维吾尔药材中二萜及其制备方法和作为制备预防或/和治疗炎症的抗炎、抗菌药物中的应用与流程

1.本发明涉及大苞荆芥分离纯化技术领域，是一种维吾尔药材中二萜及其制备方法和作为制备预防或/和治疗炎症的抗炎、抗菌药物中的应用，维吾尔药材中二萜成分为所述3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthre n-9-ol(nepetabrate c)的简称。


背景技术：

2.大苞荆芥nepeta bracteata benth为唇形科labiatae荆芥属nepeta植物，主要分布于巴基斯坦，尼泊尔，伊朗等国家，维吾尔名为“祖发”，习称神香草，临床用药广泛，主要以进口为主。其全草入药，气微清香，味淡、性微湿，入肺、肝经，具有镇咳平喘、清热利湿的作用，临床上用于治疗气管炎症，咳嗽气喘、感冒发烧、小便不利等症状。此外，大苞荆芥还具有来源容易、成本低廉、临床疗效可靠、毒副作用小等特点。迄今为止，对大苞荆芥进行探究的重点以及基础理论研究还不多见，现代药理学表明，其提取物具有显著的抗炎、抑菌活性，但尚未对化学成分进行相关研究，大苞荆芥可能是一味治疗呼吸系统疾病很好的物种，因此，近年来备受人们的关注。
3.大苞荆芥的药效主要来源于其中的萜类化合物，包括单萜类和二萜类化合物，其中优势成分二萜类成分抗炎、抑菌活性较好，因此，开发和利用大苞荆芥的二萜类单体化合物，进一步挖掘其潜在的药用价值，并对其单体化合物的结构和理化性质进行确定和表征，对于开发利用大苞荆芥具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)及其制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，其首次公开了3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isoprop yl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)及其作为制备预防炎症及抑菌药物或/和制备抗炎、抗菌药物或/和制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
5.本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)，化学结构式为
[0006][0007]
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
[0008]
上述按照下述方法制备得到：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第28.6分钟处得到3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)。
[0009]
上述第一步中，每1g大苞荆芥加入8ml至10ml乙醇。
[0010]
上述第六步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85：15。
[0011]
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第28.6分钟处得到3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)。
[0012]
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
[0013]
上述第一步中，每1g大苞荆芥加入8ml至10ml乙醇。
[0014]
上述第六步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85：15。
[0015]
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)作为制备预防炎症及抑菌药物的应用。
[0016]
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)作为制备抗炎及抗菌药物的应用。
[0017]
本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)作为制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
[0018]
本发明首次公开了化合物3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopr opyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)，并将该化合物进行了体外抗炎及抗菌药效学实验，实验明显可以看出该化合物对raw 264.7细胞和金黄色葡萄球菌及大肠杆菌具有较强的抑制作用，从而使该化合物能够作为制备预防炎症及抑菌药物或/和制备抗炎、抗菌药物或/和制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
附图说明
[0019]
附图1为本发明所述3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)的化学结构图。
[0020]
附图2为本发明所述3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)的1h-nmr谱图。
[0021]
附图3为本发明所述3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)的
13
c-apt谱图。
具体实施方式
[0022]
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
[0023]
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
[0024]
实施例1：该3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)，其特征在于化学结构式为
[0025][0026]
将本发明实施例1所述的3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopr opyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)进行核磁共振氢谱(1h-nmr)和核磁共振碳谱(
13
c-apt)分析。
[0027]
本实施例所述的3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)的1h-nmr谱图如图2所示。
[0028]
本实施例所述的该3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)的
13
c-apt谱图如图3所示。
[0029]
对图2和图3进行图谱解析，并将图2和图3各峰进行归属，图2和图3的各峰归属如表1所示，通过表1的数据可知，本实施例所述的3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hy droxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)的化学结构式如图1所示，易溶于氯仿、甲醇。
[0030]
实施例2：该3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)，按照下述方法制备得到：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第28.6分钟处得到3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)。
[0031]
