一种富含一丁酸二月桂酸甘油酯的制备及应用的制作方法

1.本发明涉及油脂合成技术领域，具体而言，涉及一种富含一丁酸二月桂酸甘油酯的制备及应用。


背景技术：

2.与天然油脂相比，结构酯通常因其特殊的空间排布和脂肪酸组成而具有新的营养价值和功能特性。在现有的结构酯中，长
‑
长链脂肪酸结构酯和中
‑
长链脂肪酸结构酯最为常见，例如：
3.授权申请号为cn201811020098的发明专利公开了一种以高油酸花生油和棕榈硬酯为原料通过醇解或中压水解以及酶法合成的富含opo结构脂的混合酯的制备方法。
4.公开申请号为cn201711337291的发明专利，反应原料为长链甘油三酯、中链甘油三酯(质量比＝6.4:2～10),反应温度为45～80℃,真空状态下搅拌反应1～10h,固定化脂肪酶为催化剂，最终获得中长链结构酯。
5.这些结构酯已经被发现具有提高营养价值、降低热量、减少脂肪积累、提高免疫力和维持集体内环境平衡等功能。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种富含一丁酸二月桂酸甘油酯的制备及应用。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明实施例提供了一种脂肪酸结构酯，所其包括以下组分：月桂酸、一丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯、一丁酸一月桂酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、一丁酸二月桂酸甘油酯以及三月桂酸甘油酯。
9.第二方面，本发明实施例提供了一种用于制备如前述实施例所述的脂肪酸结构酯的方法，所述方法包括：采用三丁酸甘油酯和月桂酸混合反应。
10.第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的脂肪酸结构酯或如前述实施例所述的方法制备的脂肪酸结构酯在制备用于促进肠道健康的产品中的应用。
11.第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的脂肪酸结构酯或如前述实施例所述的方法制备的脂肪酸结构酯在制备用于调节肠道微生物菌群的产品中的应用。
12.第五方面，本发明实施例提供了一种促进肠道健康的产品，其包括如前述实施例所述的脂肪酸结构酯或如前述实施例所述的方法制备的脂肪酸结构酯。
13.本发明具有以下有益效果：
14.本发明提供了一种新的脂肪酸结构酯，是一种中短链的脂肪酸结构酯，富含一丁酸二月桂酸甘油酯，该结构酯具有缓释特质，将其作用于消化环境，被脂肪酶进行消化时，具有缓慢释放单月桂酸甘油酯的特点，缓慢释放的单月桂酸甘油酯协同消化后释放的丁酸能为肠道微生物的迅速(24小时内)调节起到更加积极且持续的作用，为维持肠道健康提供了一种新的途径。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
16.图1为实施例2中的静态消化中丁酸含量的变化；其中，a为模拟胃消化中丁酸含量的变化；a`为模拟肠消化中丁酸含量的变化；m
lbl
表示与s
lbl
具有相同脂肪酸组成的三丁酸甘油酯和三月桂酸甘油酯的物理混合物；s
lbl
表示实施例1提供的丁酸月桂酸结构酯，每个时间点样品重复数＝3，结果以平均值
±
标准差表示；
17.图2为实施例2中的静态消化中gml含量的变化；其中，a为模拟胃消化中gml含量的变化；a`为模拟肠消化中gml含量的变化；m
lbl
表示与s
lbl
具有相同脂肪酸组成的三丁酸甘油酯和三月桂酸甘油酯的物理混合物；s
lbl
表示实施例1提供的丁酸月桂酸结构酯，每个时间点样品重复数＝3，结果以平均值
±
标准差表示；
18.图3为实施例2中的小鼠模型中丁酸含量的变化；其中，a为不同肠道部位，不同取样时间点的肠道内容物中丁酸含量的变化；大写字母显示某一取样时间点不同肠道部位的内容物中丁酸含量的差异，不同字母表示有显著差异(p＜0.05)，小写字母显示某一肠道部位不同的灌胃时间点肠道内容物中丁酸含量的差异，不同字母表示有显著差异(p＜0.05)，结构酯和物理混合分开比较；b为灌胃8h后结肠内容物中的丁酸含量；****表示p＜0.0001；m
lbl
表示三丁酸甘油酯和三月桂酸甘油酯的物理混合物；s
lbl
表示实施例1提供的丁酸月桂酸结构酯；数字下标
‘‑
1，
‑
2，
‑
4，
‑8’
