaggaaggaaggagaaaaacttataaagattacaatgtttgtaaccaatcaaaaactatctgctttaaaggatctttcattctacacatatgaagaagaacttcttttctaaacgatattcttcatgaaccaaaggagggaagctcattccgaaaatttttcccatttctctgctcgtaggcggataactatctcatctcacggttgttatttttgtaggtggctatttggcttccagagacctactcgtccgggaaaaagaaatgccagcatctagaaaaatagtttttctagtagagtgttgtgagcgtctgcgatcgtggtaaagaaagcaaaaaaggtgaaggacgagtggcatgatacatatgggaaagctgtagactttgacccttgactactcgttggaagtgtgcgtctgcatgcattattgaacggctctgatccccgcggcgcagcggatcggggtcatgtccggatgggcatatcgacgagaaggatccgtccccgacaatctttcaaggcccgtgcccccgtccctcctctcctctgcgcctttccatcatcatttacgcccaaccccaacacatgtacatttcccttggcttgcttccggagaagaaaagagcggccatccactccactctccactctctcccttccatcattacttgcccaaaaacggcaatcccctcccctccatctccatgtgctcttccacctagctccgccattcaaagcaaagcaccaagcttttgcctctccctctaccatgcctgccccctatacatagctgctgcaccgtctctcttcataaatatactagtaggagtagcagagctcatcacttc
[0156]
tt2
hjx
编码区序列如seq id no:3(来源：水稻hjx)：
[0157]
》atggcaatggcggcggcgccccggcccaagtcgccgccggcgccgcccgacccatgcggccgccaccgcctccagctcgccgtcgacgcgctccaccgcgagatcggattcctcgagggtgaaataaattcaatcgaagggatccacgctgcctccagatgctgcagagaggttgacgaattcatcggaagaactcctgatccattcataacgatttcatcggagaagcgaagtcatgatcattctcaccacttcttgaagaagtttcgctgtttgtgcagagcaagtgcgtgctgcctcagctacctctcctggatctgctgctgcagcagcgccgccggcggctgctcatcctcctcctcctccttcaacctcaagaggccgagctgctgctgcaactgcaactgcaactgctgctgctcctcctcctcctcatgtggggcggcgttaacgaagagtccgtgtcgctgccgccgccgcagctgctgctgccgtcgctgctgctgcggcggcgtcggcgtccgcgcgtgcgcgagctgcagctgctccccgccgtgcgcgtgctgcgcgccgccgtgcgcgggatgctcgtgccgctgcacctgcccgtgcccgtgccccggcggctgctcctgcgcgtgcccggcgtgcaggtgctgctgcggcgtccctcgttgctgccccccctgcttgtga
[0158]
tt2
hps32
编码区序列如seq id no:4(来源：水稻hps32)：下划线标记为第165位核苷酸c
→
a突变，造成提前终止：
[0159]
》atggcaatggcggcggcgccccggcccaagtcgccgccggcgccgcccgacccatgcggccgccaccgcctccagctcgccgtcgacgcgctccaccgcgagatcggattcctcgagggtgaaataaattcaatcgaagggatccacgctgcctccagatgctgaagagaggttgacgaattcatcggaagaactcctgatccattcataacgatttcatcggagaagcgaagtcatgatcattctcaccacttcttgaagaagtttcgctgtttgtgcagagcaagtgcgtgctgcctcagctacctctcctggatctgctgctgcagcagcgccgccggcggctgctcatcctcctcctcctcctccttcaacctcaagaggccgagctgctgctgcaactgcaactgcaactgctgctcctcctcctcctcctcatgtggggcggcgttaacgaagagtccgtgtcgctgccgccgccgcagctgctgctgccgtcgctgctgctgcggcggcgtcggcgtccgcgcgtgcgcgagctgcagctgctccccgccgtgcgcgtgctgcgcgccgccgtgcgcgggatgctcgtgccgctgcacctgcccgtgcccgtgccccggcggctgctcctgcgcgtgcccggcgtgcaggtgctgctgcggcgtccctcgttgctgccccccctgcttgtga
