一种核桃叶片内生生防细菌及其制备方法和应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种核桃叶片内生生防细菌及其制备方法和应用。


背景技术：

2.核桃(juglans regia)是我国重要的木本油料作物。由胶孢炭疽菌引起的炭疽病和层出镰刀菌引起的叶枯病侵染叶片会造成大面积叶片枯死，严重影响树体光合作用和树体营养的积累。目前对这两种病害的防治多集中在化学防治，本发明人在近期的研究中发现exiguobacterium acetylicum对层出镰刀菌和胶孢炭疽菌孢子萌发和菌丝生长具有显著的抑制作用，而该菌在在抗真菌活性在核桃叶部病害中未见报道。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是提供一种核桃叶片内生生防细菌及其制备方法和应用，该细菌安全性高，能够有效防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病。
4.本发明的技术方案如下：一种核桃叶片内生生防细菌，所述核桃叶片内生生防细菌属于微小杆菌属，所述核桃叶片内生生防细菌的保藏号为cgncc no:22703。所述核桃叶片内生生防细菌作为一种微生物，能够有效防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病，无农药残留问题，安全性高。
5.一种核桃叶片内生生防细菌的制备方法，包括如下步骤：s1.将核桃叶清洗除杂后进行表面消毒，在无菌研钵中研磨成匀浆；s2.在匀浆中加入无菌生理盐水，取稀释液均匀涂布于无菌lb平板培养基上，重复多次后，于25
‑
30℃的培养箱中倒置培养；s3.待菌落长成后，选取大小、光泽、颜色、透明度、形状不同的单菌落，在无菌lb平板培养基上划线，于25
‑
30℃的培养箱中倒置培养；s4.观察菌落形态，继续挑选单菌落划线培养直至纯化。
6.进一步的，步骤s1中，表面消毒的具体操作为：用无菌水冲洗表面，无菌滤纸吸去水分，将叶片在75%的乙醇水溶液中浸泡5
‑
10 s，晾干后浸入0.1%氯化钠溶液中表面消毒5
‑
10 min，无菌水冲洗干净。
7.进一步的，所述lb平板培养基包括胰蛋白胨5
‑
10 g、酵母粉5
‑
10 g、氯化钠8
‑
12g和琼脂18
‑
20 g，蒸馏水定容至1000ml。
8.进一步的，步骤s2中，匀浆与生理盐水的体积比为1:9
‑
10。
9.一种所述的核桃叶片内生生防细菌在制备防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病的药物中的应用。
10.进一步的，所述防治核桃炭疽病或核桃叶枯病为拮抗核桃炭疽病的病原菌或层出镰刀菌。
11.一种药物制剂，包括所述的核桃叶片内生生防细菌。
12.进一步的，所述药物制剂为所述核桃叶片内生生防细菌的发酵液。
13.进一步的，所述药物制剂在使用时，所述核桃叶片内生生防细菌的使用浓度为1
×
107cfu/ml
‑1×
109cfu/ml。
14.一种药物制剂的制备方法，包括以下步骤：培养所述的核桃叶片内生生防细菌，收集培养液，得到药物制剂。
15.进一步的，所述药物制剂的制备方法具体为：挑纯培养的单菌落置于液体lb培养基中，在温度25
‑
35℃、摇床条件下，黑白交替培养各12h，收集培养液即可。
16.一种所述的药物制剂或者由所述的制备方法制备而成的药物制剂在防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病中的应用。
17.进一步的，所述核桃叶片内生生防细菌的使用方法为：将所述核桃叶片内生生防细菌制成菌悬液后喷施于植物叶片上。
18.进一步的，所述核桃叶片内生生防细菌的使用方法为：将所述药物制剂喷施于植物叶片上。
19.本发明具有如下有益效果：本发明核桃叶片内生生防细菌作为一种微生物，能够有效防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病，生产使用成本低，无残留，安全性高，绿色环保，防治效果好。
附图说明
20.图1为本发明tl1菌株的菌落形态。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
22.在一具体实施方式中，核桃叶片内生生防细菌exiguobacterium acetylicum（tl1）菌株已于2021年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所；保藏号为cgncc no:22703。
23.上述核桃叶片内生生防细菌exiguobacterium acetylicum（tl1），能够有效防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病。
24.tl1菌株的制备方法包括以下步骤：s1.将核桃叶清洗除杂后进行表面消毒，消毒后在无菌研钵中研磨成匀浆；表明消毒的具体操作为：用无菌水冲洗表面，无菌滤纸吸去水分，将叶片在75%的乙醇水溶液中浸泡10 s，晾干后浸入0.1%氯化钠溶液中表面消毒5 min，无菌水冲洗5次；s2.在10ml匀浆中加入90ml无菌生理盐水，取稀释液均匀涂布于无菌lb平板培养基上，重复3次后，于28℃的培养箱中倒置培养；lb平板培养基包括蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g和琼脂20 g，蒸馏水定容至1000 ml；s3.待菌落长成后，选取大小、光泽、颜色、透明度、形状不同的单菌落，在无菌lb平板培养基上划线，于28℃的培养箱中倒置培养；s4.观察菌落形态，继续挑选单菌落划线培养直至纯化，菌落形态如图1所示。
