一种CD44拮抗多肽及其衍生物与应用

一种cd44拮抗多肽及其衍生物与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体而言，本发明是非小细胞肺癌靶点cd44受体拮抗多肽hl7
‑
ml2及其衍生物与应用。


背景技术：

2.非小细胞肺癌
3.根据美国癌症学会2018年的调查，肺癌是全世界范围内发病率(11.6％)和死亡率(18.4％)最高的恶性肿瘤，在我国，肺癌同样居恶性肿瘤发病首位，占比78.7％，远高于其他癌症。
4.我国非小细胞肺癌(non
‑
small cell lung cancer,nsclc)患者占全部肺癌的85％左右。其中约75％的患者，发现时已处于中晚期，5年生存率很低。由于潜伏期长，致死率高，非小细胞肺癌已成为是中国当前危害最严重的癌症，这不仅严重影响了人们的身体健康，同时也是一个深刻的社会问题。
5.面对严峻的形势，nsclc的研究和防治亟待重视。早期肺癌治疗主要以手术为主，但由于早期症状不明显等原因，约80％的患者在确诊时已经错过手术的最佳时期，且肺癌术后也有较高的复发率与转移率，只能以药物治疗为主，时间长，见效慢，严重威胁患者的生命健康。
6.随着以egfr为代表的nsclc驱动基因突变研究的不断发展，分子靶向药物，如表皮生长因子受体
‑
酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor
‑
tyrosine kinase inhibitors，egfr
‑
tkis)逐渐得到医学界的重视并广泛应用于晚期nsclc的临床治疗。然而，经过一段时间(9
‑
13月)的egfr
‑
tkis治疗后，产生了获得性耐药，这是治疗晚期nsclc的难点之一。近年相关研究表明，肿瘤干细胞的富集和emt转化是nsclc患者对egfr
‑
tkis产生耐药的重要原因，其介导的耐药细胞的恶性程度远超t790m突变等原因获得的耐药细胞，目前尚缺少有效的针对肿瘤干细胞和emt的靶向治疗方法。因此，阐明肿瘤干细胞和emt介导egfr
‑
tkis获得性耐药的机制，发现逆转耐药新靶点，建立针对cscs和emt的靶向治疗策略，将会降低传统治疗的毒副作用，提高疗效，具有重要的理论意义和临床价值。
7.emt是nsclc egfr
‑
tkis获得性耐药的主要原因之一
8.emt是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。emt可以通过tgf
‑
β、akt、notch和nf
‑
kb等信号通路激发，与胞内的slug、snail、zeb1、zeb2和twist等转录因子共同组成一个含有多个正反馈回路的信号网络，下调n
‑
cadherin、e
‑
cadherin等上皮细胞标志物表达，上调vimentin、纤连蛋白等间质标志物的表达，促上皮细胞向间质细胞转化，间质细胞再进一步变成间充质干细胞。
9.研究证实，emt转化与egfr
‑
tkis获得性耐药紧密相关。一例来自于厄洛替尼获得性耐药患者的复发灶穿刺样本表明，间质表型的获得是耐药的主要原因；在体外构建的egfr
‑
tkis耐药nsclc细胞株hcc827/clr和hcc4006/er中也重复了emt表型；此外，67例化疗联合egfr
‑
tkis治疗后复发的肺癌患者的临床样本分析结果显示，对egfr
‑
tkis不敏感的肺
癌组织往往高表达间质细胞标记物vimentin和(或)纤连蛋白等，而高表达e
‑
cadherin的患者则具有较长的pfs；发生emt的肺癌重新表达e
‑
钙粘蛋白后，肿瘤细胞可恢复对egfr
‑
tkis治疗的敏感性。egfr突变阳性患者服用奥希替尼，同样面临继发性耐药的难题。体外构建奥西替尼耐药h1975细胞株(含有t790突变的耐药细胞株)，发现emt转化是其产生继发性耐药的主要原因；另一方面，通过emt途径获得egfr
‑
tki耐药性的患者，其病情进展比t790m突变导致的耐药患者更快,预后也更差。这些结果均证实，emt是nsclc患者对egfr
‑
tkis获得性耐药的主要原因，与患者的不良预后有关。然而，emt介导egfr
‑
tkis产生耐药的机制尚不明确。本研究通过构建egfr
‑
tkis耐药的nsnlc细胞模型，阐明emt在egfr
‑
tkis产生过程中的重要作用。
10.肿瘤干细胞的富集是emt转化后产生耐药的主要原因
11.cscs是一类具有自我更新、高致瘤性,分化潜能、高度耐药等特征的恶性肿瘤细胞群。cscs具有多种耐药机制，主要包括：
○
