一种转氨酶突变体及其编码基因与应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种转氨酶突变体及其编码基因与应用。


背景技术：

2.转氨酶(transaminase,ta,ec 2.6.1.x)，又称氨基转移酶，主要应用于催化氨基和酮基之间的氨基转移，是催化生成手性胺的关键酶之一。手性胺是合成天然产物和手性药物的重要中间体，手性胺的不对称合成研究具深远的理论价值和现实意义。
3.天然的转氨酶的往往存在催化效率低，稳定性差的缺点，限制了其广泛应用。定点突变是指在已知的基因序列中插入、取代和缺失特定核苷酸，从而改变蛋白质一级结构。通过定点突变可对酶进行改造，从而获得催化活性及稳定性提高的突变体。中国专利文献cn107653233a公开了一种改进的转氨酶，通过对来源于烟曲霉菌af293的转氨酶的三个位点进行突变后，获得的突变体酶活提高了两倍。
4.现有技术仍存在转氨酶酶源较为单一、突变改造后酶活性提升不够明显等缺陷，本领域亟需开发新的具有高催化活性及立体选择性的转氨酶。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种转氨酶突变体及其编码基因与应用，该转氨酶突变体来源于烟曲霉菌af293的转氨酶，可以催化底物(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-2-甲基-4戊酮酸生成沙库巴曲中间体(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸，而且克服了野生型转氨酶转化效率低的缺点，具有明显提高的催化活性，可达野生型的25倍。
[0006]
为此，第一方面，本发明提供一种转氨酶突变体，其包含在seq id no：1所示氨基酸序列中具有下组之一或任意两种以上的组合的氨基酸取代：
[0007]
将第113位的甲硫氨酸(m)取代为缬氨酸(v)；
[0008]
将第181位的亮氨酸(l)取代为谷氨酰胺(q)；
[0009]
将第126位的谷氨酰胺(q)取代为亮氨酸(l)；
[0010]
将第143位的亮氨酸(l)取代为甲硫氨酸(m)。
[0011]
根据本发明所述的转氨酶突变体，表示氨基酸位置的数字编号方式为：以seq id no：1的n末端第一个氨基酸为第一位，依次向c末端方向进行编号。
[0012]
在一些实施方式中，所述转氨酶突变体包含在seq id no：1所示的氨基酸序列中具有下组之一的氨基酸取代：
[0013]
将第113位的甲硫氨酸(m)取代为缬氨酸(v)；
[0014]
将第181位的亮氨酸(l)取代为谷氨酰胺(q)；
[0015]
将第126位的谷氨酰胺(q)取代为亮氨酸(l)；
[0016]
将第143位的亮氨酸(l)取代为甲硫氨酸(m)；
[0017]
将第113位的甲硫氨酸(m)取代为缬氨酸(v)，且将第181位的亮氨酸(l)取代为谷氨酰胺(q)；
[0018]
将第113位的甲硫氨酸(m)取代为缬氨酸(v)，且将第126位的谷氨酰胺(q)取代为亮氨酸(l)；
[0019]
将第113位的甲硫氨酸(m)取代为缬氨酸(v)，且将第143位的亮氨酸(l)取代为甲硫氨酸(m)；
[0020]
将第181位的亮氨酸(l)取代谷氨酰胺(q)，且将第126位的谷氨酰胺(q)取代为亮氨酸(l)；
[0021]
将第181位的亮氨酸(l)取代为谷氨酰胺(q)，且将第143位的亮氨酸(l)取代为甲硫氨酸(m)；
[0022]
将第126位的谷氨酰胺(q)取代为亮氨酸(l)，且将第143位的亮氨酸(l)取代为甲硫氨酸(m)；
[0023]
将第113位的甲硫氨酸(m)取代为缬氨酸(v)，且将第181位的亮氨酸(l)取代为谷氨酰胺(q)，且将第126位的谷氨酰胺(q)取代为亮氨酸(l)；
[0024]
将第113位的甲硫氨酸(m)取代为缬氨酸(v)，且将第181位的亮氨酸(l)取代为谷氨酰胺(q)，且将第143位的亮氨酸(l)取代为甲硫氨酸(m)；
[0025]
将第113位的甲硫氨酸(m)取代为缬氨酸(v)，且将第126位的谷氨酰胺(q)取代为亮氨酸(l)，且将第143位的亮氨酸(l)取代为甲硫氨酸(m)；
[0026]
将第181位的亮氨酸(l)取代为谷氨酰胺(q)，且将第126位的谷氨酰胺(q)取代为亮氨酸(l)，且将第143位的亮氨酸(l)取代为甲硫氨酸(m)；
[0027]
将第113位的甲硫氨酸(m)取代为缬氨酸(v)，且将第181位的亮氨酸(l)取代为谷氨酰胺(q)，且将第126位的谷氨酰胺(q)取代为亮氨酸(l)，且将第143位的亮氨酸(l)取代为甲硫氨酸(m)。
[0028]
本发明的第二方面，提供一种核酸分子，其编码本发明所述的转氨酶突变体。
[0029]
本发明的第三方面，提供一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。
[0030]
进一步，所述载体可选自下组中的一种：质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或逆转录病毒。
[0031]
在一些实施方式中，所述质粒可选自pet28如pet28a(+)、pet32、pqe-30、pgex-4t-2、pbr322或puc18等。
[0032]
本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其表达本发明所述的转氨酶突变体，和/或含有本发明所述的核酸分子，和/或含有本发明所述的载体。
[0033]
进一步，所述宿主细胞为原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
[0034]
