一种聚乙二醇干扰素α代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法与流程

一种聚乙二醇干扰素
α
代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种聚乙二醇干扰素α代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法，属于基因检测领域。


背景技术：

2.il28b位于第19号染色体上，其编码产物为干扰素
‑
λ3(ifnl3)，是iii型干扰素家族成员之一，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性。il28b基因上存在snp位点(rs12979860、rs8099917和rs12980275)可影响基因的表达，继而影响疾病易感性及药物疗效。il28b属于ifnxs家族,ifnxs主要通过jak
‑
stat信号途径，诱导stati和stat2的磷酸化，促进黏病毒抗性蛋白a(myxovirus resistance protein a，mxa)和2'，5'
‑
寡腺苷酸合成酶基因家族的表达，从而发挥抗病毒效应两。已有研究证实，ifnλ3可以有效抑制hbv、hcv的复制，这预示着il28b可能参与了机体与hcv相关的免疫反应。有证据表明ifnx3能够调机体内许多固有细胞的防御功能来抵御病毒感染，该调节作用可能是通过上调ifn诱导基因的表达而实现研究发现，il28b基因多态性可以调整肝细胞内干扰素刺激基因(interferon signaling genes,isg)的表达，而isg的瞬时或稳定表达均能有效抑制hcv复制，减少hcv扩增，对hcv的治疗具有明显辅助作用。
3.丙型肝炎病毒(感染通常采用聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林进行治疗，但其疗效存在很大的个体差异，部分患者治疗后出现持续病毒反应，部分患者治疗无效，未能获得持续病毒清除。il28b的snps是影响抗hcv疗效的重要因素。研究发现，在il28b基因型中，rs12979860 cc基因型，或rs12980275 aa基因型，或rs8999917 tt基因型感染慢性丙型肝炎患者对长效干扰素及利巴韦林治疗的疗效较好，而rs12979860 ct基因型或tt基因型，或rs12980275 ga基因型或gg基因型，或rs8099917 gt基因型或gg基因型患者的疗效较差。il28b基因多态性影响聚乙二醇干扰素(peg
‑
ifn)联合利巴韦林治疗hcv(丙型肝炎病毒)感染的疗效。美国肝脏病学会和欧洲肝脏病学会2011年hcv感染防治指南已将ifnl3基因多态性作为基线预测聚乙二醇化干扰素反应性的主要因素之一。美国fda已批准在聚乙二醇干扰素α
‑
2a、聚乙二醇干扰素α
‑
2b和利巴韦林说明书中增加在用药前对ifnl3rs12979860基因型进行检测的建议。中国丙型肝炎防治指南(2015年更新版)接受ifn联合rbv治疗过程中患者的治疗前监测治疗前应检测肝肾功能、血常规、甲状腺功能、自身抗体、血糖、尿常规、睡眠，可检测il
‑
28b基因分型。检测il
‑
28b基因型有助于hcv感染的个体化治疗，从而提高其治疗水平。
4.目前，基因多态性检测的方法有很多种，主要采用荧光pcr。主要包括高分辨率熔解曲线法、taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法。高分辨率熔解曲线法步骤简单，但特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用arms引物进行特异扩增操作方法简单，但检测条件要求严格，实际操作中容易出现引物错配而产生假阳。taqman荧光探针法试验成本较高。目前对血液dna的获得方式主要有传统的柱式提取、磁珠法提
取，此两种方法均耗时较久，操作较为繁琐。cn201610022581.8提出了一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量pcr方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到pcr扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述pcr扩增管中加入配制好的pcr反应液，对目标核酸进行实时荧光定量pcr反应。该发明也同样需要对磁珠进行洗涤。因此，简化检测步骤，提高检测效率的基因多态检测试剂盒是十分有必要的。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种聚乙二醇干扰素α代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法。
6.为实现上述发明目的，本发明聚乙二醇干扰素α代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：
7.所述聚乙二醇干扰素α疗效预测的基因多态性检测试剂盒针对ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222测序引物、阳性对照。
8.具体的，所述特异性引物序列如下表所示：
[0009][0010][0011]
优选的，所述ifnl3(rs12979860)的特异性引物组序列如序列表seq id no:1～seq id no:2所示；所述ifnl3(rs8099917)的特异性引物组序列如序列表seq id no:3～