1高表达atp结合转运蛋白abcg2和mdr1等导致的药物外排；
○
2增强的dna损伤修复能力；
○
3高表达抗凋亡基因；
○
4多处于静息期，对普通化疗药物不敏感，这是cscs能够逃避现有的肿瘤放化疗手段，导致肿瘤复发和转移的根本原因。
12.近年的研究表明，cscs的形成受到emt的调控，这说明emt可能是cscs维持其干性的重要因素。诱导永生化人乳腺上皮细胞(hlmes)发生emt后肿瘤干细胞的比例也随之增加；从hlmes和人乳腺癌细胞中分离出肿瘤干细胞，均有emt表型[10]；肿瘤细胞在侵袭、emt转化过程中cscs含量增加；tgf
‑
β1诱导产生emt的nsclc细胞,呈现很强的干细胞特性。综上所述，cscs的富集是emt介导肿瘤细胞产生耐药的根本原因。靶向清除这些cscs，并对相关环节进行调控将有助于抑制癌细胞的转移。然而，由于缺乏有效的靶向杀伤cscs治疗策略，直接杀灭cscs灭较为困难，本课题通过对cscs生物学特性以及相关信号通路、细胞调控机制的研究，尝试建立新的治疗策略，为靶向杀伤cscs提供新的思路。
[0013]
cd44在cscs的自我更新及多种耐药产生过程中起重要作用
[0014]
cd44是一种跨膜糖蛋白,属于粘附分子中的透明质酸(hyaluronic acid，ha)受体，在人体内广泛分布，参与许多生物学过程，其高表达与患者的不良预后密切相关。cd44在正常细胞上多处于静止状态，不具有与透明质酸(hyaluronic acid，ha)结合的活性，然而在cscs上则处于高度活化状态，通过结合ha，参与调节cscs的自我更新、干性维持、emt转化和多种耐药产生过程。因此，在生物和医学研究中，cd44作为cscs表面标记物，用于鉴定和筛选肺癌、肝癌和乳腺癌等恶性肿瘤组织中cscs，其高表达与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关，被认为是肿瘤起始因子。研究表明，cd44在肺癌中的阳性表达率高达85.5％，其中肺癌骨转移组织和原发型肺癌组织中的阳性率分别为92％和80％，且差距有统计学意义，提示cd44的异常高表达与肺癌转移有关；cd44在分子靶向药egfr
‑
tkis治疗后残留的肺癌细胞中显著高表达，说明cd44阳性细胞具有很强的耐药特性；多项临床研究均证实，在nsclc中，cd44高表达者较无表达和低表达者更容易发生淋巴结转移，说明cd44阳性细胞具有很强的侵袭能力。本研究通过前期工作发现cd44在吉非替尼耐药细胞株pc9gr中显著高表达；敲低耐药细胞中cd44表达，不仅能降低cd166、abcg2等cscs标记物的表达量，也能逆转emt，恢复耐药细胞对吉非替尼的敏感性。这些结果均提示，cd44可作为靶向杀伤cscs的治疗靶点，但目前缺少cd44的靶向治疗策略，成为cd44的靶向治疗的主要障碍。利
用体内外实验模型，研究cd44在肿瘤发生发展、转移侵袭和耐药产生中的作用机制，明确其作为治疗新靶点的可行性，开发靶向cd44治疗策略，有助于抑制肿瘤复发，改善疗效。
[0015]
噬菌体展示技术在多肽类药物研究中的应用
[0016]
多肽是组成机体内各种细胞功能的生物活性物质，具有相对分子质量小、特异性高、易吸收、易合成及改造、可以提高机体免疫力、安全性高等特点，在肿瘤的临床治疗上具有较高的应用价值。噬菌体展示技术(phage display)是利用丝状噬菌体展示蛋白和多肽,从大量变异体中提取所需性质的多肽或蛋白。通过噬菌体展示技术从肿瘤组织筛选出差异性抗原肽，这些多肽往往结合于肿瘤细胞高表达的组分或表面受体，具有一定的肿瘤靶向性，也可以通过人工合成获得高纯度多肽单体。因此，同抗体一样，与肿瘤抗原结合后，多肽药物也可以产生adcc效应，诱导肿瘤细胞凋亡。可见，小分子多肽药物有极好的临床应用价值。


技术实现要素：

[0017]
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种cd44拮抗多肽，该拮抗多肽与受体cd44具有特异性高亲和力，能够通过与cd44的结合来阻断cd44的信号通路，证明该多肽在靶向抑制吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成等方面起着重要的作用，其在吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌靶向治疗方面具有巨大的应用价值。
[0018]
本发明的另一目的在于提供上述cd44受体拮抗多肽的衍生物，该衍生物也能够与cd44受体具有特异性高亲和力，且特异性与cd44结合。
