一种用于缺氧肿瘤多模态治疗的七甲川花菁小分子和制备方法及应用与流程

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种用于缺氧肿瘤多模态治疗的七甲川花菁小分子和制备方法及应用。


背景技术：

2.放射治疗(rt)是恶性肿瘤治疗中最常用的方法之一，大约70％的癌症患者在治疗癌症的过程中需要用rt。但由于缺氧肿瘤微环境、dna损伤修复机制、以及固有放疗耐受性等原因，导致临床上约40％的rt疗效降低或失败，从而为肿瘤的治疗带来障碍。因此，常需要与放疗增敏剂或其他疗法联合运用以提高治疗效果。
3.近年来，因其较强的组织穿透力、选择性、安全性以及治疗效果，光疗逐渐的成为肿瘤诊疗的一种重要手段，尤其是纳米载体介导的光热(ptt)和光动力治疗(pdt)在肿瘤领域已取得了很大进展。近红外激光(nir)诱导的ptt尤其吸引研究人员的注意，其利用近红外光吸收材料将激光能量快速转换成热能，实现局部高温来消融癌细胞，具有微创和治疗效率高等优点。临床前和临床研究表明靶向热疗能够增加肿瘤内的血流灌注，包括血管通透性增强、乏氧改善、组织间液压降低、生理ph值恢复正常等。而对于pdt来说，在特定的光照射下，光敏剂可以产生大量的活性氧自由基(ros)从而可以杀死肿瘤细胞。鉴于此，目前大量研究旨在探索通过联合ptt或pdt提高rt疗效的可能性。
4.大量研究已经证实，在ptt或pdt协同下，可明显提高肿瘤的rt疗效。这是因为,光动力诱导过量ros生成，协同射线致dna不可修复的损伤，显著增强放疗作用；光热致肿瘤局部高温，诱导细胞溶胀、凋亡以及坏死，同时也能通过增强血流灌注，改善肿瘤乏氧微环境，从而协同增敏肿瘤的放射治疗。为了进一步提高治疗效果，最近个别研究报道了能够同时结合ptt、pdt、rt三种治疗方式的多功能纳米材料。然而，为了实现上述三模态同步治疗，所述的多功能化纳米材料，具有结构复杂,制备过程繁琐且产率低、成本高、质量难控等缺点。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于缺氧肿瘤多模态治疗的七甲川花菁小分子和制备方法及应用，所述小分子同时实现ptt、pdt、rt的三模态结合治疗缺氧肿瘤，大大提高其临床肿瘤治疗效果，其转化应用前景好。可同步实现放疗/光热/光动力多模态协同治疗。
6.本发明的技术方案是：
7.由线粒体靶向的吲哚七甲川链、丁磺酸盐侧链和2
‑
硝基咪唑化的n
‑
烷基侧链构成的七甲川花菁小分子，其结构式如下：
[0008][0009]
上述的七甲川花菁小分子的合成方法，有以下步骤：
[0010][0011]
1)在氮气保护下，2,3,3
‑
三甲基3h吲哚和1,4
‑
丁磺酸内酯120℃加热回流反应16h，反应所得固体溶解于异丙醇，用丙酮清洗后得到丁磺酸吲哚季铵盐(1a)；
[0012]
2)无水乙醇为反应溶剂，70℃下，乙酸钠做催化剂，丁磺酸吲哚季铵盐与双醛缩合剂反应1.5h，减压浓缩，残留物经柱层析分离得到半缩合化合物(2a)；
[0013]
3)k2co3做催化剂，2
‑
硝基咪唑与1,6
‑
二溴己烷60℃下反应3h，减压抽滤除去不溶物，滤液减压浓缩，残留物经柱层析分离得到2
‑
硝基咪唑基团的溴化物(3a)；
[0014]
4)乙腈为溶剂，将步骤3)所得溴化物(3a)与2,3,3
‑
三甲基3h吲哚反应，减压浓缩，残留物经柱层析分离得到化合物(4a)；
[0015]
5)甲苯
‑
正丁醇做溶剂，将步骤2)所得化合物(2a)和步骤4)所得化合物(4a)氮气保护下120℃加热回流，反应16h，减压浓缩，残留物经柱层析分离得到七甲川花菁小分子(ir
‑
83)。
[0016]
步骤2)中所述丁磺酸吲哚季铵盐与双醛缩合剂的摩尔比为1:1.5
‑
1:2。
[0017]
步骤3)所述2
‑
硝基咪唑与1,6
‑
二溴己烷的摩尔比为1:2
‑
1:3。
[0018]
上述的七甲川花菁小分子在制备近红外成像引导下的光热和光动力联合放疗治疗肿瘤制剂中的应用。
[0019]
所述近红外成像为650
‑
900nm的单光源激光照射成像。
[0020]
所述肿瘤为缺氧肿瘤。
[0021]
所述缺氧肿瘤为肺癌。
[0022]