实施例3：作为上述实施例的优化，该3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymet hyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)，按照下述方法制备得到：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时或4小时后，在50℃或60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时或3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第28.6分钟处得到3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)。
[0032]
实施例4：作为上述实施例的优化，第一步中，每1g大苞荆芥加入8ml至10ml乙醇。
[0033]
实施例5：作为上述实施例的优化，第六步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85：15。
[0034]
实施例6：该3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)作为制备预防炎症及抑菌药物的应用。
[0035]
实施例7：该3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)作为制备抗炎及抗菌药物的应用。
[0036]
实施例8：该3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)作为制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
[0037]
实施例9：该3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)按照下述方法得到：第一步，将大苞荆芥粉碎并加入乙醇，在室温下浸泡3小时后，在50℃条件下加热回流提取3次，每次2小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位和二氯甲烷部位；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50：1、25:1、8:1、5:1、1:1、1:0；第四步，将得到的8个馏分中第6个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到5个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为20:1、10:1、3：1、1:1、0:1；第五步，再将得到的5个馏分中第3个馏分再经硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3：1；第六步，再将得到的3个馏分中第3个馏分再经高效液相色谱梯度洗脱纯化分离，并收集洗脱物，在第28.6分钟处得到3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropy l-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)。
[0038]
将本发明实施例9得到的3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopr opyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)进行体外抗炎及抗菌药效学实验，体外抗炎及抗菌药效学实验利用mtt比色法。
[0039]
以3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylph enanthren-9-ol(nepetabrate c)为实验组，以aspinin(阿司匹林，抗炎药物)为对照组，同时设立空白组，实验组、对照组和空白组选取raw 264.7细胞为实验对象，培养基稀释后，以6
×
104/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，培养箱中正常培养24小时后，各组加入相对应的药物，使各组药物的最终浓度分别为2.5μg/ml(1组)，5μg/ml(2组)，10μg/ml(3组)，20μg/ml(4组)，40μg/ml(5组)，共设5个浓度，每个浓度3个复孔；培养48小时后，于每孔加mtt 10μl染色；继续培养四小时后，吸弃原培养液，每孔加入dmso 150μl，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，并于酶联免疫检测仪570nm波长处检测光密度值，根据光密度值计算50％抑制浓度(ic
50
，μm)，光密度值计算ic
50
的计算方法为现有公知技术。实验组、对照组对raw 264.7细胞的ic
50
如表2所示。表2数据可以看出，本发明所述的3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)对raw264.7细胞均具有一定的抑制作用。
[0040]
以3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylph enanthren-9-ol(nepetabrate c)为实验组，以penicillin(阿莫西林，抗菌药物)为对照组，同时设立空白组，实验组、对照组和空白组选取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌
为实验对象，将样品以无菌水或dmso稀释一定倍数后，离心取100μl加入指示菌平板的孔内，做为抑菌实验孔，取新鲜培养的指示菌株，将菌悬液浓度调至0.5mcfarland并均匀涂布在上述平板上，放置相应温度下培养24h或48h，观察各平皿的菌落生长情况。向孔中加入100μl新鲜培养基做为阴性对照孔，阿莫西林溶液做为阳性对照。培养基稀释后，以6
×
104/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，培养箱中正常培养24小时后，各组加入相对应的药物，使各组药物的最终浓度分别为2.5μg/ml(1组)，5μg/ml(2组)，10μg/ml(3组)，20μg/ml(4组)，40μg/ml(5组)，共设5个浓度，每个浓度3个复孔；培养48小时后，于每孔加mtt 10μl染色；继续培养四小时后，吸弃原培养液，每孔加入dmso 150μl，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，并于酶联免疫检测仪570nm波长处检测光密度值，根据光密度值计算50％抑制浓度(ic
50
，μm)，光密度值计算ic
50
的计算方法为现有公知技术。实验组、对照组对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的ic
50
如表3所示。表3数据可以看出，本发明所述的3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethyl)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有一定的抑制作用。
[0041]
综上所述，本发明首次公开了化合物3,4,4a,9,10,10a-hexahydro-1-(hydroxymethy l)-7-isopropyl-2,4a-dimethylphenanthren-9-ol(nepetabrate c)，并将该化合物进行了体外抗炎及抗菌药效学实验，实验明显可以看出该化合物对raw 264.7细胞和金黄色葡萄球菌及大肠杆菌具有较强的抑制作用，从而使该化合物能够作为制备预防炎症及抑菌药物或/和制备抗炎、抗菌药物或/和制备防治炎症及抑菌保健品的应用。
[0042]
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
[0043]
表1
[0044][0045]
表2
[0046][0047]
表3
[0048]