[0019]
本发明的再一目的在于提供上述cd44拮抗多肽及其衍生物的应用。
[0020]
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
[0021]
本发明一个方面提供了一种cd44拮抗多肽，其氨基酸序列如seq id no:1所示，
[0022]
dplwfpgdsrqq seq id no：1。
[0023]
上述cd44拮抗多肽的筛选方法，该方法利用噬菌体随机肽库，首先采用cd44质粒转染293t细胞，获得永久高表达cd44的稳定细胞系，以野生型293t细胞为对照吸附细胞，进行5轮全细胞消减筛选，随机挑取50个阳性噬菌体扩增，提取克隆单链dna测序。分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序。
[0024]
本发明另一个方面提供了一种cd44拮抗多肽的衍生物，所述的cd44抗多肽的衍生物为cd44拮抗多肽氨基酸侧链基团上、cd44拮抗多肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为cd44拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；所述的常规修饰优选为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇peg修饰或固定化修饰等；所述的标签优选为his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、c
‑
myc或profinityexact等。
[0025]
所述的cd44拮抗多肽及其衍生物可以来源于哺乳类动物或者鸟类，例如灵长类动物(人类)；啮齿类动物，包括小鼠，大鼠，仓鼠，兔，马，牛，犬类，猫等。
[0026]
所述的cd44拮抗多肽及其衍生物的获得，采用现有技术中的公知方法进行，既可以用多肽自动合成仪进行化学合成；通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到载体中进行生物合成；也可以从现有存在的生物体内进行大量提取和纯化。
[0027]
本发明再一个方面提供了一种多聚核苷酸，其编码seq id no.1所述多肽。
[0028]
本发明再一个方面提供了一种载体，其包含了本发明所述的核苷酸，可以通过基因技术手段与启动子序列链接。
[0029]
本发明再一个方面提供了一种宿主细胞，其转染了本发明所述的载体。
[0030]
本发明再一个方面提供了一种药物，所述药物包含cd44拮抗多肽或其衍生物。
[0031]
在本发明的技术方案中，所述药物含有一种或者是多种药学上可以接受的载体；
[0032]
在本发明的技术方案中，所述药学上可以接受的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；
[0033]
在本发明的技术方案中，所述的药物可以进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。
[0034]
本发明再一个方面提供了一种检测试剂，所述检测试剂包含cd44拮抗多肽或其衍生物。
[0035]
本发明再一个方面提供了前述cd44拮抗多肽或cd44拮抗多肽的衍生物的抗体。
[0036]
本发明再一个方面提供了本发明所述的cd44拮抗多肽、cd44拮抗多肽的衍生物在制备抑制高表达cd44的肿瘤细胞增殖的药物中的用途。
[0037]
本发明再一个方面提供了本发明所述的cd44拮抗多肽、cd44拮抗多肽的衍生物在制备促进高表达cd44的肿瘤细胞凋亡药物中的用途。
[0038]
在本发明的技术方案中，高表达cd44的肿瘤细胞选自吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌细胞。
[0039]
本发明再一个方面提供了本发明所述的cd44拮抗多肽、cd44拮抗多肽的衍生物在制备治疗高表达cd44的肿瘤疾病的药物中的用途。
[0040]
在本发明的技术方案中，高表达cd44的肿瘤疾病选自非小细胞肺癌、肝癌、直肠癌、结肠癌、胆管癌、胶质瘤、子宫内膜癌、胃腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌。
[0041]
在本发明的技术方案中，所述的高表达cd44的肿瘤疾病选自耐药型肿瘤疾病，优选为耐药型非小细胞肺癌、耐药型肝癌、耐药型直肠癌、耐药型结肠癌、耐药型胆管癌、耐药型胶质瘤、耐药型子宫内膜癌、耐药型胃腺癌、耐药型乳腺癌、耐药型鼻咽癌、耐药型肝癌。