本发明所述七甲川花菁小分子具有线粒体的靶向特性，以及具有近红外成像以及肿瘤靶向蓄积特性，可区分肿瘤以及边界，对肿瘤的精确定位，在红外光诱导下具良好的光动力效应、光热效应以及放疗增敏效应，可显著抑制肿瘤的生长。
[0023]
所述七甲川花菁小分子在近红外荧光成像引导和650
‑
900nm的单光源激光照射
下，并实施光热和光动力联合放疗的肿瘤精准治疗，可望用于近红外成像指导下的肿瘤精准光疗和放疗。
[0024]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0025]
1、本发明所述的吲哚七甲川花菁小分子在近红外区有较强的吸收，具有较高的光热转换效率，较高的自由基生成率，治疗效果好，副反应小等优点。
[0026]
2、本发明所述的七甲川花菁小分子结构单一、制备工艺简单、成本低、效果明显、适用范围广。
[0027]
3、本发明所述的七甲川花菁小分子兼具近红外成像和放疗/光热/光动力多模态协同治疗功能，在肿瘤的精准靶向治疗方面有着重要的应用前景。
[0028]
申请人实验表明，所述的七甲川花菁小分子具有较好的肿瘤蓄积特性，ir
‑
83进入细胞后，主要定位于细胞线粒体内，在近红外激光照射后具有较优异的光动力效应，ir
‑
83的光热和光动力效应可提高放疗效率，r
‑
83介导的放疗/pdt/ptt联合疗法可明显的抑制肿瘤生长。
附图说明
[0029]
图1为ir
‑
83的荧光光谱(a)和紫外可见近红外吸收光谱(b)；
[0030]
图2为ir
‑
83(0.25mg kg
‑1)经尾静脉注射24h后肿瘤部位近红外成像；
[0031]
图3为24h后离体器官以及肿瘤部位近红外成像；
[0032]
图4为llc细胞在21％o2和5％o2培养条件下ir
‑
83摄入情况；
[0033]
图5为ir
‑
83线粒体靶向定位荧光图；
[0034]
图6为不同浓度ir
‑
83在近红外激光照射后对llc细胞的杀伤作用；
[0035]
图7为ir
‑
83的光动力效应；
[0036]
图8为ir
‑
83体外的光热效应；
[0037]
图9为ir
‑
83活体的光热效应；
[0038]
图10为ir
‑
83介导的光热光动力联合放疗对llc细胞克隆形成能力的影响；
[0039]
图11为ir
‑
83介导的光热光动力联合放疗对llc细胞dna损伤的影响；
[0040]
图12为ir
‑
83介导的光热光动力联合放疗对肿瘤生长的影响。
具体实施方式
[0041]
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0042]
实施例中所采用的试剂与仪器
[0043]
1.试剂
[0044]
除了试剂二氯甲烷、甲醇、dmf、乙腈、甲苯需经过蒸馏纯化与干燥处理以外，其他所涉及的化学试剂和溶剂购买于sigma
‑
aldrich或阿拉丁等试剂公司并直接使用。
[0045]
所有反应均处于氮气及避光保护条件下进行，且硅胶薄层层析监测至反应结束。
[0046]
所有化合物1h nmr和
13
c nmr由美国agilent公司生产的600mhz核磁共振谱仪测定，tms作内标，用cdcl3和cd3od作溶剂，δ值单位为ppm。
[0047]
2.仪器
[0048]
硅胶薄层层析使用百灵威科技所生产的高效薄层层析硅胶板(型号gf
‑
254)，采用254nm荧光或日光下肉眼直接进行检测。
[0049]
柱层析用于染料分子的最终纯化，采用百灵威科技所生产的层析硅胶(200
‑
300目)。
[0050]
层析用有机溶剂均为分析纯，且经过重蒸干燥处理。
[0051]
质谱由德国bruker ultraflextreme maldi
‑
tof质谱仪测定；
[0052]
紫外吸收光谱由日本shimadzu公司紫外可见近红外分光光度计uv
‑
3600采集；
[0053]
荧光光谱由美国thermo fisher荧光光谱仪测定；
[0054]
光热效应的温度和热成像图由美国fluke近红外热成像仪(ti32)采集；
[0055]
近红外荧光成像采用peral trilogy小动物活体成像系统采集。
[0056]
实施例1化合物1a的合成
[0057][0058]
取3.98g的2,3,3
‑
三甲基吲哚(25mmol)和3.47g的1,4
‑
