小麦TaLCT1基因沉默在调控小麦耐镉胁迫中的应用

小麦talct1基因沉默在调控小麦耐镉胁迫中的应用
技术领域
1.本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及小麦talct1基因沉默在调控小麦耐镉胁迫中的应用。


背景技术：

2.随着矿产资源的大量开发利用、工业的快速发展、农业污水灌溉及化肥农药的大量使用，农田土壤重金属污染日益严重，重金属铅、锌、镉的超标率分别占无机污染物点位超标率的1.5%、7.0%和0.9%，其中重金属镉（cd）因其相对稳定的价态和较高的毒性尤为突出。联合国环境规划署也将镉列为12种具有全球性意义的危险化学物质中的第1位危险物质。由此可见镉污染在全球范围内的影响和重视。镉作为非必需营养元素，通过损伤植物呼吸作用、光合作用和营养代谢等使植物表现出养分和水分的吸收受抑制、根系生长受阻碍、呼吸强度和光合强度下降、碳水化合物代谢失调及其他一系列生理代谢紊乱，从而强烈抑制植物生长，使得生长量和产量下降，甚至导致植物死亡。另外，积累在植物体内的镉通过食物链传递进入动物和人体，影响钙、磷吸收代谢，造成骨痛等疾病，而且影响造血系统、引发贫血、造成肾损害肾功能紊乱等，从而引发糖尿、蛋白尿、氨基酸尿、肺气肿以及高血压等病症，严重者甚至引起突变、畸形和癌症，对人体健康造成巨大威胁。
3.小麦是对cd耐受性较强的植物之一，对酸性土壤和灌溉水中低浓度的cd具有很高的富集效率，能在根系、茎秆和籽粒中进行累积。目前关于植物耐 cd 机制的研究表明，植物可通过区域化、固定钝化及形成金属硫蛋白、植物螯合肽、应急作用、排外作用等来抵抗或减弱 cd 的毒害程度。目前已鉴定的金属阳离子运载蛋白家族主要有 cdf 家族、zip 家族、nramp家族、重金属 atpases 家族、abc 转运蛋白家族以及低亲和性阳离子转运蛋白(low
‑
affinity cation transporter, lct) 等。研究发现，在酵母表达系统中，lct1 是一种非选择性的阳离子转运蛋白，不仅能够介导 k + 的转运，还能转运 na
+ 、rb
+ 、ca
2+ 、cd 2+
等其他离子，而对 na
+ 、rb
+ 和 ca
2+ 的转运为低亲和性）。