分别表示灌胃后1，2，4，8小时的样品，每个时间点样品重复数＝6，结果以平均值
±
标准差表示；
19.图4为实施例2中的小鼠模型中gml含量的变化；其中，a为不同肠道部位，不同取样时间点的肠道内容物中gml含量的变化，大写字母显示某一取样时间点不同肠道部位的内容物中丁酸含量的差异，不同字母表示有显著差异(p＜0.05)，小写字母显示某一肠道部位不同的灌胃时间点肠道内容物中丁酸含量的差异，不同字母表示有显著差异(p＜0.05)，结构酯和物理混合分开比较；b为灌胃1h后空肠内容物中的gml含量，****表示p＜0.0001,**表示p＜0.01；c为灌胃2h后空肠内容物中的gml含量，****表示p＜0.0001,***表示p＜0.001；d为灌胃4h后空肠内容物中的gml含量，***表示p＜0.001；m
lbl
表示三丁酸甘油酯和三月桂酸甘油酯的物理混合物；s
lbl
表示实施例1提供的丁酸月桂酸结构酯；p＜0.05视为有显著差异，p＜0.1视为有显著趋势，数字下标
‘‑
1，
‑
2，
‑
4，
‑8’
分别表示灌胃后1,2,4,8小时的样品。每个时间点样品重复数＝6，结果以平均值
±
标准差表示；
20.图5为实施例3中的灌胃24h后小鼠盲肠肠道微生物变化；其中，a为梭菌属丰度；b为candidatus_arthromitus属丰度；c为cc
‑
115属丰度；d为未识别的梭菌属丰度；*表示p＜0.05视为有显著差异，p＜0.1视为有显著趋势。
具体实施方式
21.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。
22.首先，本发明实施例提供了一种脂肪酸结构酯，所其包括以下组分：月桂酸、一丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯、一丁酸一月桂酸甘油酯、二丁酸一月桂酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、一丁酸二月桂酸甘油酯以及三月桂酸甘油酯。
23.丁酸是一种短链脂肪酸，在体内通常由肠道微生物(例如梭菌、放线菌和拟杆菌等)通过发酵难消化多糖产生，但是其游离状态或之酯化状态在胃中常被大量消化，难以达到其发挥作用的肠道部位。
24.月桂酸是一种中链脂肪酸，月桂酸及其甘油酯被证明具有调节糖脂代谢、改善肠道微生物结构和促进动物生长等功能。
25.因此，本技术提供的脂肪酸结构酯是一种中短链脂肪酸甘油酯，富含一丁酸二月桂酸甘油酯，该脂肪酸结构酯具有缓释特质，将其作用于消化环境，被脂肪酶进行消化时，具有缓慢释放单月桂酸甘油酯的特点，为肠道微生物的调节起到更加积极且持续的作用，为维持肠道健康提供了一种新的途径。
26.本文中的“富含一丁酸二月桂酸甘油酯”可以指结构酯中富含35％～50％以上的一丁酸二月桂酸甘油酯。
27.优选地，按重量份数计，所述脂肪酸结构酯包括：1～10份月桂酸、0.1～5份一丁酸甘油酯、1～7份三丁酸甘油酯、2～10份一丁酸一月桂酸甘油酯、30～50份二丁酸一月桂酸甘油酯、0.1～5份二月桂酸甘油酯、35～55份一丁酸二月桂酸甘油酯以及0.1～5份三月桂酸甘油酯。
28.在没有限定的情况下，本文中的“一丁酸一月桂酸甘油酯”选自所有的同分异构体中的至少一种，其同分异构体包括1
‑
丁酸
‑3‑
月桂酸甘油酯、3
‑
丁酸
‑1‑
月桂酸甘油酯、2
‑
丁酸
‑
1月桂酸甘油酯、2
‑
丁酸
‑
3月桂酸甘油酯、2
‑
月桂酸
‑
1丁酸甘油酯和2
‑
月桂酸
‑
3丁酸甘油酯中的任意一种。再例如，“二丁酸一月桂酸甘油酯”选自所有同分异构体中的至少一种，其同分异构体包括1.2
‑
二丁酸
‑3‑
月桂酸甘油酯和1.3
‑
二丁酸
‑2‑
月桂酸甘油酯。其他组分依此类推，不再赘述。更优选地，按重量份数计，所述脂肪酸结构酯包括1～10份月桂酸、0.1～5份一丁酸甘油酯、1～7份三丁酸甘油酯、1～3份1
‑
丁酸
‑
3月桂酸甘油酯、1～7份2
‑
丁酸
‑
1月桂酸甘油酯、15～25份1.2
‑
二丁酸
‑3‑
月桂酸甘油酯、15～25份1.3
‑
二丁酸
‑2‑
月桂酸甘油酯、0.1～1份1.2
‑
二月桂酸甘油酯、0.1～4份1.3
‑
二月桂酸甘油酯、20～30份1.2
‑
二月桂酸
‑3‑
丁酸甘油酯、15～25份1.3
‑
二月桂酸
‑2‑
丁酸甘油酯以及0.1～5份三月桂酸甘油酯。在该限定范围内，结构酯具有更好的功效。
