一种人胎盘组织源蜕膜间充质干细胞的简易制备方法与流程

1.本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种人胎盘组织源蜕膜间充质干细胞的简易制备方法。


背景技术：

2.干细胞是具有多能性维持和分化潜能的细胞。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，msc)是一种多能的成体干细胞，存在于胎盘、脐带、骨髓和脂肪组织等多种组织中，其有一定的分化潜能，可以分泌多种营养因子利于组织重塑和免疫调节，这些特性使得间充质干细胞成为治疗各种先天性和后天性疾病的出色候选者。胎盘在胎儿发育过程中起重要作用，从胎盘蜕膜获得的细胞，具有间充质干细胞的基本特征，为胎盘蜕膜间充质干细胞，其作为一个母亲自体间充质干细胞的重要来源，能安全的用于治疗多种疾病。有研究表面母体组织来源的间充质干细胞高水平分泌血管内皮生长因子和血管生成素1，增加血管通透性，促进内皮细胞的增殖和新生血管的生成，治疗后肢缺血疾病比其他来源的间充质干细胞更具有优势。
3.胎盘蜕膜间充质干细胞具有广阔的临床应用潜能，其制备主要采用酶消化方法。剥离蜕膜组织并剪成碎块，使用胶原蛋白酶消化后收集细胞沉淀并接种至培养瓶中进行扩增培养。该方法在组织剪切和消化过程中会破坏大量细胞，释放的染色体会导致消化液变得粘稠，且其中含有未被完全消化的组织，若将细胞悬液进行接种使得细胞培养环境中含有大量dna及组织块会干扰细胞贴壁和生长。因此需要将消化液进行过滤，使用细胞筛网过滤时，未消化完全的组织块及粘稠的消化液常阻塞细胞筛网，导致过滤时间长，容易导致获得的细胞活力降低、增殖慢，且期间需更换新的细胞筛网才能完成消化液的过滤，增加生产成本。使用消化法提取底蜕膜间充质干细胞，原代细胞中含有大量的杂细胞，培养过程中需进行换液及传代来纯化细胞，原代细胞贴壁不牢容易在换液时脱落，为获取足够的种子细胞，则会增加换液次数延长培养时间，增加生产成本，不利于工业化生产。原代间充质干细胞获取的数量直接决定了通过传代培养获取的高代次细胞的数量。因此，研究提高人胎盘组织源蜕膜干细胞产量的制备方法，在原代细胞换液时减少细胞脱落，最大化收获蜕膜中的间充质干细胞具有重要意义。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中胎盘蜕膜间充质干细胞的分离培养步骤繁琐，操作时间长及成本高的问题，本发明提供一种操作简便、节约成本的同时确保获得高纯度、表征优良的胎盘蜕膜间充质干细胞，应用前景广阔。
5.本发明的上述目的是通过以下的技术方案得到实现：
6.本发明提供的提高胎盘蜕膜组织中原代间充质干细胞产量的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)从胎盘样本剪下底蜕膜组织，放入150mm无菌培养皿中，使用含2％双抗的生理
盐水漂洗5～6遍，洗净后使用镊子剥离靠母体侧的底蜕膜组织。
8.(2)收集底蜕膜组织并剪成单个体积为1～2mm3的肉糜，加入0.1％浓度的胶原蛋白酶并放入恒温震荡仪中37℃，200rmp消化30min。
9.(3)消化完成后加入3倍的生理盐水进行稀释消化，得到胎盘组织消化液。
10.(4)取一次性使用输血器，使用无菌剪刀将输液器的滴斗部位剪开，用于加入胎盘蜕膜组织消化液，将连接滴斗及过滤网的导管则剪剩3～4cm，使用止血钳夹住导管旁位置，放置在50ml离心管上固定。
11.(5)根将新鲜的胎盘组织消化液加入到输液器的滴斗中，收集滤液，400g离心5min后倒弃上清后得到细胞沉淀。
12.(6)将细胞沉淀使用10～20ml 5％的完全培养基进行重悬并混匀，400g离心5min后倒弃上清后得到细胞沉淀。
13.(7)将细胞沉淀使用10％的完全培养基进行重悬后种瓶，放入37℃，5％co2培养箱中进行培养。
14.(8)待细胞生长至融合度达80～90％时，收集p0代细胞使用5％完全培养基重悬后按1∶4进行传代培养。
15.根据本发明的一个实施例，所述的过滤网为网口宽度为16mm，过滤网长度为45mm的袋式过滤网，过滤孔径为(200
±
20)um。
16.根据本发明的一个实施例，所述步骤(2)中的0.1％胶原蛋白酶是使用α-mem基础培养基配置，组织消化时加入蛋白胶原酶的体积是蜕膜组织量的4～5倍。