[0042]
在本发明一个具体技术方案中，所述的高表达cd44的肿瘤疾病选自吉非替尼耐药型非小细胞肺癌。
[0043]
本发明再一个方面提供了本发明所述的cd44拮抗多肽、cd44拮抗多肽的衍生物在制备治疗降低高表达cd44的肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力的药物中的用途。
[0044]
本发明再一个方面提供了本发明所述的cd44拮抗多肽、cd44拮抗多肽的衍生物在制备降低高表达cd44肿瘤细胞中cd44或ki67表达，以及增强凋亡相关的caspase3表达的药物中的用途。
[0045]
在本发明的具体实验中，利用cd44拮抗多肽hl7
‑
ml2可以特异性的与高表达cd44的细胞293t cd44
+/+
结合。
[0046]
在进一步试验中，利用高表达cd44的吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌细胞pc9gr作为细胞模型验证了cd44拮抗多肽hl7
‑
ml2的功能，与对照组相比，发现hl7
‑
ml2可以显著抑制pc9gr细胞的迁移、侵袭和克隆形成能力。
[0047]
有益效果
[0048]
(1)本发明提供了一种cd44拮抗多肽hl7
‑
ml2及其衍生物，所述的拮抗多肽及其衍生物能够专一性与cd44结合，并特异性与cd44结合抑制cd44信号通路。
[0049]
(2)本发明首次证明cd44的高表达与非小细胞肺癌的增殖、侵染、迁移、侵袭和克隆形成能力相关，且证明了降低cd44的表达，能够实现抑制非小细胞肺癌的增殖、侵染、迁移、侵袭和克隆形成能力。
[0050]
(3)本发明筛选得到的cd44拮抗多肽及其衍生物可以通过阻断cd44的信号通路抑制吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌细胞的迁移、侵袭和克隆形成能力，可以作为cd44结合位点的生物类多肽药物，可用于制备预防和/或治疗非小细胞细胞癌药物。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。
附图说明
[0051]
图1：293t
‑
cd44+/+细胞高表达cd44蛋白。
[0052]
图2：hl7
‑
ml2多肽的hplc检测图谱。
[0053]
图3：检测不同浓度吉非替尼和阿霉素分别处理pc9和pc9gr细胞的细胞生长曲线，吉非替尼和阿霉素对pc9细胞抑制能力更强。
[0054]
图4：hl7
‑
ml2多肽显著抑制pc9gr细胞增殖。蛋白芯片结果显示，吉非替尼敏感株pc9相比，cd44在吉非替尼获得性耐药pc9gr细胞株中的表达量更高。
[0055]
图5：hl7
‑
ml2多肽处理pc9gr细胞的细胞生长曲线，随hl7
‑
ml2浓度上升细胞被抑制程度增加。
[0056]
图6：随着作用浓度的增高，hp7
‑
ml2多肽显著抑制pc9gr细胞的克隆形成能力。
[0057]
图7：hl7
‑
ml2多肽显著抑制pc9gr细胞的迁移能力。
[0058]
图8：hl7
‑
ml2多肽对小鼠肺癌移植瘤模型处理两周后，a.处理组和对照组肿瘤大小的比较；b.肿瘤免疫组化检测cd44、ki67和caspase3的表达。
具体实施方式
[0059]
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0060]
实施例1：进行cd44拮抗多肽hl7
‑
ml2的淘选、扩增、纯化、测序及合成。
[0061]
本实施例通过筛选获得与cd44特异性结合的阳性噬菌体，再通过将阳性噬菌体扩增、纯化，提取噬菌体单链dna(ssdna)进行测序，将所获得的序列分析对比，最后合成高纯度的拮抗多肽hl7
‑
ml2。
[0062]
具体如下：
[0063]
1.建立永久高表达cd44的293t细胞系：293t
‑
cd44
+/+
[0064]
①
选取生长旺盛的可发光的人293t细胞，在转染前一天以5
×
105个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；
[0065]
②
第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μl的opti
‑
mem培养基稀释3μg质粒，另以200μl的opti
‑