[0160]
tt2
hjx
的蛋白序列如seq id no:5(来源：水稻hjx)：
[0161]
》mamaaaprpksppappdpcgrhrlqlavdalhreigflegeinsiegihaasrccrevdefigrtpdpfitissekrshdhshhflkkfrclcrasacclsylswicccssaaggcssssssfnlkrpscccncncncccssssscgaaltkspcrcrrrscccrrcccggvgvracascscsppcaccappcagcscrctcpcpcpggcscacpacrcccgvprccppcl
[0162]
tt2
hps32
的蛋白序列如seq id no:6(来源：水稻hps32)：第55位氨基酸变成了终止：
[0163]
》mamaaaprpksppappdpcgrhrlqlavdalhreigflegeinsiegihaasrc
[0164]
sct1
nipponbare
基因全长序列如seq id no:7(来源：水稻日本晴(nip))：
[0165]
》tgcgtgcggtgtccaattgttctccctctcgcctcgcccccccaagcaacaccgccacctaccgtctctcgcgtcgaacccccgcacaaaaccccccgcgaaatctcgccccggatcgccggggaaagggaggtggtgggagcccgctcgcgatccgggaggaggaggaggagcggtgaatctgctggccggcgcgcgcgcgggcgggcgggttgttcgcgatggcggaggggcggcgctacgcgatcgcgccgcagctaggtgagggccggtctttgtgggctctgagattttcctttttcttcccccggtttgtgctcatctgcgtgcgttctgtggtttgattggtggatttacgaagcggctggctttggtcaacgcctcggtctttgttttggttagtttcctagtactccggttgcgttccgggtggtggagtttgtggcgcggaagccggtggagctgggagttttgttggccctgttcgttcggcgcgggatttggaatttgggtttggagtctactgattgcgtgggtggttggaaacttggggagttcgtcggaatttttcgtgttcctctgtcggaattgtacggagtttttggtggccacaggagttgaggtgatgatgcaaagcagagattccggtccggtctctaagactgagcgttctggactctggagtgatcgggaactgttgcaactgctctaaaggattgggaattgtatttgtgttctggagatgggcttggacctaaaagttggcttagatgcgtagtaatttgaaaaaaaagggcgtaattctttctcatttacaaatatattcggttgtctaactctgcatttcatcgacttctaaacagatattgagcagatactgaaggaggctcaacgccgatggttacgtccgactgaaatttgtgaaatacttaagaattacaggagtttccgtattgctcctgaacctccaaataggcctccaagtatgatctccacgagtactgttgtcttataattttttgtcacaaaagtcgcatgtttattatttttaagcagttgacatatacccctgacctaactatgttgtttttggcgggttcattcgttaacttgtactatgctgtttaagaacataaaacgtgggtgtgtgattttcagttatcatgctaccctgcccaaacataaaacatttgccacttgatcaaaagcctatacaccttctcattttttaattgtatttcctggccccttgtgttatcaacttaccatcctttaatctttcaattacactatgctcttttcctttaatcaatccccttttgatcagttatgattttgtggtttgcacatttgatttactactgtcttcactctcaacacctgtgattgcctcaattacgtacacaaaggatttgataaagtgtctataagtaat