seq id no:4所示；所述ifnl3(rs11881222)的特异性引物组序列如序列表seq id no:5～seq id no:6所示。
[0012]
优选的，所述的ifnl3(rs12979860)测序引物、ifnl3(rs8099917)测序引物、ifnl3(rs11881222)测序引物分别如序列表seq id no:7～seq id no:9所示。
[0013]
更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与dna结合较dna/dna的结合更为稳定。
[0014]
优选的，ifnl3(rs12979860)测序引物对应的测序区域为ifnl3(rs12979860)待检序列，如序列表seq id no:10所示；ifnl3(rs8099917)测序引物对应的测序区域为ifnl3(rs8099917)待检序列，如序列表seq id no:11所示；ifnl3(rs11881222)测序引物对应的测序区域为ifnl3(rs11881222)待检序列，如序列表seq id no:12所示。
[0015]
优选的，ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222共用一个分配指令如序列表seq id no:13所示。seq id no:13中“ddc”表示ifnl3(rs12979860)测序反应最后一个加入碱基ddctp，该碱基的加入可终止该测序反应。seq id no:13中“dda”表示ifnl3(rs8099917)测序反应最后一个加入碱基ddatp，该碱基的加入可终止该测序反应，seq id no:13中
“‑”
表示暂停试剂加入3min。该暂停期间会加入后续测序引物。
[0016]
优选的，所述样本处理液，不包含胍盐，通过碱性条件和表面活性剂对样本进行裂解。包括0.1％
‑
0.6％十二烷基硫酸锂、0.1
‑
0.5％曲拉通x
‑
100、2
‑
50mg/ml氢氧化钠、5
‑
15％海藻糖、3～7mmol/l bsa、20
‑
80mm tris
‑
hcl、100mm nacl，ph＝8.5
‑
9.5。本发明采用样本处理液快速样本释放出dna，样本量为30ul全血，相比一步裂解法和直接扩增(约2
‑
10ul)，可以得到足量的基因组dna吸附在磁珠上供后续分析。通过将样本和裂解混合液移除可以去除大部分抑制物。
[0017]
更优选的，所述样本处理液，包括0.3％
‑
0.5％十二烷基硫酸锂、0.2
‑
0.4％曲拉通x
‑
100、10
‑
20mg/ml氢氧化钠、8
‑
12mm甜菜碱、8
‑
12％海藻糖、4～6mm bsa、50mm tris
‑
hcl、100mm nacl，ph＝9。
[0018]
优选的，所述的磁珠为羧基磁珠，粒径为600mm，悬浮性较好，磁性能较强，吸附量大。反应液中磁珠浓度为0.2mg/25μl，血液样本中dna吸附量为30ng～260ng，完全满足扩增所需的dna量。
[0019]
优选的，所述的扩增试剂1包括：扩增缓冲液，15mm醋酸镁；
[0020]
优选的，所述的扩增试剂2包括：ifnl3(rs12979860)前引物(0.32um)、ifnl3(rs12979860)后引物(0.32um)，ifnl3(rs8099917)前引物(0.32um)、ifnl3(rs8099917)后引物(0.32um)，ifnl3(rs11881222)前引物(0.32um)、ifnl3(rs11881222)后引物(0.32um)，dntps(0.3mm)、链置换dna聚合酶(1.2ng/μl)，单链dna结合蛋白(3.2ng/μl)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μl)。
[0021]
更优选的，所述的扩增试剂2包括：海藻糖(0.2％)，10mm醋酸锰、0.1m山梨糖醇、5ug/ml bsa。海藻糖对生物活性物质具有非特异性保护作用，能提高dna聚合酶热稳定性、降低dna模板解链温度，减少g
‑
c丰富区由于自身互补配对所形成的二级结构，因此提高pcr反应的特异性。山梨糖醇和醋酸锰具有pcr预混液稳定效应，同时在冷冻干燥过程中具有稳定作用。牛血清白蛋白能提高pcr反应的扩增效率并减少体系中pcr抑制物对反应的影响。
[0022]
优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：42℃30min。
[0023]
优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222杂合型基因组dna。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
[0024]
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的聚乙二醇干扰素α疗效预测的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0025]
a.样本处理液100ul、4ul磁珠和30uledta抗凝全血样本混合，室温静置5min；
[0026]
b.将所述pcr扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
[0027]
c.将配制好的pcr反应液加入到步骤b)得到的pcr扩增管中，使磁珠与所述pcr反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
[0028]
d.结合液(含微珠)与扩增产物进行结合；
[0029]
e.变性液处理得到单链产物；
[0030]
f.加入洗涤缓冲液漂洗；
[0031]