17.根据本发明的一个实施例，所述步骤(7)中的种瓶培养应根据剥离的蜕膜组织量，5ml的蜕膜组织消化后收集的细胞沉淀可种瓶5～7个t-75细胞培养瓶。
18.根据本发明的一个实施例，所述5％完全培养基为含5％人血小板裂解液的α-mem培养基。
19.根据本发明的一个实施例，所述步骤(7)中培养开始后24～36h进行全量换液，继续培养，所述继续培养则为每3天进行全量换液，培养全过程换液次数为1～2次，原代细胞培养天数为4～7天。
20.根据本发明的一个实施例，所述的换液使用的是5％完全培养基，并加入1％双抗及0.1％的两性霉素防止细胞污染。
21.根据本发明的一个实施例，当细胞传代至p1时进行表面抗原检测及成软骨、成骨和成脂诱导。
22.本发明所提供的是一种操作简单、高效、无污染，且能提高原代间充质干细胞得率的制备方法。本发明采用一步消化的方法，较其他二步消化或者多步多酶消化法更加方便和快捷，制备的细胞可满足细胞库储备以及临床对移植细胞数量的要求。
23.所述方法是将胎盘组织消化液使用一次性使用输血器过滤网能对消化的细胞悬液进行快速过滤，离心弃上清后再次使用少量的5％完全培养基重悬离心后种瓶培养，能加速细胞贴壁生长。本发明后续实施例所示，本发明方法获得的干细胞免疫表型符合间充质干细胞的鉴定标准且具有多向分化潜能。
附图说明
24.图1为实施例一胎盘消化液不同的过滤方式对胎盘间充质干细胞生长密度的影响(100
×
)；
25.图2为实施例二胎盘消化液未进行过滤培养的细胞表面标志物表达情况；
26.图3为实施例二胎盘消化液使用100μm细胞筛网过滤后培养的细胞表面标志物表达情况；
27.图4为实施例二胎盘消化液使用输血器过滤后培养的细胞表面标志物表达情况；
28.图5为实施例三胎盘消化液不同的过滤方式对细胞的成脂(200
×
)、成软骨(40
×
)、成骨(100
×
)分化结果的影响。具体实施细则
29.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所用试剂或仪器均可由市场购得。
30.实施例一：胎盘消化液不同的过滤方式对胎盘间充质干细胞增殖状况影响
31.从胎盘样本剪下底蜕膜组织，放入150mm无菌培养皿中，使用含2％双抗的生理盐水漂洗5～6遍，洗净后使用镊子剥离靠母体侧的底蜕膜组织。收集底蜕膜组织并剪成单个体积为1～2mm3的肉糜，加入0.1％浓度的胶原蛋白酶并放入恒温震荡仪中37℃，200rmp消化30min。消化完成后加入3倍的生理盐水进行稀释消化，得到胎盘组织消化液。将胎盘组织消化液平均分为3组，一组不进行过滤，一组使用100μm细胞筛网进行过滤，一组使用一次性使用输血器过滤网进行过滤。
32.使用一次性输血器过滤网过滤时的操作步骤：使用无菌剪刀将输液器的滴斗部位剪开，用于加入胎盘蜕膜组织消化液，将连接滴斗及过滤网的导管则剪剩3～4cm，使用止血钳夹住导管旁位置，放置在50ml离心管上固定。将新鲜的胎盘组织消化液加入到输液器的滴斗中，收集滤液。过滤完成后使用400g离心5min，倒弃上清后得到细胞沉淀。将细胞沉淀使用10～20ml 5％的完全培养基进行重悬并混匀，400g离心5min后倒弃上清，使用5％的完全培养基重悬细胞沉淀进行种瓶培养，每组各种瓶4个t-75培养瓶，放入37℃，5％co2培养箱中进行培养。培养24h后进行全量换液，继续培养，之后每隔2～3天进行全量换液。各组培养相同的时间后收集p0代细胞，测定原代细胞数量与活率。根据计数结果进行传代培养。
33.胎盘消化液不同的过滤方式对胎盘间充质干细胞生长状况的影响如图1所示，细胞种瓶后培养24h后进行第一次换液，可观察到未过滤组的细胞贴壁不牢，多漂浮，换液后70％的细胞出现脱落。100μm细胞筛网过滤组及输液器过滤组的细胞能贴壁生长，换液时细胞基本不会出现脱落。培养至第3天进行第二次换液，换液后可观察到未过滤组只有少量的细胞贴壁生长，100μm细胞筛网过滤组的细胞呈局部密集生长，细胞融合度达70～80％，而一次性使用输液器过滤组的细胞融合度达80～90％。培养至第5天时，未过滤组细胞融合度在50％左右，100μm细胞筛网过滤组及一次性使用输血器过滤组的细胞融合度达到95～100％需进行传代培养。