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[0166]
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启动子序列如seq id no:8(来源：水稻日本晴)：
[0167]
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[0168]
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nipponbare
编码区序列如seq id no:9(来源：水稻日本晴)：
[0169]
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[0170]
sct1
nipponbare
的蛋白序列如seq id no:10(来源：水稻日本晴)：
[0171]
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[0172]
sct2
nipponbare
基因全长序列如seq id no:11(来源：水稻日本晴)：
[0173]
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[0174]
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启动子序列如seq id no:12(来源：水稻日本晴)：
[0175]
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[0176]
sct2
nipponbare
编码区序列如seq id no:13(来源：水稻日本晴)：
[0177]
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[0178]
sct2
nipponbare
的蛋白序列如seq id no:14(来源：水稻日本晴)：
[0179]
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hjx
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[0181]
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[0182]
oswr2
hjx
启动子序列如seq id no:16(来源：水稻hjx)：
[0183]
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[0184]
oswr2
hjx
的编码区序列如seq id no:17(来7源：水稻hjx)：
[0185]
》atgggacagtcgaagaagaagttccgcggagtcaggcagcgccactggggctcctgggtctccgagatcaggcaccctctccttaagaggagggtgtggctgggtacctttgagacggcggaggaggcggcgcgggcgtacgacgaggccgccatcctgatgagcggccgcaacgccaagaccaacttcccggtcgcgaggaacgccacgggggagctcacaccggcggctgcggtggcagggcgggatggccgtgtcggcggcggcagcggcagctcgtcctcaatgacggccaacggcggcgggaacagcctgtctcagatcctcagcgccaagctccgcaagtgctgcaagacgccgtcgccgtcgct
cacctgcctccgcctcgacccggagaagtcccacattggcgtctggcagaagcgcgccggcgcacgcgctgactccagctgggtcatgaccgtcgagctcaacaaggacacggccgtgtcgtcggctgcgaaggtggcagcagcaacagcagcgtcgtccagcgaccagccgactccgagtgacagcacagtcacaacgacgtccacgtccaccacgggctcgccgtcgccaccacctccggcaatggacgacgaggagaggatcgcgctgcagatgatcgaggagctgctgggcaggagcggcccgggctcgccgtcacatgggctgctgcacggtggtgaaggtagcctcgtcatctga
[0186]
oswr2
hjx
的蛋白序列seq id no:18(来源：水稻hjx)：
[0187]