在一些实施方式中，所述宿主细胞可选自大肠杆菌(escherichia coli)、枯草杆菌(bacillus subtilis)、肺炎双球菌(diplococcus pneumoniae)等。
[0035]
在一些实施方式中，所述大肠杆菌可选自大肠杆菌dh5α菌株、大肠杆菌bl21(de3)菌株、大肠杆菌jm109菌株、大肠杆菌top10菌株、大肠杆菌hb101菌株等。
[0036]
进一步，所述宿主细胞为转氨酶突变体工程菌，所述工程菌为含有本发明所述的载体的e.coli bl21(de3)；优选地，所述载体为含有本发明所述核酸分子的质粒pet28a(+)。
[0037]
本发明的第五方面，提供一种本发明所述的转氨酶突变体的制备方法，包括以下步骤：使本发明第四方面所述的宿主细胞表达本发明所述的转氨酶突变体，和分离纯化得
到所述转氨酶突变体。
[0038]
本发明的第六方面，提供本发明所述的转氨酶突变体，和/或本发明所述的核酸分子，和/或本发明所述的载体，和/或本发明所述的宿主细胞在催化酮类化合物发生不对称转氨反应生成手性胺中的应用。
[0039]
在一些实施方式中，所述酮类化合物为(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-2-甲基-4戊酮酸，所述手性胺为(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸。
[0040]
本发明的第七方面，提供沙库巴曲中间体的制备方法，其包括使底物(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-2-甲基-4戊酮酸在所述转氨酶突变体的催化作用下，生成(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸。
[0041]
进一步，所述催化的反应条件包括：碱性条件例如ph为8.5-9.5，反应温度为35-45℃。
[0042]
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
[0043]
(1)本发明以来源于烟曲霉菌aspergillus fumigatus af293的转氨酶为基础，筛选得到4个正突变氨基酸位点：提供了一种转氨酶突变体，第113位的甲硫氨酸取代为缬氨酸、第181位的亮氨酸取代为谷氨酰胺、第126位的谷氨酰胺取代为亮氨酸、第143位的亮氨酸取代为甲硫氨酸。本发明提供具有上述四组之一或任意两种组合的氨基酸突变的转氨酶突变体，其催化活性较野生型转氨酶有显著提高，可达野生型的25倍。
[0044]
(2)本发明提供的转氨酶突变体可用于沙库巴曲中间体(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸的制备，相较于化学合成法，具有操作简单、反应条件温和、产品收率高、纯度高、生产成本低等优点，为lcz696的合成工艺提供了一个更新颖、绿色、环保的方向，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
[0045]
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
[0046]
图1：突变改造前的转氨酶催化生成(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸高效液相色谱图；
[0047]
图2：本发明提供的转氨酶突变体催化生成(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸高效液相色谱图；
[0048]
图3：在放大反应中，本发明提供的转氨酶突变体催化生成(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸高效液相色谱图。
具体实施方式
[0049]
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0050]
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常
理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0051]
本文中，氨基酸“取代”指将多肽中一个氨基酸用另一种氨基酸替换。
[0052]
本文中，氨基酸的取代由第一个字母后跟数字后跟第二个字母来表示。第一个字母表示被取代的氨基酸；数字是指其中被取代的氨基酸的位置，其编号方式为以seq id no：1的n末端第一个氨基酸为第一位，依次向c末端方向进行编号；第二个字母表示用于替代第一个字母所示氨基酸的氨基酸。
[0053]
如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(yac)，细菌人工染色体(bac)或p1衍生人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如sv40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报告基因。另外，载体可以包含复制起点。
[0054]
本文中，“宿主细胞”指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的融合蛋白的任意类型的细胞系统。宿主细胞包括哺乳动物培养细胞如cho细胞、bhk细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、yo骨髓瘤细胞、p3x63小鼠骨髓瘤细胞、per细胞、per.c6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、细菌细胞如大肠杆菌，昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