丁磺酸内酯(25.2mmol)加入100ml圆底烧瓶，在氮气保护下，110℃加热回流反应16h，直至反应液全部变为固体。将上述反应所得固体溶解于10ml异丙醇，用10ml丙酮清洗3次后得到红色固体5.29g(1a)(yield:72％),产物不需要进一步纯化即可进行下一步反应。
[0059]
1a(72％)：1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.85(d,j＝8.4hz,1h),7.54
–
7.50(m,1h),7.47(d,j＝4.2hz,2h),4.73(t,j＝7.2hz,2h),2.88(t,j＝6.6hz,2h),2.12
–
2.08(m,2h),2.01
–
1.96(m,2h),1.54(s,6h)ppm。
[0060]
实施例2化合物2a的合成
[0061][0062]
取558mg(1.89mmol)1a，379.7mg双醛缩合剂，180.5mg乙酸钠(2.2mmol)加入25ml圆底烧瓶，完全溶解于5ml无水乙醇，得到混合液。将混合液在在氮气保护下，70℃加热反应1.5h。将反应液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝30:1)纯化后得到406mg红色固体(2a)(yield：48％)。由于该化合物不稳定，不需要进一步纯化即可进行下一步反应。
[0063]
实施例3化合物3a的合成
[0064][0065]
向50ml的反应瓶中加入565mg 2
‑
硝基咪唑(5mmol)及1.38g碳酸钾固体(10mmol)，氮气保护下加入15ml的无水dmf并搅拌溶解，随后加入2.44g1,6
‑
二溴己烷(10mmol)，完毕后于60℃下加热反应3h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，将残留物柱分离纯化(正己烷:乙酸乙酯＝3:1)得化合物928mg的3a(yield：67％)。
[0066]
3a(67％):1h nmr(600mhz,cd3od)δ7.50(d,j＝1.2hz,1h),7.14(d,j＝1.2hz,1h),4.46(t,j＝7.2hz,2h),3.44(t,j＝6.6hz,2h),1.90
–
1.83(m,4h),1.54
–
1.48(m,2h),1.42
–
1.37(m,2h)ppm。
[0067]
实施例4化合物4a的合成
[0068][0069]
取25ml的反应瓶，加入化合物620mg 3a(2.25mmol)和394mg 2,3,3
‑
三甲基吲哚(2.48mmol)。在氮气保护下加入10ml乙腈溶解，于110℃下加热回流反应16h。反应结束后，冷却至室温，直接减压浓缩除去溶剂。经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝35:1)纯化后得到326mg棕黑色固体(4a)(yield:41％)。
[0070]
4a(41％):1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.13
–
7.04(m,3h),7.04(s,1h),6.75(t,j＝7.8hz,1h),6.50(d,j＝7.8hz,1h),4.38(t,j＝7.8hz,2h),3.83(d,j＝6.6hz,2h),3.48(t,j＝7.2hz,2h),1.87
–
1.82(m,2h),1.66
–
1.62(m,2h),1.43
–
1.36(m,5h),1.32(s,6h)ppm。
[0071]
实施例5化合物ir
‑
83的合成
[0072]
取330mg 2a(0.735mmol)和320mg 4a(0.735mmol)溶于5ml甲苯
‑
正丁醇(体积比：3.5:1.5)，在氮气保护下混合液120℃回流加热，反应完成后，冷却至室温，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝30:1)纯化后得到176mg绿色固体(ir
‑
83)(yield:22％)。
[0073][0074]
ir
‑
83(22％):1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.37(d,j＝14.4hz,1h),8.28(d,j＝13.8hz,1h),7.46(d,j＝1.2hz,1h),7.40