》mgqskkkfrgvrqrhwgswvseirhpllkrrvwlgtfetaeeaaraydeaailmsgrnaktnfpvarnatgeltpaaavagrdgrvgggsgssssmtangggnslsqilsaklrkccktpspsltclrldpekshigvwqkragaradsswvmtvelnkdtavssaakvaaataasssdqptpsdstvtttststtgspsppppamddeerialqmieellgrsgpgspshgllhggegslvi
[0188]
实施例1、对高温有较高耐受能力的自然位点tt2
hps32
的获得及克隆控制其表型的基因
[0189]
为了挖掘更多水稻耐热的优异种质资源，研究抗逆性状形成的分子调控机制，本发明人以耐热的栽培稻品种为供体亲本，以推广的高产品种华粳籼74(hjx)为轮回亲本，构建一套覆盖水稻全染色体片段的替换系。并从中鉴定到了一个具有稳定抗热能力的替换系hps32(图1a)。将hps32与轮回亲本hjx杂交，构建bc5f2定位群体，通过对7820株个体的多代定位以及对若干个局部段片段替换的重组个体的抗热表型鉴定(图1b)，本发明人将tt2(thermotolerance 2)最终定位在25.22kb的范围内，发现其中有一个基因在hps32和hjx中存在一个snp，并且在hps32中造成了蛋白的翻译提前终止(图1c)。为了明确tt2的候选基因，在hjx背景下敲除tt2(tt2
ko
/hjx)，热胁迫不耐受的hjx呈现出明显的抗热能力增强的表型，并且其成活率高达90％左右(图1d，图1i)。
[0190]
在nil-tt2
hps32
背景下过表达来自hjx背景的tt2(pubi:tt2
hjx
/nil-tt2
hps32
)，可以恢复nil-tt2
hps32
的表型(使其由抗热表型变为感热表型)(图1e，图1i)。在nil-tt2
hps32
背景下转入由tt2自身启动子驱动的tt2
hjx
的全长基因组dna(ptt2:tt2
hjx
/nil-tt2
hps32
)，同样可以互补nil-tt2
hps32
的抗热表型，并且使得其成活率较对照呈现极显著的下降(图1f，图1i)。
[0191]
通过序列比对分析，本发明人证实tt2
hps32
位点来源于热带粳稻品种，含有该位点的热带粳稻呈现出较强的抗热能力，在温带粳稻中该位点的存在比例较低，因此呈现出较弱的抗热能力(图2a-d)。
[0192]
因此，本发明人成功定位克隆到了调控水稻热胁迫耐受能力qtl，tt2是一个水稻热胁迫耐受的负向调控子，当tt2功能缺失时，会赋予水稻较强的热胁迫耐受能力。
[0193]
实施例2、tt2
hps32
位点在热胁迫下保护水稻产量
[0194]
本发明人对近等基因系的成熟期植株进行抗热能力的鉴定，发现在高温处理下nil-tt2
hps32
表现出较强的热胁迫耐受能力，并且在处理后仍然能观察到绿色的叶片组织并且保持着挺立的株型，相反nil-tt2
hjx
则表现为整个植株的枯萎，叶片卷曲失绿等一系列热敏感表型(图1g-h)。
[0195]
本发明人对穗部进行观察发现，相较于nil-tt2
hps32
，nil-tt2
hjx
中出现了明显的穗部发育异常的表型(图3a、e)，并且结实率明显降低。在未遭受热胁迫的情况下(正常条件下)，nils之间在单株产量、结实率、每株穗数等方面均没有差异；当给予水稻横跨整个灌浆期的高温处理时，很明显地看到高温造成了nil-tt2
hjx
的严重减产，主要是结实率的显著性
下降，然而在nil-tt2
hps32
中，由于tt2的功能缺失减少了水稻产量的下降，主要是对结实率的保护，热处理后，nil-tt2
hjx
的结实率仅有40％左右，然而nil-tt2
hps32
则维持在75％左右(图3c)。在正常条件下，nil-tt2
hjx
和nil-tt2
hps32
在单株产量上并没有明显差异，但是在热处理后，nil-tt2
hps32
比nil-tt2
hjx
在产量上提升55.6％左右(图3b)，减少了因热处理导致的产量损失(图3d)。在正常条件下对各株进行农艺性状考察如图3f。
[0196]
上述结果证明，tt2
hps32
在热胁迫下对水稻产量起着重要的保护作用。
[0197]
实施例3、tt2编码g蛋白γ亚基，通过oswr2参与调控热胁迫下蜡质含量的变化
[0198]
转录组数据证明，无论是热诱导的基因上调还是热诱导的基因下调，nil-tt2
hps32
的变化趋势总是要弱于nil-tt2
hjx
(图4b-c)，因此本发明人发现tt2的功能缺失，使得水稻中热诱导的转录水平响应受到了一定程度的抑制。借助kegg的富集分析，本发明人发现近等基因系在热处理后的差异基因富集于蜡质合成通路(图4a)。通过不同时间下的转录组测序，本发明人发现在nil-tt2
hjx
中大多数蜡质基因在热处理1h后就呈现出下调的趋势，并且随着热处理时间的增长，其下调趋势更为明显，但是在nil-tt2
hps32
中，这些基因在整个处理时间内基本维持不变，或者表现为与nil-tt2
hjx
相比减弱的下调趋势(图4d-e)。这些结果显示热胁迫会诱导水稻中蜡质相关基因的下调，但是功能缺失的tt2会阻止这部分基因的下调。代谢组的数据证明，在正常条件下在nil-tt2