mem培养基稀释6μl脂质体lipofectamine2000，分别轻轻混
匀后，室温放置5分钟；
[0066]
③
将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟后，向混合后的稀释液中轻轻加入600μl的opti
‑
mem培养基；
[0067]
④
将待转染的细胞用pbs轻轻漂洗一次，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；
[0068]
⑤
培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3ml完全培养基；
[0069]
⑥
48小时后收集慢病毒液，离心，感染273t细胞；
[0070]
⑦
24小时后选用含有5μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达cd44的293t细胞系：293t
‑
cd44
+/+
。
[0071]
⑧
提取总蛋白，进行了蛋白芯片检测，与感染了空白载体的细胞相比，293t
‑
cd44
+/+
细胞显著高表达cd44蛋白，结果见图1，即可以用于阳性噬菌体筛选。
[0072]
2.进行cd44拮抗多肽的淘选、扩增、纯化、测序及合成
[0073]
①
er2738宿主菌液的制备：无菌技术操作，先取200μl lb
‑
tet液体培养基于1.5ml灭菌离心管中，再从e.coli er2738的甘油冻存物中取0.2μl菌液与之充分混匀，全部吸取涂布于lb
‑
tet平板上，标记平板，室温放置3min，然后置于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。次日观察，长出克隆后用封口膜封口，4℃避光保存备用。用灭菌枪头以无菌技术挑取单菌落，放入已预先加有3ml lb
‑
tet液体培养基的10ml灭菌离心管中，标记后于恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养过夜。次日，细菌扩增液于4℃储存备用。取10ml灭菌离心管，无菌操作加入3ml lb
‑
tet液体培养基，取30μl过夜培养的细菌接种其中，恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养2～3h，细菌处于指数生长期，肉眼观察呈雾状(od
600
～0.5)。
[0074]
②
cd44拮抗肽的淘选：将高表达cd44细胞按105个/培养皿接种于预先包被多聚赖氨酸的60
×
15mm2培养皿中，常规培养至细胞密度80％～90％时，用于淘洗(同时用不表达cd44的细胞系作为空白对照)每轮洗脱液先取1μl测滴度，剩下的将其加入到20ml lb培养液中扩增，再纯化、最后再测扩增后的滴度，扩增物于4℃短期保存，并取相等数量级用于下一轮淘选，剩下的扩增物用50％的甘油于
‑
20℃保存。
[0075]
③
测定噬菌体的滴度:取4支灭菌的10ml离心管，每个噬菌体稀释度准备1个灭菌离心管，微波炉熔化顶层琼脂(agarose top)，每管加入3ml顶层琼脂，45℃水浴备用。每个噬菌体稀释度准备1块lb/iptg/xgal平板，37℃恒温培养箱预热备用。将od
600
～0.5的e.coli er2738大肠杆菌按照噬菌体稀释度200μl/管分装，4℃保存备用。取4支灭菌的1.5ml离心管，分别盛有100μl、90μl、90μl、90μl lb
‑
tet培养基，将待测噬菌体吸取1μl入100μl lb
‑
tet培养基中，按10倍梯度稀释，分别标记为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4，每个稀释度轻轻振荡混匀，瞬间离心。取10μl待滴定的各稀释度的噬菌体与200μl e.coli er2738混合，轻轻振荡混匀，瞬间离心，室温孵育5min。将混合菌液迅速加入顶层琼脂中，快速振荡混匀，立即倒入预热的lb/iptg/xgal平板，将其均匀展平，室温冷却5min，37℃恒温培养箱中，倒置平板培养过夜。
[0076]
④
洗脱噬菌体的扩增及纯化：取250ml的锥形瓶，按1:100比例，将过夜培养的er2738宿主菌液加入至20ml lb液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；然后将待扩增的噬菌体液加入到锥形瓶中，37℃，250rpm剧烈振荡培养4.5h；将培养物转入50ml离心管中，4℃，10,000rpm离心10min。上清液转入另一干净离心管中，4℃，10,000rpm再次离心