–
7.33(m,4h),7.25
–
7.19(m,3h),7.10
–
7.08(m,
2h),6.38(d,j＝14.4hz,1h),6.10(d,j＝13.8hz,1h),4.51(t,j＝7.2hz,2h),4.17(t,j＝7.8hz,2h),4.08(t,j＝7.8hz,2h),2.98(t,j＝6.6hz,2h),2.74(t,j＝6.0hz,2h),2.66(t,j＝6.0hz,2h),2.08
–
2.06(m,4h),1.97
–
1.93(m,2h),1.90
–
1.80(m,4h),1.69(d,j＝3.0hz,12h),1.56
–
1.51(m,2h),1.48
–
1.43(m,2h)ppm；
13
c nmr(151mhz,cdcl3)δ173.18,171.21,150.57,145.59,144.61,143.45,142.30,141.90,141.18,128.99,128.77,128.38,128.06,127.27,127.25,125.67,124.84,122.16,122.14,111.30,110.43,102.36,100.27,53.45,50.22,49.92,49.51,49.01,44.92,44.21,30.28,29.68,28.19,28.08,27.10,26.52,26.45,26.34,26.11,25.88,23.10,20.73ppm；maldi
‑
tof
‑
ms calculated for c
43
h
52
cln5o5s:785.3378,found 785.593。
[0075]
实施例6 ir
‑
83的光学性质
[0076]
称取一定量的ir
‑
83溶于甲醇，配成10mm母液备用，测试时，先用精密移液枪取2μl此溶液于10ml棕色容量瓶中，然后分别用甲醇稀释至刻度，即得到2μm的小分子溶液。最大吸收光谱和发射光谱分别用shimadzu uv
‑
3600紫外近红外分光光度计和varian cary eclipse fluorometer荧光光谱仪测定。如图1所示，测试结果表明，化合物ir
‑
83的最大吸收波长和发射波长分别为740nm和804nm，紫外特征吸收峰为783nm,具有较优良的近红外荧光特性。
[0077]
实施例7 ir
‑
83体内肿瘤靶向性
[0078]
利用小鼠llc细胞(购自美国atcc细胞库)建立了雄性c57小鼠(购自陆军军医大学动物实验中心)皮下荷瘤模型，待肿瘤体积生长为100mm3左右时(n＝3)，经尾静脉给予0.25mg/kg的ir
‑
83,利用近红外小动物活体成像(trilogy，基因有限公司)实时(0
‑
48h)观察小分子在小鼠体内的分布情况,并在24h时处死老鼠，观察ir
‑
83在主要器官(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤、肌肉、小肠)的分布情况。in vitro和ex vivo结果表明ir
‑
83具有较好的肿瘤蓄积特性(图2和图3)。
[0079]
实施例8 ir
‑
83细胞乏氧蓄积性
[0080]
为模拟细胞缺氧微环境，将贴壁于35mm的培养皿中的llc细胞置于厌氧培养箱(5％o2,95％n2)中过夜，而正常氧细胞于37℃，21％co2培养。去除旧dmem培养基(购自赛默飞公司，#11965092)，分别向培养于21％和5％氧浓度的细胞中加入ir
‑
83浓度为2.5μm dmem培养基溶液，孵育0.5h和1h后，pbs缓冲液漂洗3次去除未进入细胞的小分子，加入1ml无血清dmem培养基于激光共聚焦显微镜下观察各组细胞ir
‑
83的荧光信号(红色)强弱。结果如图4所示，在同一个时间点，乏氧细胞(5％o2)红色荧光明显强于正常氧细胞(21％o2)，表明ir
‑
83具有乏氧蓄积特性，更容易被乏氧细胞摄取。
[0081]
实施例9 ir
‑
83的线粒体靶向性
[0082]
将处于对数生长期的llc细胞接种于35mm(5
×
104)共聚焦小皿中,培养过夜贴壁。去除旧dmem培养基，加入浓度为2.5μm的ir
‑
83溶液，于37℃，5％co2条件下孵育4h。吸除含ir
‑
83的培养基，以pbs缓冲液漂洗3次，加入1ml线粒体探针mito
‑
