一种全集成核酸检测微流控芯片及使用方法

1.本发明属于核酸扩增检测技术领域，涉及一种全集成核酸检测微流控芯片及使用方法。


背景技术：

2.微流控，即控制微尺度下的流体。在20世纪80年代，微流控技术开始兴起，并在dna 芯片，芯片实验室，微进样技术，微热力学技术等方向得到了发展，成为分析科学的发展前沿。微流控芯片可以把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，例如免疫反应、核酸扩增与检测等，能自动完成分析全过程，极适合应用于病原体的临床检测。常规情况下，对于病原体进行核酸检测要通过以下几个步骤：一、将样本进行前处理，去除样本中的干扰物，将样本液化；二、利用核酸提取试剂盒，人工提取样本中包含的核酸；三、将提取出的核酸与扩增试剂混合，在一定条件下进行扩增反应；四、核酸检测。全步骤须检测人员身着洁净服在实验室通风橱内完成，步骤繁琐，效率低风险大。
3.全集成微流控芯片集核酸提取、扩增及检测为一体，应用于临床检测时，可完成液化样本的病原体核酸检测全步骤，快速分辨出病原体。芯片将病原体检测步骤整合为微量液体在各反应池之间的流动配合，芯片本身进行密闭封装，防止样本可能出现的气溶胶污染，同时降低检验人员染病风险。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明的目的在于提供一种全集成核酸检测微流控芯片及其使用方法；所述全集成核酸检测微流控芯片可将核酸提取、扩增及检测集成在一个密闭系统中，实现样本入，检测结果出。操作简易，可实现病原体核酸的自动化临床检测。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.一种全集成核酸检测微流控芯片，包括密封片1、盖片2及基片3三层结构，盖片2位于基片3和密封片1之间，通过密封片1与基片3将盖片2的两面贴合。
7.所述密封片1厚度小于0.3mm。
8.所述盖片2厚度在1
‑
2mm之间，其上设有油池4、进气孔8、进油孔11、蛇形通道12、通道、反应池和至少一个进样孔，通过进样孔为反应池进样，各反应池内储存液体试剂。所述油池4内预先注入矿物油，并放置磁珠，用于核酸提取，油池4覆盖裂解池5、清洗池a6 和清洗池b 7，其中裂解池5、清洗池a 6和清洗池b 7依次连通，且清洗池b 7与洗脱池9 连通。所述反应池包括用于核酸洗脱的洗脱池9，用于核酸扩增的扩增池10，以及用于容纳废液的废液池14。所述进气孔8用于为芯片通道内的液体流动提供动力，使液体能够顺畅流动，其一端与通道连接，另一端与外部仪器(气泵)连接；进气孔8通过通道，与洗脱池9、扩增池10、检测小池13和废液池14依次连接；所述蛇形通道12覆盖所述检测小池13，蛇形通道12一端连接进油孔11，另一端连接废液池14。所述进油孔11一端与外部仪器(油泵)连接，另一端与通
道连通，用于进油，隔绝空气。
9.所述基片3厚度在1.5
‑
3mm之间，其上设有反应池和至少一个用于核酸检测的检测小池。所述的反应池内放置试剂，包括用于样本核酸提取的裂解池5、清洗池a 6和清洗池b 7。所述检测小池13内部放置冻干试剂，用于待检测样品的检测。
10.进一步的，所述扩增池10内设有搅拌子，使反应溶液充分混合，保证检测结果准确。
11.进一步的，所述洗脱池9与扩增池10之间的通道尺寸小于300x300μm(长x宽)。
12.进一步的，所述扩增池10和蛇形通道12之间的通道尺寸小于300x300μm(长x宽)。
13.进一步的，裂解池5内放置有裂解液(vazyme rm101
‑
ab)、清洗池a6内放置有清洗液 a(vazyme rm101
‑
ad)、清洗池b 7内放置清洗液b(vazyme rm101
‑
ae)、洗脱池9内放置洗脱液(vazyme rm101
‑
af)、检测小池13内放置有检查试剂(lamp kit)。
14.一种全集成核酸检测微流控芯片的使用方法，包括以下步骤：
15.步骤1，反应池内根据需要放置试剂，用户先将反应池的进样孔刺破，将液化样本滴入反应池内，随即用一小片密封片封住进样孔。待样本与试剂发生反应后，得到处理后样品。
16.步骤2，利用磁铁移动油池4预先放置的磁珠，使其依次通过裂解池5、清洗池a 6和清洗池b 7和洗脱池9，磁珠在各反应池各停留1分钟，最终在洗脱池9内将磁珠上吸附的目标核酸洗脱下来，得到混合了目标核酸的洗脱液。
17.步骤3，外部仪器气泵通过进气孔8推动混合目标核酸的洗脱液进入扩增池10，与扩增池10内的试剂混合后得到待检测溶液。再次通过气泵推动待检测液体进入蛇形通道12内的检测小池13。
18.步骤4，外部仪器油泵通过进油孔11向通道内注油，将通道密封，隔绝空气。
19.步骤5，采用密封片密封进气孔8和进油孔11，升温至65℃，恒温加热芯片检测小池13，反应数分钟后得到检测结果。