10min；取上清的80％转入另一干净离心管中，加入1/4体积的peg/nacl，颠倒混匀后于4℃沉淀过夜；第二天，将沉淀于4℃，12000rpm离心20min。用干净枪头小心吸取上清液，再4℃，12,000rpm离心1min，去掉残留上清液；然后用1ml tbs重悬沉淀物，轻轻吹打100次。然后将悬液转入2ml离心管中，4℃，10000rpm离心5min除去残余细胞；将上清加入1/4体积的peg/nacl后，于冰上孵育60min再次沉淀；取出离心管，4℃12000rpm离心20min，去掉上清；用200μl tbs重悬沉淀，4℃，10,000rpm离心1min。上清转入另一离心管中。4℃短期保存，也可以用50％的甘油于
‑
20℃长期保存。单克隆噬菌体的扩增，包括按1:100比例，将过夜培养的er2738宿主菌液加入至2ml lb液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；用灭菌牙签，从第四轮滴度平板中选取少于100个噬菌斑的平板，挑取分隔良好的蓝色噬菌斑，加入到培养管中，37℃，250r/min剧烈震荡培养4.5h；然后将培养物转入到新鲜离心管中，4℃，10,000rpm离心30sec。上清转入以新鲜管中，再同样离心一次；将上清的80％转入新鲜离心管中，4℃贮存，也可以用50％的甘油于
‑
20℃长期保存。
[0077]
⑤
琼脂糖凝胶电泳鉴定m13噬菌体ssdna：将凝胶成形模具水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间；称取dna电泳用琼脂糖1g放入250ml的三角烧瓶中，加入100ml 1
×
tae缓冲液，混匀后，将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；关闭电磁炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至室温(手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml；室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中；在电泳槽加入1
×
tae缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜；将样品用loading buffer稀释以后加入胶板中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外；接通电源，调节电压至50伏，电泳90min后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。
[0078]
(6)ssdna测序及序列分析：将提取的m13噬菌体ssdna送到上海英潍捷基生物技术有限公司进行dna测序。测序以后用bioedit软件进行序列分析。通过分析结果可知，样品序列为dplwfpgdsrqq，以hl7
‑
ml2表示，最后短肽由合肥国肽生物科技有限公司。合成后的短肽经过hplc检测，检测图谱见图2。
[0079]
实施例2 吉非替尼获得性耐药细胞pc9gr细胞对阿霉素的耐药浓度也显著增加
[0080]
①
将pc9和吉非替尼耐药细胞pc9gr以5
×
103个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μl，培养24h，然后饥饿过夜；
[0081]
②
加入不同浓度梯度的吉非替尼(pc9:50,25,12.5,6.25,3.125,1.5625,0nm)(pc9gr:50,25,12.5,6.25,3.125,1.5625,0μm)和不同浓度的阿霉素(2500,1250,625,312.5,156.25，0nm)分别培养72小时；
[0082]
③
弃培养板中的上清，每孔加入100μl的cck8工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；
[0083]
④
在酶标仪上选择450nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。实验结果见图3a和b，实验结果显示：pc9对吉非替尼的ic50为6.798nm，pc9gr细胞对吉非替尼的ic50为11.79um；实验结果见图3c，实验结果显示：与pc9细胞相比，pc9gr细胞对阿霉素的耐药浓度也显著增加。