hjx
和nil-tt2
hps32
之间并没有明显差异，当施加热处理后，本发明人可以观察到在nil-tt2
hjx
中蜡质组分呈现出明显的下降，但是在nil-tt2
hps32
中蜡质组分受热诱导下降的现象被抑制了(图4f)。水稻表层蜡质晶体的电镜观察，同样支持了上述结论，tt2
hps32
在热胁迫下，减少热诱导的蜡质含量的降低，且tt2在热胁迫下水稻蜡质的调控中起着重要的作用(图4g)。本发明人在nil之间受热改变的蜡质相关基因中找到了一个重要的正向调控蜡质合成的转录因子oswr2(图4h)。
[0199]
在nil-tt2
hps32
的背景下构建了oswr2-knockout的植株(wr2/nil-tt2
hps32
)，本发明人发现oswr2的敲除会互补nil-tt2
hps32
的表型，并且使得其成活率显著性地下降(图5a-d)。因此，oswr2作用于tt2抗热调控通路的下游。
[0200]
实施例4、sct1直接结合oswr2的启动子
[0201]
本发明人通过对oswr2启动子的结合元件分析，发现了一个cg1类似的结合元件，本发明人将其命名为sct1(sensing ca
2+
transcription factor 1)和sct2(图6a)。sct1作为一个转录因子，具有结合启动子并调控靶基因转录水平的功能，本发明人通过emsa(凝胶迁移实验)和体外的chip-qpcr实验证明了sct1是能结合到oswr2的启动子区域上的(图6b-d)。sct2也能结合(emsa实验验证，图6c)，sct1和sct2在功能上冗余，因此本发明人将两个基因都进行突变。
[0202]
该结果提示，sct1可以直接结合oswr2的启动子并调控oswr2的表达。
[0203]
实施例5、sct1在热胁迫下负向调控水稻蜡质合成及热胁迫耐受能力
[0204]
在中花11背景下构建了sct1/sct2-knockout转基因系(sct1/sct2)，抗热鉴定显示sct1/sct2的植株呈现出相较于中花11要强的热胁迫耐受能力，并且其成活率也是显著性地高于野生型中花11，sct1/sct2的突变同样使得水稻在成熟期获得抵御高温的能力(图7a-d)。qpcr实验显示，野生型中花11中的oswr2的表达水平受热而呈现明显的下调，但是在sct1/sct2突变体中这种受热下调的表达被抑制了，呈现出与nil-tt2
hps32
在热胁迫下一致的表达模式(图7e)。kegg分析以及gc-ms检测结果显示，在热处理后野生型中花11的各类蜡
质代谢物的含量是显著低于sct1/sct2突变体(图7f-g)。
[0205]
因此，上述实验从转录水平及代谢水平上证明了sct1/sct2是一个在热胁迫下负向调控蜡质含量的转录因子，并最终负向调控水稻耐热能力。
[0206]
实施例6、tt2参与热胁迫下胞内钙信号的调控
[0207]
g蛋白在之前的研究中被证明参与胁迫下的钙信号，本发明人通过siet非损伤电生理技术来检测、基于fret的nes-yc3.6钙的报告系统和基于水母荧光蛋白生物发光的钙浓度检测系统来检测热刺激下近等基因系之间钙信号的差异，本发明人分别对植物的根部不同区域、叶片不同区域或者整株幼苗做了热刺激下的钙的检测。
[0208]
结果发现，nil-tt2
hjx
受热胁迫后胞内钙浓度的升高都显著高于nil-tt2
hps32
(图8a-i)，表明功能正常的tt2
hjx
对于热胁迫下胞内钙信号诱发必不可少，而功能缺失的tt2
hps32
抑制了热胁迫下胞内钙信号。
[0209]
实施例7、sct1可以感知钙信号，通过cam以钙依赖的方式负调控热诱导的oswr2的转录响应
[0210]
蛋白互作实验证明sct1可以与钙调素cam发生互作，并且cam与sct1的互作是依赖于钙离子的(图9a-g)。双荧光转录活性实验证明sct1是一个转录激活因子，但随着cam的加入，sct1从一个转录激活因子转变为转录抑制子，并且该过程是cam浓度依赖的，当共转入无法结合钙离子的突变形式的cam
1234
时，cam
1234
无法发挥对sct1转录活性的抑制作用，通过氯化处理阻滞钙离子通道可以一定程度上解除cam对于sct1转录活性的抑制作用(图9h)。
[0211]
本发明人通过体内实验验证该过程，qpcr检测热处理和氯化镧交互处理水稻植株，在nil-tt2
hjx
中热诱导的oswr2下调被减弱，并且该减弱过程是镧离子浓度依赖的(图9i)。
[0212]
因此，sct1/sct2(根据分析sct2也起作用)可以作为一个钙离子的感受器，胞内钙离子浓度的变化，会被cam识别结合并将信号记录下来，形成ca
2+-cam的形式，从而促进了cam与sct1的互作，并使sct1/sct2转录抑制的活性，进而导致下游基因如oswr2的表达量的下降，从而调控蜡质的含量和耐热性。
[0213]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。