20.进一步的，步骤5中反应时间小于一小时。
21.本发明将病原体检测步骤，简化为磁珠在各反应池之间的移动与微量液体的转移。芯片采用了磁铁控制和气泵控制，实现了样品自动化检测的全过程。
22.本发明的有益效果如下：
23.(1)密封性好。本发明通过设置密封片和废液池，保证了核酸检测过程所需的密封条件，降低了样本受外界污染的可能性，降低了检测人员检测风险。
24.(2)集成了核酸检测全过程，包含核酸提取、扩增和检测，集成了检测过程所需的所有试剂，简化了检测步骤并提高了检测效率。
附图说明
25.图1是一种全集成核酸检测微流控芯片的结构主视图。
26.图2是一种全集成核酸检测微流控芯片的结构俯视图。
27.图中：1密封片，2盖片，3基片，4油池，5裂解池，6清洗池a，7清洗池b，8进气孔，9洗脱池，10扩增池，11进油孔，12蛇形通道，13检测小池，14废液池。
具体实施方式
28.为了更清楚的说明本发明中的检测方案，下面结合附图及实施例对本发明进行进一步说明。
29.下述技术方案中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述技术方案中所使用的材料和试剂均可通过商业途径获得。
30.本发明全集成核酸检测微流控芯片，包括密封片1、盖片2及基片3三层结构，盖片2 位于基片3和密封片1之间。
31.主体部分包括基片2和盖片3可采用注塑成型方式，材料为环烯烃类共聚物，也可采用机加工成型方式，材料为聚碳酸酯(pc)。密封片1采用切割成型，材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)。密封片1厚度为0.2mm，盖片2厚度为1.5mm，基片3厚度为2mm，盖片2 与密封片1、基片3采用化学双面胶粘接方式结合。
32.所述盖片2厚度在1
‑
2mm之间，其上设有油池4、进气孔8、进油孔11、蛇形通道12、通道、反应池和进样孔，通过进样孔为反应池进样。所述油池4内预先注入矿物油，并放置磁珠，用于核酸提取，油池4覆盖裂解池5、清洗池a 6和清洗池b 7，其中裂解池5、清洗池a 6和清洗池b 7依次连通，且清洗池b 7与洗脱池9连通。所述反应池包括用于核酸洗脱的洗脱池9，用于核酸扩增的扩增池10，以及用于容纳废液的废液池14。所述进气孔8用于为芯片通道内的液体流动提供动力，使液体能够顺畅流动，其一端与通道连接，另一端与外部仪器连接；进气孔8通过通道，与洗脱池9、扩增池10、检测小池13和废液池14依次连接；所述蛇形通道12覆盖所述检测小池13，蛇形通道12一端连接进油孔11，另一端连接废液池14。所述进油孔11用于进油，隔绝空气。所述基片3上设有反应池和至少一个用于核酸检测的检测小池。所述的反应池内放置试剂，包括用于样本核酸提取的裂解池5、清洗池a 6和清洗池b 7。所述检测小池13内部放置冻干试剂，用于待检测样品的检测。
33.洗脱池9与扩增池10之间，以及扩增池10和蛇形通道12之间的通道尺寸为150x150μ m。
34.所述反应池中，裂解池5内放置有裂解液(vazyme rm101
‑
ab)、清洗池a6内放置有清洗液a(vazyme rm101
‑
ad)、清洗池b 7内放置清洗液b（vazyme rm101
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ae）、洗脱池9内放置洗脱液(vazyme rm101
‑
af)、检测小池13内放置有检查试剂( lamp kit)。所述检测小池13内设有冻干的引物，用石蜡密封后固定在池底部。
35.所述废液池14顶端的疏水透气膜为孔径0.22μm的聚四氟乙烯膜(ptfe)，采用化学双面胶粘接方式结合。
36.基于上述的微流控芯片，一种全集成核酸检测微流控芯片的检测方法，包括以下步骤1
‑
6。
37.步骤1，刺破裂解池5进样孔，滴入2μl液化样本与1μl蛋白酶k，再用小片密封片密封进样孔。
38.步骤2，待溶液反应3分钟后，移动油池4内磁珠依次通过裂解池5、清洗池a 6、2 7 和洗脱池9，在各反应池中停留1分钟，最终将吸附的核酸洗脱下来。再移动回油池4，使磁珠不影响后续反应。
39.步骤3，刺破进气孔8，连接外部气泵，第一次加压移动洗脱池9内溶液至扩增池10，并与反应溶液充分混合，得到待检测溶液。
40.步骤4，刺破废液池14出气孔，贴上疏水透气膜，目的是透气不透水。第二次加压，将待检测溶液转移至检测小池13。
41.步骤5，刺破进油孔11，连接外部油泵，注液态石蜡油将通道密封。
42.步骤6，用小片密封片密封进气孔8和进油孔11，65℃恒温加热芯片检测小池部分，反应40分钟后，利用荧光检测设备进行检测分析。
43.以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。