[0055]
本文中，“工程菌”或“基因工程菌”是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株。所述的菌类细胞株可称为受体菌。在一些实施例中，所述受体菌可以是大肠杆菌e.coli bl21(de3)，所述外源基因是表达本发明所述的转氨酶突变体的基因。制备工程菌的方法在本领域技术人员的技术范围内，在一些实施例中，所述工程菌的制备方法包括将本发明提供的转氨酶突变体的基因克隆至质粒pet28a(+)中，再将其转入e.coli bl21(de3)中，以获得所述转氨酶突变体工程菌。
[0056]
本文中，“沙库巴曲”是一种前体药物，其化学名称为4-((2s,4r)-1-([1,1
’‑
联苯]-4-基)-5-乙氧基-4-甲基-5-氧代戊烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸。lcz696是由诺华公司开发的一种新型降压药物，用于治疗nyhaii-iv级心衰患者，该药物包含缬沙坦和沙库巴曲两种组分，是两者的共晶物，其中缬沙坦可改善血管舒张，刺激身体排泄钠和水，沙库巴曲可阻断威胁降低血压的两种多肽作用。在本发明的一些实施方式中，通过本发明提供的转氨酶突变体的催化作用，将底物(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-2-甲基-4戊酮酸催化生成沙库巴曲中间体(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸。
[0057]
本文中，使用天然氨基酸的常规单字母或三字母代码：
[0058][0059]
在本发明的一些实施例中，提供一种转氨酶突变体，其包含以下氨基酸序列：在seq id no：1的基础上具有下组之一或任意两种以上的组合的氨基酸取代：将第113位的m取代为v、将第181位的l取代为q、将第126位的q取代为l、将第143位的l取代为m。
[0060]
在本发明的一些实施例中，提供一种转氨酶突变体，其包含以下氨基酸序列：在seq id no：1的基础上具有下组之一的氨基酸取代：m113v、l181q、q126l、l143m、m113v+q126l、m113v+l143m、q126l+l143m、l143m+l181q、m113v+q126l+l143m、m113v+q126l+l181q、m113v+l143m+l181q、q126l+l143m+l181q、或m113v+q126l+l181q+l143m。
[0061]
本发明提供的转氨酶突变体具有催化酮类化合物发生不对称转氨反应生成手性胺的活性，包括例如可有效催化底物(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-2-甲基-4戊酮酸生成沙库巴曲中间体(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸，该催化反应的反应式为：
[0062][0063]
实施例1转氨酶的定向突变改造
[0064]
(一)用于定向突变改造的质粒的构建
[0065]
通过人工合成的方法提供用于改造的初始转氨酶的基因，核苷酸序列为seq id no：2)，该转氨酶改造自aspergillus fumigatus af293(烟曲霉菌)支链氨基酸转移酶(ncbi seq id:xm_743728.1)，二者相似度为96.28％。通过双酶切(ndei/xhoi)连接的方法，将所述用于改造的初始转氨酶基因构建到pet28a(+)表达载体中，获得初始转氨酶的重组表达质粒。
[0066]
将所述初始转氨酶的重组表达质粒转化到e.coli bl21感受态细胞中，在含有卡那霉素(50μg/ml)的lb固体培养基(蛋白脉l0g/l，酵母膏5g/l，氯化钠l0g/l和琼脂15g/l)上进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌株，待质粒扩增后提取质粒，经测序验证正确后，获得
表达所述用于改造的初始转氨酶的阳性重组大肠杆菌，使该菌株的编号为1#，并将其用于以下步骤中的定向突变改造。
[0067]
(二)定向突变改造
[0068]
以1#菌株为模板，通过pcr扩增的方法进行定向突变改造，所用引物见表1所示，pcr反应体系如表2所示。
[0069]
表1定向突变改造引物
[0070]
引物名引物序列seq id no：m113v-f1ccgggatgcggtggtgaaggttatcgtgac29m113v-r1taaccttcaccaccgcatcccggataccac30q126l-f1gacaggtgtattgggttcgaagcctgagga31q126l-r1gcttcgaacccaatacacctgtcagaccac32l143m-fctgcttgttatgccatacatttggttgatg33l143m-raatgtatggcataacaagcaggtatatgtt34l181q-fatcaaaaatcagcagtggggtgatttaatt35l181q-raccccactgctgatttttgatagtaggatc36
[0071]
表2定向突变pcr反应体系
[0072]
组分体积sapphireamp fast pcr master mix25μlprimer forward1μlprimer reverse1μl模板(50-100ng)3μlddh2oup to 50μl