g.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
[0032]
h.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入datp、dttp、dgtp、dctp、ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222测序引物、ddctp、ddatp；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
[0033]
i.焦磷酸测序。
[0034]
本发明还公开了聚乙二醇干扰素α疗效预测的基因多态性检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒对ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222进行检测，以从基因层面反应聚乙二醇干扰素α疗效，进一步为指导聚乙二醇干扰素α剂量给出基因层面的建议。
[0035]
与现有技术相比，本发明的目的是以恒温pcr和焦磷酸检测为基础，获得聚乙二醇干扰素α疗效预测的基因多态性检测试剂盒及其应用，本发明建立了一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测irs
‑
1基因多态性的焦磷酸测序方法。本发明的快速扩增方法主要从三方面进行了优化，一方面采用提取扩增同管的方式，免去提取多次移管、核酸丢失风险；另一方面通过加入抗抑制剂进行快速恒温扩增；第三方面同时一次反应进行三个位点的焦磷酸测序。该测序首先加ifnl3(rs12979860)测序引物与测序原料进行焦磷酸测序，最后一个碱基加入ddctp终止该测序反应。再加入ifnl3(rs8099917)测序引物和进行测序，最后一个碱基加入ddatp终止该测序反应。最后加入ifnl3(rs11881222)测序引物进行dntp测序，一次处理先后进行三个位点的测序，减少了操作的时间和提高了测序的通量。dna模板通过恒温pcr扩增ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222基因位点，产生大量的生物素标记的单链dna。生物素标记单链dna与链霉亲和素结合，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，简化了测序流程和时间。本发明以快速dna制备、恒温pcr扩增和焦磷酸测序技术为组合对聚乙二醇干扰素α疗效预测的基因多态性进行检测，为临床个性化用药给出基因角度的建议。
附图说明
[0036]
图1是本发明提供的rs12979860 cc型、rs11881222 aa型、rs8999917 tt型焦磷酸
检测结果示例图；
[0037]
图2是本发明提供的rs12979860 ct型、rs11881222 ag型、rs8999917 tg型焦磷酸检测结果示例图；
[0038]
图3是本发明提供的rs12979860 tt型、rs11881222 aa型、rs8999917 tt型焦磷酸检测结果示例图；
[0039]
图4是本发明提供的rs12979860 cc型、rs11881222 gg型、rs8999917 gg型焦磷酸检测结果示例图。
具体实施方式
[0040]
下面结合实施例对本发明提供的聚乙二醇干扰素α代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0041]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0042]
(一)特异性引物设计
[0043]
本发明的试剂盒针对ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222基因多态性设计了特异性扩增引物和测序引物，用于焦磷酸pcr检测。基因多态性序列以genebank内的公开序列为准，引物序列如下表所示。
[0044][0045][0046]
(二)试剂盒组成
[0047]
检测试剂盒包括如下表2所示的组分：
[0048]
表2试剂盒组分表
[0049]
序号组份标示装量1样本处理液2000μl
×
1管2磁珠80μl
×
1管3扩增试剂1500μl
×
1管4扩增试剂2干粉5ifnl3(rs12979860)测序引物70ul
×
1管6ifnl3(rs8099917)测序引物70ul
×
1管7ifnl3(rs11881222)测序引物70ul
×
1管8阳性对照50μl
×
1管
[0050]
(三)样本处理液配置体系如下：
[0051]
样本处理液，包括0.4％十二烷基硫酸锂、0.3％曲拉通x
‑
100、15mg/ml氢氧化钠、10mm甜菜碱、10％海藻糖、5mm bsa、50mm tris
‑
hcl、100mm nacl，ph＝9。
[0052]
(四)本实施例的检测试剂盒扩增试剂1单人份配置体系如下：
[0053]
成分体积(ul)扩增缓冲液24200mm醋酸镁1
[0054]
(五)本实施例的检测试剂盒扩增试剂2单人份配置体系如下：
[0055]
ifnl3(rs12979860)前引物(0.32um)，ifnl3(rs12979860)后引物(0.32um)，ifnl3(rs8099917)前引物(0.32um)，ifnl3(rs8099917)后引物(0.32um)、ifnl3(rs11881222)前引物(0.32um)，ifnl3(rs11881222)后引物(0.32um)、dntps(0.3mm)、链置换dna聚合酶(1.2ng/μl)，单链dna结合蛋白(3.2ng/μl)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μl)，海藻糖(0.2％)，10mm醋酸锰、0.1m山梨糖醇、5ug/ml bsa。pcr体系如表3所示：