技术实现要素：

4.迄今，在小麦中，尚未报道talct1基于在小麦耐镉方面的作用。研究talct1基因提高植物耐镉的应用，可以更加深入揭示小麦的耐镉性机理，为提高小麦耐受镉能力以及降低籽粒中的镉含量提供理论基础。
5.针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种利用小麦talct1基因（来自小麦品种百农207）提高植物耐镉能力的方法，经过实验表明，沉默talct1基因可以有效提高小麦的耐镉能力。
6.本发明的目的在于提供一种小麦talct1基因沉默在调控小麦耐镉胁迫中的应用。
7.基于上述目的，本发明采用如下技术方案：本技术请求保护的第一个方案是：一种talct1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.本技术请求保护的第二个方案是：一种由上述talct1基因表达的talct1蛋白，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
9.与上述的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；或者，在上述的蛋白质的n端和/或c端连接如表1所示的标签后得到的融合蛋白也属于本技术所述的talct1蛋白范围之内。
10.表1 标签的序列标签残基序列poly
‑
arg5
‑
6(通常为5个)rrrrrpoly
‑
his2
‑
10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep
‑
tagii8wshpqfekc
‑
myc10eqkliseedl本技术请求保护的第三个方案是：一种talct1基因的rna干扰片段，其cdna的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述talct1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。所述rna干扰片段的由以下方法制得：以小麦的cdna为模板,获得针对如seq id no.1所示的基因的ran干扰片段，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.本技术还请求保护一种含有方案三所述的rna干扰片段的载体。
12.进一步地，上述载体以ptck303为骨架载体。
13.进一步地，在上述载体中，所述rna干扰片段为正向插入片段和/或反向插入片段。
14.上述载体由以下方法获得：，包括以下步骤：（1）设计扩增引物，扩增引物为talct1
‑
f:5
‑
ggggtaccactagtctctcgtgaaagactcgc
‑
3talct1
‑
r:5
‑
cgggatccgagctctcggggaagcaggaccaa
‑
3；（2）以小麦的cdna为模板，获得talct1基因的rnai片段（rna干扰片段），进行pcr扩增反应；（3）将步骤（2）获得的带酶切位点的pcr产物与ptck303载体片段进行第一次酶切和连接，利用大肠杆菌转化，获得重组质粒ptck303
‑
talct1
‑
1；（4）将步骤（3）获得的ptck303
‑
talct1
‑
1进行第二次酶切和连接，利用大肠杆菌转化，获得talct1基因沉默的重组载体gv3101。
15.本技术还请求保护上述talct1基因或rna干扰片段或载体在调控小麦耐镉胁迫中的应用。
16.本技术还请求保护上述talct1基因或rna干扰片段或载体在创制耐镉转基因小麦植株、培育耐镉小麦品种或提高小麦耐镉性中的应用。
17.本发明通过rna干扰片段构建了基因沉默载体，抑制小麦中talct1基因的表达，使talct1基因沉默，提高小麦耐镉性能。经过镉处理后，野生型小麦植株和talct1基因沉默株系的表型发生了显著性的差异，talct1基因沉默株系（培养条件一致）的株高显著性高于野生型（wt）植株且长势更好，分别是对照的1.51倍、1.58倍；talct1
‑
rnai株系根长分别是对照的1.51、1.78倍。与wt对照相比，talct1
‑
rnai株系叶片受损程度较轻，出现黄化和萎蔫的
现象较少，分蘖较多；而wt小麦的叶片受损严重，明显卷曲萎蔫，叶片黄化生长停滞，说明沉默talct1基因的可提高小麦的镉耐性。
附图说明
18.图1是野生植株和被侵染转化的阳性小麦植株的gus染色状态图；图2是被侵染转化的阳性小麦的pcr鉴定结果图，1
‑
11为被侵染转化的阳性小麦的pcr产物的特异性条带，12为野生型小麦；图3是野生植株和被侵染转化的阳性小麦植株的qrt
‑
pcr分析结果图；图4是野生型小麦与talct1基因沉默小麦在镉胁迫下的生长状态对比图；图5 野生型小麦与talct1基因沉默小麦株高和根长的统计图。
具体实施方式
19.以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括rna提取和反转录、pcr扩增、pcr产物及载体的酶切、连接、转化感受态大肠杆菌等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (sambrook j ，russell dw，janssen k ,argentine j .黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
20.供试材料、ptck303载体和基因1 .植物材料：小麦品种百农207，选取提取幼苗期小麦叶片，开始浸染实验。
21.2.骨架载体：ptck303载体。
22.3 .沉默目的基因：小麦talct1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，来源于小麦基因组数据。
23.一种利用小麦talct1基因提高植物耐镉胁迫能力的方法，所述方法具体为在小麦中沉默talct1基因表达。
24.实施例1 构建talct1基因沉默重组载体构建talct1基因沉默重组载体的方法，其步骤如下：1.1提取小麦叶片总rna，反转录为cdna。
25.1.2以步骤1.1得到的cdna为模板，其核苷酸序列如seq id no.2所示，选取针对talct1基因的rnai片段，用引物talct1
‑
f和talct1
‑
r进行pcr扩增，得到带酶切位点的pcr产物；所述引物为talct1
‑
f:5
‑
ggggtaccactagtctctcgtgaaagactcgc
‑
3talct1
‑
r:5
‑
cgggatccgagctctcggggaagcaggaccaa
‑
3 。
26.1.3将pcr产物分两步构建到ptck303载体上。第一次用spe i（限制性内切酶）和sac i（限制性内切酶）酶切ptck303质粒和带酶切位点的talct1的rnai片段（pcr产物），酶切体系如下：ptck303/talct1
ꢀꢀꢀꢀꢀ
10μl10
×
quickcut buffer
ꢀꢀ
2μlspe i
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μlsac i
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μlddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
to 20μl
37℃反应20min后，凝胶电泳胶回收目的片段。
27.1.4采用t4连接酶将步骤1.3中得到的pcr片段与载体片段连接，具体体系如下：pcr片段酶切产物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3μlptck303酶切产物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl10