[0073]
pcr程序条件设定为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min30s，34个循环，72℃终延伸5min。
[0074]
将pcr产物进行l％琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用dna凝胶电泳回收试剂盒对扩增获得的pcr产物进行回收纯化，得到纯化后的pcr产物。对纯化后的pcr产物使用dpni进行模板消化后，取2μl加到100μl的e.coli bl 21感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，42℃水浴锅热击90s，冰浴2min，加入800μl lb液体培养基，于37℃，220rpm孵育1h，随后4000rpm离心，弃去800μl上清，重悬菌体均匀涂布于lb固体平板(含卡那霉素50ug/ml)过夜培养，然后取单菌落扩培后进行测序验证，验证正确的转化子即为表达转氨酶突变体的基因工程菌；制备得到的各基因工程菌株的编号及其表达的转氨酶的氨基酸序列见表3所示。
[0075]
表3转氨酶氨基酸序列
[0076]
[0077][0078]
实施例2转氨酶的表达
[0079]
本实施例对实施例1中的初始转氨酶及各转氨酶突变体进行蛋白表达，包括以下步骤：将实施例1制备得到的编号为1#～16#的菌株分别接种至lb液体培养基中(含卡那霉素，终浓度为50μg/ml)，37℃振荡培养过夜；然后按2％(v/v)的接种量接入装有50ml lb液体培养基(含卡那霉素，终浓度为50μg/ml)的250ml三角烧瓶中，置于37℃，220rpm摇床震荡培养；当培养液的od
600
达到0.8时，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg进行诱导表达；于25℃诱导表达18h后，将培养液离心，收集湿菌体并于-20℃破碎细胞，即得到转氨酶样品(对于每种转氨酶，均制备多个平行的转氨酶样品)。
[0080]
实施例3酶催化反应
[0081]
取实施例2制备得到的各转氨酶样品(对于每种转氨酶，均取两个平行的转氨酶样品)，分别加入底物溶液(取1.2mg(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-2-甲基-4戊酮酸于0.25ml pbs缓冲液中，加入0.75ml i-prnh2hcl和1mg plp，调节ph至9.0，即制得底物溶液)，调节ph至9.0，40℃反应过夜，得到反应溶液。将所述反应溶液取样100μl，加入100μl乙腈超声2min后离心，取上清液过滤后进行hplc检测。底物(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-2-甲基-4戊酮酸经催化生成产物(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-4-氨基-2-甲基戊酸。
[0082]
在图1中示出了初始转氨酶催化得到的反应溶液的hplc图谱；在图2中示出了氨基酸序列为seq id no：25的转氨酶突变体(突变位点为m113v、q126l、l181q)催化得到的反应溶液的hplc图谱。
[0083]
根据hplc检测结果，计算每种转氨酶催化底物(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-2-甲基-4戊酮酸的转化率(对于每种转氨酶，取其两个平行的转氨酶样品的转化率的平均值)，转化率计算结果见表4所示。
[0084]
表4转氨酶的催化转化率
[0085]
编号突变位点转化率1# 1.11％2#l143m1.81％3#q126l2.01％
4#m113v15.02％5#l181q3.84％6#m113v、q126l24.91％7#m113v、l143m24.15％8#q126l、l143m4.51％9#l143m、l181q9.02％10#m113v、q126l、l143m13.04％11#m113v、q126l、l181q29.63％12#m113v、l143m、l181q15.28％13#q126l、l143m、l181q7.91％14#m113v、q126l、l181q、l143m11.12％
[0086]
根据表4，在对初始转氨酶进行l143m、q126l、m113v或l181q的单点突变后，其酶活得到了显著提高；并且，通过将上述四种突变进行叠加组合，均获得了显著优于初始转氨酶的催化效果。
[0087]
实施例4酶催化放大反应
[0088]
取实施例2制备得到的编号为11#的转氨酶样品，加入放大的底物溶液(取10g(2r,4s)-5-([1,1
′‑
联苯]-4-基)-2-甲基-4戊酮酸于25ml pbs缓冲液中，加入i-prnh2hcl(4m,75ml)和plp(50mg)，调节ph至9.0，即制得放大的底物溶液)，调节ph至9.0于40℃进行反应；当反应过夜后，取样100μl，加入100μl乙腈超声2min后离心，取上清液过滤后进行hplc检测，检测图谱见图3所示；至底物残留＜5％时，停止反应，使反应温度降至室温，得到反应产物溶液。向所述反应产物溶液加入2-甲基四氢呋喃(50ml)，搅拌，加入浓盐酸，调节ph值至2.0，加入氯化钠至饱和至出现分层，收集有机相，将水相再次用2-甲基四氢呋喃(50ml)萃取3次，合并有机相；向合并后的有机相加入饱和氯化钠溶液(50ml)洗涤，经有机相减压除去溶剂得白色固体(10.77g，收率95.2％，dr＞99:1)
[0089]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。