25.exiguobacterium acetylicum在lb培养基在27℃下培养3天，在27℃下培养3天，颜色为橙粉色，细胞圆球状,在直角两个平面交替分裂形成四联状,一般细胞成对生,单生者罕见,不成链状排列。革兰氏阳性,不运动,兼性厌氧。利用its1/its4扩增tl1菌株的16srrna基因获得的序列在ncbi公共数据库的序列号为mz350224此序列是鉴定该菌株的分子特征依据，tl1菌株的16s rdna核苷酸序列长度为1448bp，具体序列如下：gctatacatgcaagtcgagcgcaggaagctgacggaactcttcggagggaaggcagtggaatgagcggcggacgggtgagtaacacgtaaggaacctgcctcaaggattgggataactccgagaaatcggagctaataccggatagttcaacggaccgcatggtccgctgatgaaaggcgctccggcgtcaccttgagatggccttgcggtgcattagctagttggtggggtaacggcccaccaaggcgacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgtaagggaagaacacgtacgagaggaaatgctcgtaccttgacggtaccttacgagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggccttttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggccattggaaactggaaggcttgagtacagaagagaagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtgggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggggggtttccgcccctcagtgctgaagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaactcttgacatcccattgaccgcttgagagatcaagttttcccttcggggacaatggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatccttagttgccagcattcagttgggcactctagggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgagttgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggcagcgagaccgcgaggtggagccaatcccataaagccgttcccagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaggtcagcatactgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagccggtgaggtaaccgtaaggagccagccgtcgaaggtgg将测序获得的序列在genbank中进行blast序列相似性比对，结果与乙酰微小杆菌（exiguobacterium acetylicum）的16s rdna核苷酸序列同源性最高。
26.将上述核桃叶片内生生防细菌应用于制备防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病的药物制剂；药物制剂的制备方法，包括以下步骤：将tl1菌株置于液体lb培养基中，在温度30℃、摇床条件下，黑白交替培养各12h，收集培养液，即得药物制剂。
27.一．测试拮抗细菌对孢子萌发的影响参考方中达《植病研究方法》，在“u”形载玻片中央滴20 μl浓度为1
×
10
7 cfu/ml的tl1菌株的孢子悬浮液，孢子悬浮液和拮抗细菌菌悬液按1:1的比例混合为处理，以加无菌水为对照，盖好盖玻片，底部保湿，放置在28 ℃人工培养箱中培养，24 h后检查孢子萌发
情况；孢子萌发率=(萌发孢子个数/总孢子个数)
×
100%；孢子萌发抑制率=(对照孢子萌发数－处理孢子萌发数)/对照孢子萌发数
×
100%；测试结果见表1。
28.二．测试拮抗细菌对病原菌菌丝生长的影响涂布平板法：在pda平板上均匀涂布tl1菌株悬浮液，平板中央接入直径为8 mm的已活化5 d的病原菌菌饼，28 ℃培养箱中培养7 d，用十字交叉法测得其病原菌菌落直径，以涂布无菌水为对照，对照和处理各5个重复；菌丝生长抑制率=(对照组病原菌菌落直径－处理组病原菌菌落直径)/对照组病原菌菌落直径
×
100%；测试结果见表1。
29.表1：可见，tl1对层出镰刀菌和胶孢炭疽菌分离株具有较强的抑制活性，菌丝生长抑菌率达到50.51％和52.70%，说明tl1对层出镰刀菌分离株病原菌有明显抑制菌丝生长的作用。孢子萌发抑制率分别为32.58和33.61，tl1对两种病原菌孢子萌发具有明显抑制率。
30.三.测试tl1菌株对叶片的影响每组选用长势一致的10株核桃苗，每株5个重复共50片叶进行实验。叶片消毒：75%的酒精棉球擦拭叶片，后用无菌水冲洗叶片直至叶尖有水珠流下，待叶面水分干后采用针刺法对叶片造成伤口便于菌体进入组织。病原菌采用平板培养五天的新鲜菌盘（0.5mm2）接菌后进行保湿，拮抗菌悬浮液560nm处od值为1.014，于病原菌侵入24h后喷于接菌部位，七天后调查发病率及病情指数。
31.活体叶片抑菌试验结果见下表：可见，tl1对层出镰刀菌发病率与对照组相比降低了13.51%，防治效果为55.2%。
32.本发明核桃叶片内生生防细菌安全性高，能够有效防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病，生产使用成本低，无残留，安全性高，绿色环保，防治效果好。