traker
‑
green(1:5000)37℃孵育45分钟。随后加入1ml dapi(1:1000)溶液，室温10min复染细胞核，弃去染液，以pbs缓冲液漂洗3次。加入1ml无血清dmem培养基于激光共聚焦显微镜下观察ir
‑
83的荧光信号(红色)、mito
‑
traker
‑
green(绿色)、细胞核(蓝色)重叠情况。结果表明，化合物ir
‑
83在体外培养条件下可被肿瘤细胞高效摄取，显示出很强的红色荧光信号；红色荧光信号可与来
自线粒体的绿色荧光信号完全重合，相反与来自细胞核的荧光信号几乎无重合。表明化合物ir
‑
83进入细胞后，主要定位于细胞线粒体内(图5)。
[0083]
实施例10 ir
‑
83体外光诱导细胞毒性
[0084]
将llc细胞以每孔3
×
103数量接种到96孔板中培养过夜，向细胞中分别加入不同浓度(0,2.5,5,10μm)的化合物ir
‑
83孵育8h，细胞分为光照组和非光照组，光照组细胞接受2w/cm2的808nm近红外激光辐照5min，非光照组正常条件培养。24h后通过cck
‑
8检测各组细胞活力的变化。结果如图6所示，0,2.5,5,10μm的ir
‑
83对细胞没有明显毒性作用，而808nm激光照射后，ir
‑
83具有显著的浓度依赖性的杀伤效应。
[0085]
实施例11 ir
‑
83的光动力效应
[0086]
利用单线态氧荧光探针(sosg)(购自赛默飞公司，#1659576)检测ir
‑
83接受808nm激光照射后单线态氧的生成情况。向2ml，2.5μm的ir
‑
83溶液中加入5μm sosg探针(2％甲醇溶液配制)使得sosg探针最终检测浓度为2.5μm，而对照组为含sosg的2％甲醇溶液。将溶液充分混匀后，给予808nm激光(2w/cm2)照射5min后，照射后结束后立即将溶液收集至比色皿中，在近红外荧光分光光度计上检测溶液在500
‑
600nm之间荧光发射光谱(激发波长：488nm)。如图6所示，sosg在523nm处出现最大吸收峰，与对照组相比，ir
‑
83在光照后产生大量的单线态氧(增加约4倍)。表明ir
‑
83在近红外激光照射后具有较优异的光动力效应。
[0087]
实施例12 ir
‑
83的光热效应
[0088]
将1ml的2.5μm ir
‑
83pbs溶液和单纯pbs溶液装入1.5ml ep管中，分别接受808nm激光(2w/cm2)照射5min，并用fluke红外热成像仪监测每分钟温度的变化。如图7所示，pbs组在光照前后温度变化低(24升至28℃)，而ir
‑
83组在光照后温度从24℃升高至54℃。c57小鼠皮下荷瘤模型，待肿瘤体积生长为100mm3左右时，经尾静脉给予2.5mg/kg的ir
‑
83,24h后肿瘤部位接受808nm激光(0.8w/cm2)照射5min，并用fluke红外热成像仪监测肿瘤局部每分钟温度的变化。如图8所示，pbs组老鼠肿瘤部位温度从32℃升至42℃，而ir
‑
83组在光照后温度从33℃升至64℃。上述结果表明ir
‑
83在接受近红外激光照射后具有较优异的光热效应。
[0089]
实施例13体外ir
‑
83光热光动力的放疗增敏效应
[0090]
通过平板克隆形成实验和彗星实验检测llc细胞在接受不同处理后细胞增殖能力和dna损伤情况。结果显示与单纯x
‑
ray组相比，ir
‑
83联合近红外激光和x
‑
ray能明显抑制细胞增殖(图9)和促进dna双链断裂(图10)，表明ir
‑
83的光热和光动力效应可提高放疗效率。
[0091]
实施例14体内ir
‑
83光热光动力的放疗增敏效应
[0092]
将llc荷瘤小鼠随机分为4组(每组5只)，分别为vehicle组、x
‑
ray组、ir
‑
83+nir laser组、x
‑
ray+ir
‑
83+nir laser组。待肿瘤体积生长为100mm3左右时，经尾静脉给予2.5mg/kg的ir
‑
83,24h后肿瘤部位接受808nm激光(0.8w/cm2)照射5min，辐照组接受6gy的x
‑
ray肿瘤局部照射，联合组在近红外激光照射后立即进行x
‑
ray照射。每3天记录一次小鼠肿瘤体积大小，治疗12天后处死老鼠，分离肿瘤。结果表明联合组肿瘤体积远远小于其他组，ir
‑
83介导的放疗/pdt/ptt联合疗法可明显的抑制肿瘤生长。