×
t4 dna ligase buffer
ꢀꢀꢀ
1μlt4 dna ligase
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μlddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
to 10μl16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化。
28.1.5质粒提取：将步骤1.4中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取，命名为ptck303
‑
talct1
‑
1。
29.1.6将步骤1.5提取的ptck303
‑
talct1
‑
1质粒和带酶切位点的talct1的rnai片段（pcr产物）用bamh i和kpn i进行第二次酶切，酶切体系如下：ptck303
‑
talct1
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀ
10μl10
×
quickcut buffer
ꢀꢀ
2μlbamh i
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μlkpn i
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μlddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
to 20μl。
30.1.7 采用t4连接酶将步骤1.6中得到的pcr片段与载体片段连接，具体体系如下：pcr片段酶切产物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3μlptck303
‑
talct1
‑
1酶切产物
ꢀꢀ
1μl10
×
t4 dna ligase buffer
ꢀꢀ
1μlt4 dna ligase
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μlddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
to 10μl16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化，提取质粒。
31.1.8将步骤1.7提取得到得到的质粒进行根瘤农杆菌gv3101转化，获得gv3101重组载体。
32.实施例2 对小麦进行农杆菌侵染转化采用实施例1制得的gv3101重组载体对小麦进行农杆菌侵染转化，其步骤为：2.1将根癌农杆菌接种于 lb 固体将根癌农杆菌在培养基平板上活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5ml含有20mg
·
l
‑1利福平和50mg
·
l
‑1卡那霉素的lb液体培养基中，在温度26℃、振荡转速160
‑
200rpm的条件下，培养5
‑
8小时，然后取1ml转接于50ml含有20mg
·
l
‑1利福平、50mg
·
l
‑1卡那霉素和110umol
·
l
‑1乙酰丁香酮的lb液体培养基中，在温度26℃、振荡转速160
‑
200rpm的条件下，培养12
‑
16小时后，a600值为0.75
‑
1.0备用；2.2挑选饱满的小麦种子，纱布包裹，自来水快速冲洗干净后，用70%乙醇浸泡2分钟，再用0.1%升汞（氯化汞）浸泡3
‑
5分钟，期间不断搅拌，保证所有种子表面均达到灭菌效果，然后用无菌水洗涤5
‑
6次，准备侵染用；2.3小将经消毒灭菌的成熟小麦种子转入到制备好的根癌农杆菌菌液的无菌三角
瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没小麦种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，在温度26℃、振荡转速160
‑
200rpm的条件下，振荡培养10
‑
12小时；从摇床中取出置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次，25℃黑暗条件下，共培养3天；共培养是在无菌水中加入110umol
·
l
‑
1乙酰丁香酮，ph值5.83
‑
5.85组成；2.3将共培养后的小麦种子转接到压力筛选培养1个月，获得抗性植株；压力筛选培养是由无菌水中加入250mg
·
l
‑1cef和25mg
·
l
‑1潮霉素组筛选之后成活的抗性植株接种于生根培养基上进行生根及扩繁，置于光照强度为2000lx，光照时间为12day/8night的人工气候箱中培养30
‑
40天；生根培养基由1/2ms固体培养基加入250mg
·
l
‑1cef和25mg
·
l
‑1潮霉素组成；2.4获得的植株的根长达10cm左右时，用镊子将苗夹出，移栽到花土中，移栽之后第1
‑
2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，温室培养，收获种子。
33.实施例3 转基因植株的鉴定以实施例2收获的种子培育转化后小麦植株，待转化后的小麦植株长至三叶一心时，剪取幼嫩的单株叶片分别放入0.2ml灭菌离心管，并进行对应标识，然后加入gus染色液以淹没植株叶片为准，37℃保温箱放置6
‑
12h，先后用50%，75%，100%乙醇漂洗样品，每次浸泡5min，然后加入100%乙醇浸泡至完全脱色，在体视显微镜下观察gus表达情况，并进行拍照记录。如图1所示，野生对照没有蓝色，而转化株2、3、4均能被染成蓝色，表明目的基因已整合至这几个植株的基因组中。
34.为进一步鉴定阳性植株，利用ctab法提取gus染色为蓝色的阳性植株dna，采用talct
‑
test
‑
f：gacgcacaatcccactatcc与talct
‑
test
‑
r：atggctgtccactcctattcc进行特异性pcr，鉴定阳性苗。结果发现转化小麦1
‑
11的pcr产物大小与预期大小相符，野生型小麦12没有特异性条带（图2），结果表明所鉴定单株均为阳性株。
35.利用qrt
‑
pcr技术检测talct1基因的表达情况。结果如图3所示， 相对于wt，t2
‑
1、t2
‑
2两个阳性转基因植株中talct1基因的表达量显著性下降，分别下降了36.4%、85.9%，表明talct1在转基因植株中被有效沉默，而在对照株系中正常表达。
36.实施例4 转基因小麦耐镉性的评价将野生型与talct1基因沉默小麦种子用0.5% naclo 溶液灭菌 20 min 后再用无菌水反复冲洗后，用 50 ml 蒸馏水浸种 12 h 后将种子摆放于铺有 2 层滤纸的发芽盒内，培养箱内进行培养至三叶期，培养箱条件为光照 12 h、25 ℃;黑暗12 h、25 ℃。培养结束后，100mg/kg cdcl2处理14天（镉胁迫过程）。分别测量野生型与talct1基因沉默小麦株高和根长。
37.从图4和图5可以看出，经过镉处理后，两者的表型发生了显著性的差异，talct1基因沉默株系（培养条件一致）的株高显著性高于wt植株且长势更好，分别是对照的1.51倍、1.58倍；talct1
‑
rnai株系根长分别是对照的1.51、1.78倍。与wt对照相比，talct1
‑
rnai株系叶片受损程度较轻，出现黄化和萎蔫的现象较少，分蘖较多；而wt小麦的叶片受损严重，明显卷曲萎蔫，叶片黄化生长停滞。说明沉默talct1基因的可提高小麦的镉耐性。
38.对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。