34.各组细胞培养5天后，收获原代细胞并计数。结果如表1所示，未过滤组收获的原代数量最少，一次性使用输血器过滤网组及100μm细胞筛网组的细胞数量相差不大。但在操作过程中，使用100μm细胞筛网过滤时消化液会堵塞细胞筛网，过滤时间长，50ml的消化液20min以上才可过滤完全，期间需更换细胞筛网才能将消化液完成过滤。使用一次性使用输
血器过滤时可缩短过滤时间，50ml的消化液1min内可过滤完全，操作更为简便且节约了生产成本。
35.表1
36.实施例二：胎盘消化液不同的过滤方式对胎盘间充质干细胞免疫表型的影响
37.将实施例一所得细胞传代培养至p1代，对细胞的免疫表型进行检测。细胞表面抗原检测：胎盘间充质干细胞消化后清洗3次，制成细胞悬液，每个抗体检测的细胞数量为2.2
×
105个，加入抗体后4℃避光孵育30min。孵育终止后，使用pbs洗涤两次后加入200μl的pbs重悬，转移到流式管中，流式细胞仪检测分析cd73、cd90、cd105、cd34、cd11b、cd19、cd45、hla-dr的表达情况。三系分化能力检测：取p1代细胞，使用特定诱导条件培养基诱导24d后，油红o染色法检测细胞的成脂分化能力，茜素红染色法检测细胞的成骨分化能力，阿利新蓝染色法检测细胞的成软骨能力。
38.表2及图2(未过滤组)、图3(100μm细胞筛网过滤组)、图4(输血器过滤组)为胎盘消化液不同的过滤方式所得的细胞的流式检测结果，对细胞表面抗原水平的标准规定是参照2006年国际细胞治疗协会(isct)制定的最低标准。dominici m，le blanc k，mueller i，et al.minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.the international society for cellular therapy position statement[j].cytotherapy，2006，8(4)：315-317.
[0039]
表2
[0040]
上述结果显示各组细胞均表达cd73、cd90、cd105，不表达或低表达cd34、cd11b、cd19、cd45、hla-dr，细胞表型无差异。
[0041]
实施例三：胎盘消化液不同的过滤方式对胎盘间充质干细胞三系分化能力的影响
[0042]
将实施例一所得细胞传代培养至p1代，对细胞的三系分化能力进行检测。成脂分化能力检测：取4.5
×
105个细胞接种到装有2ml msc培养基的6孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。待细胞融合度达到90％时，换成2ml msc成脂分化培养基a液(含10％fbs、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)；3天后换为2ml培养基b液(含胰岛素及10％fbs)；24h后再更换成成脂诱导液a诱导，循环诱导24天后用油红o染色法检测细胞的成脂分化能力。成骨分化能力检测：取4.5
×
105个细胞接种到装有2ml msc培养基的6孔板中。将细胞置于培养箱中培养，待细胞长到基本融合的时候，更换2ml msc成骨分化培养基，每隔2天换一次msc成骨分化培养基，培养24天，用茜素红染色法检测细胞的成骨分化能力。成软骨分化能力检测：制备含2.0
×
106个msc细胞悬液，1200rpm离心获得细胞沉淀，用10μl msc培养基重悬后，取5μl置于24孔板，以形成细胞微团。将细胞置于培养箱中培养，2h后，向24孔板中加入1ml msc成软骨诱导分化培养基，每隔2天换一次msc成软骨诱导分化培养基，培养19天以后，用阿利新蓝染色法检测细胞的成软骨能力。
[0043]
图5为胎盘消化液不同的过滤方式所得的细胞的三系分化能力检测结果，结果显示各组细胞经成骨诱导分化后，茜素红染色可见密集的细胞间大量散在染为橘红色的矿化结节。成脂诱导分化后，经油红o染色后可见细胞内脂滴呈鲜红色，染色结果为阳性。成软骨诱导分化后，细胞团逐步形成一个密实且有弹性的乳白色小球，阿利新蓝染色结果显示细胞团呈蓝色。以上结果表明胎盘消化液不同的过滤方式对细胞的多向分化潜能无影响。采用一步消化的制备方法能获得高纯度、表征优良的胎盘底蜕膜间充质干细胞。