[0056]
表3 pcr体系表
[0057]
成分体积(ul)结合单链核酸的重组酶(100ng/μl)1.2单链dna结合蛋白(100ng/μl)0.8链置换dna聚合酶(100ng/μl)0.3dntps(25mm)0.3ifnl3(rs12979860)前引物(20μm)0.4ifnl3(rs12979860)后引物(20μm)0.4ifnl3(rs8099917)前引物(20μm)0.4ifnl3(rs8099917)后引物(20μm)0.4ifnl3(rs11881222)前引物(20μm)0.4ifnl3(rs11881222)后引物(20μm)0.4海藻糖(20％)0.251m醋酸锰0.25
10m山梨糖醇0.255mg/ml bsa0.25
[0058]
配置完成后98ul/管进行分装、冻干。
[0059]
实施例2、试剂盒检测步骤
[0060]
本发明中采用的仪器如下：恒温仪，焦磷酸测序仪(武汉菲思特生物科技有限公司)。
[0061]
1)取30μl edta抗凝全血样品于pcr扩增管中；
[0062]
2)加入100μl样本处理液和4ul磁珠，静置5min；
[0063]
3)将所述pcr扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
[0064]
4)将扩增试剂1加入扩增试剂2干粉中，充分溶解混匀；
[0065]
5)将配制好的pcr反应液加入25ul到步骤4)得到的pcr扩增管中，使磁珠与所述pcr反应液充分混匀，离心，进行恒温反应。
[0066]
6)采用pcr仪进行扩增，反应体系为25μl，扩增条件：
[0067][0068][0069]
7)在pcr反应管中加入结合液40μl和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入pcr产物20μl，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和pcr产物充分结合；
[0070]
8)7,000
×
g离心1min，弃上清；
[0071]
9)加入22ul稀释后的变性液工作液，静置5min，7,000
×
g离心1min，ep管收集得到单链产物；
[0072]
10)向ep管中加入150ul洗涤缓冲液，7,000
×
g离心1min(重复3次)；
[0073]
11)将ep管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入3ul测序酶和3ul测序底物；
[0074]
12)测序管中分别加入3ul测序酶和3ul测序底物；
[0075]
13)取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入datp、dttp、dgtp、dctp、、ifnl3(rs12979860)测序引物、ifnl3(rs8099917)测序引物、ifnl3(rs11881222)测序引物、ddctp、ddatp。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
[0076]
14)焦磷酸测序，本实施例的测序结果如图1～4所示。
[0077]
15)结果判读
[0078]
1)有效性判定：
[0079]
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222杂合突变型。
[0080]
2)结果判定标准
[0081]
ifnl3(rs12979860)的dna测序峰值图中，
[0082]
c的频率≧90％，t的频率≦10％，即为cc型；
[0083]
40％≦c的频率≦60％，40％≦t的频率≦60％，即为ct型；
[0084]
t的频率≧90％，c的频率≦10％，即为tt型；
[0085]
ifnl3(rs8099917)的dna测序峰值图中，
[0086]
t的频率≧90％，g的频率≦10％，即为tt型；
[0087]
40％≦t的频率≦60％，40％≦g的频率≦60％，即为tg型；
[0088]
g的频率≧90％，t的频率≦10％，即为gg型；
[0089]
ifnl3(rs11881222)的dna测序峰值图中，
[0090]
a的频率≧90％，g的频率≦10％，即为aa型；
[0091]
40％≦a的频率≦60％，40％≦g的频率≦60％，即为ag型；
[0092]
g的频率≧90％，a的频率≦10％，即为gg型；
[0093]
16)基因检测结果与聚乙二醇干扰素α疗效预测相关性表
[0094][0095]
五、试剂盒的性能测试结果
[0096]
5.1.特异性
[0097]
对特异性样本(包括非人类dna模板和人类同一基因不同位点或同源性位点扩增产物稀释物)进行检测，结果为阴性。
[0098]
5.2.准确性
[0099]
对试剂盒范围内的不同基因型的参考品(包括ifnl3 rs12979860、rs8099917、rs11881222野生、杂合、突变三种基因型)进行检测，应均能检出相应基因型。
[0100]
5.3.最低检出限
[0101]
最低检出限应不高于2ng/ul。
[0102]
5.4.重复性
[0103]
检测试剂盒范围内的不同基因型的重复性参考品，每个参考品进行10次检测，结果应均为相应突变类型，且相应检测通道的ct值的变异系数(cv)应≤5.0％。
[0104]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]