[0084]
实施例3 pc9gr细胞高表达cd44和耐药相关蛋白
[0085]
针对耐药非小细胞肺癌细胞pc9gr和非耐药非小细胞肺癌细胞pc9分别进行实验，
通过利用蛋白芯片对比了cd44和相关耐药基因在pc9和pc9gr细胞中的表达量。实验结果见图4，实验结果显示：在两种细胞株中均显示了cd44的表达，吉非替尼敏感株pc9相比，cd44在吉非替尼获得性耐药pc9gr细胞株中的表达量更高；cd166，aldh1a1和abcg2肿瘤干细胞标志物和间质细胞标志vimentin在pc9gr细胞中显著高表达，这些结果证实pc9gr细胞产生了emt,获得了肿瘤干细胞特性。
[0086]
实施例4 hl7
‑
ml2显著抑制吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌细胞pc9gr的增殖
[0087]
①
将吉非替尼耐药细胞pc9gr以5
×
103个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μl，培养24h，然后饥饿过夜；
[0088]
②
加入不同浓度梯度(7.5mm,5mm,2.5mm,1.25mm,0.625mm,0.3125mm,0.1562mm,0.0781mm)的hl7
‑
ml2多肽分别培养40小时；
[0089]
③
弃培养板中的上清，每孔加入100μl的cck8工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；
[0090]
④
在酶标仪上选择450nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。实验结果见图5，实验结果显示：不同浓度的hl7
‑
ml2短肽显著抑制胞pc9gr细胞的增殖活性；且显示呈现剂量依赖性，随着hl7
‑
ml2的提高，抑制活性也显著提高。
[0091]
实施例5 hl7
‑
ml2抑制pc9gr细胞的克隆形成能力，促进其凋亡
[0092]
①
将吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌细胞pc9gr以2000细胞/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1ml，培养24h，然后饥饿过夜；
[0093]
②
加入不同浓度梯度(5mm,2.5mm,1.25mm,0.625mm,0mm)的hl7
‑
ml2多肽分别培养12天；
[0094]
③
弃去细胞上清液，用pbs洗涤细胞两次，4％pfa固定10分钟；
[0095]
④
加入0.5％结晶紫工作液染色30分钟，拍照，分析结果。
[0096]
实验结果见图6，实验结果显示：hl7
‑
ml2短肽具有抑制pc9gr细胞的克隆形成能力，随着作用浓度的增高，抑制明效果非常明显。
[0097]
实施例6 hl7
‑
ml2抑制pc9gr细胞的迁移能力
[0098]
①
在六孔板中每孔接种3
×
105个细胞，每孔培养基体积为2ml；
[0099]
②
培养48小时后，用枪头在培养孔底划横线；
[0100]
③
吸去细胞上清液，用pbs洗2
‑
3次,去除划下的细胞；
[0101]
④
加入不同浓度梯度(5mm,2.5mm,1.25mm,0.625mm,0mm)的hl7
‑
ml2多肽(无血清培养基稀释多肽)，放入培养箱中培养；
[0102]
⑤
分别在24小时，48小时后取样拍照，观察细胞迁移性的变化。
[0103]
实验结果见图7，实验结果显示：hl7
‑
ml2短肽显著抑制pc9gr细胞的迁移能力。
[0104]
实施例7 hl7
‑
ml2抑制pc9gr细胞裸鼠皮下成瘤能力
[0105]
①
pc9gr细胞培养至对数生长期，胰酶消化并以pbs重悬为5.3
×
107/ml；
[0106]
②
取6
‑
8周龄裸鼠，对照组和组各5只，分别在腹股沟供血充足区域接种0.1ml细胞重悬液；
[0107]
③1‑
2月后或肿瘤大小达到1000mm3时，给药组尾静脉注射hl7
‑
ml2的pbs溶解液，药量为100mg/kg/天，对照组注射pbs；
[0108]
④
两周后处死小鼠，解剖取出肿瘤，检测大小；
[0109]
⑤
组织块石蜡切片做免疫组化，检测组织中ki67、cd44和caspase3表达量。
[0110]
实验结果见图8，实验结果显示：hl7
‑
ml2短肽显著抑制pc9gr细胞皮下成瘤能力，降低肿瘤cd44和ki67表达，增强凋亡相关的caspase3表达。