29.具体地，月桂酸的重量份数可以为1份、2份、4份、6份、8份和10份中的任意份数。一丁酸甘油酯的重量份数可以为0.1份、0.5份、1份、份、3份、4份和5份中的任意份数。三丁酸甘油酯的重量份数可以为1份、2份、4份、6份和7份中的任意份数。1
‑
丁酸
‑3‑
月桂酸甘油酯的重量份数可以为1份、2份和3份中的任意份数。2
‑
丁酸
‑1‑
月桂酸甘油酯的重量份数可以为1份、2份、4份、6份和7份中的任意份数。1.2
‑
二丁酸
‑3‑
月桂酸甘油酯的重量份数可以为15份、17份、19份、21份、23份和25份中的任意份数。1.3
‑
二丁酸
‑2‑
月桂酸甘油酯的重量份数可以为15份、17份、19份、21份、23份和25份中的任意份数。1.2
‑
二月桂酸甘油酯的重量份数可以为0.1份、0.5份和1份中的任意份数。1.3
‑
二月桂酸甘油酯的重量份数可以为0.1份、0.5份、1份、2份和4份中的任意份数。1.2
‑
二月桂酸
‑3‑
丁酸甘油酯的重量份数可以为20份、
22份、24份、26份、28份和30份中的任意份数。1.3
‑
二月桂酸
‑2‑
丁酸甘油酯的重量份数可以为15份、17份、19份、21份、23份和25份中的任意份数。三月桂酸甘油酯的重量份数可以为0.1份、0.5份、1份、份、3份、4份和5份中的任意份数。本发明实施例还提供了一种用于制备如前述任意实施例所述的脂肪酸结构酯的方法，所述方法包括：采用三丁酸甘油酯和月桂酸混合酶催化酸解酯交换反应。
30.在一些实施例中，不会混合反应的条件作限定，只要采用三丁酸甘油酯和月桂酸作为原料，生成如前述任意实施例所述的脂肪酸结构酯的，均属于本技术的保护范围。
31.优选地，发生混合反应时，三丁酸甘油酯和月桂酸的摩尔比为1：(4～10)。在该限定范围内，能制备出具有上述功效的脂肪酸结构酯。
32.优选地，所述混合反应包括以下步骤：在氮气气氛下，将三丁酸甘油酯和月桂酸混合加热至液态；
33.在液态产物中添加固定化脂肪酶，在氮气气氛下保温2～6h；
34.去除固定化脂肪酶，获得所述脂肪酸结构酯。
35.在一些实施例中，保温时间可以为2h、3h、4h、5h和6h中的任意时间，优选为4h。混合加热的温度选自60～70℃，62℃、64℃、66℃、68℃和70℃中的任意温度。
36.本文中的“固定化脂肪酶”作为催化剂，用于促进原料反应，以生成目标脂肪酸结构酯。在一些实施例中，固定化脂肪酶可以选自固定化的米曲霉脂肪酶、固定化的米根霉脂肪酶和固定化的米赫根毛酶脂肪酶中的至少一种。
37.本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的脂肪酸结构酯或如前述任意实施例所述的方法制备的脂肪酸结构酯在制备用于促进肠道健康的产品中的应用。
38.在一些实施例中，促进肠道健康具体是指：抑制炎症、维持肠道屏障、调节肠道微生物军区的平衡、避免或减少肠道免疫系统应激的发生中的至少一种。
39.本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的脂肪酸结构酯或如前述任意实施例所述的方法制备的脂肪酸结构酯在制备用于调节肠道微生物菌群的产品中的应用。
40.所述肠道微生物菌群包括:梭菌属、cc
‑
115菌属和candidatus arthromitus属中的至少一种。
41.具体地，梭菌属包括unclassified_c_clostridia和clostridiales。candidatus arthromitus是一种分节丝状菌。
42.具体地，所述调整肠道微生物菌群可以指增加肠道梭菌属、cc
‑
115菌属和candidatus arthromitus属中至少一种菌属的丰度，或增加前述任意菌属中至少一种菌种的丰度。
43.此外，本发明实施例还提供了一种促进肠道健康的产品，其包括如前述任意实施例所述的脂肪酸结构酯或如前述任意实施例所述的方法制备的脂肪酸结构酯。
44.本文中的“产品”可以为组合物、药剂或试剂盒等形式。产品中还可以包含任意形式的载体和/或具有促进肠道健康的功能性组分。
45.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
46.实施例1
47.一种富含一丁酸二月桂酸甘油酯的脂肪酸结构酯(丁酸月桂酸结构酯)的制备与组成测定。
48.制备方法具体包括以下步骤。
49.取适量三丁酸甘油酯和月桂酸加入到100ml圆底烧瓶中，三丁酸甘油酯和月桂酸的摩尔比为1:6，充入氮气，盖上翻口塞，放置于65℃恒温水浴振荡器，待混合物均匀且呈液态后，加入固定化脂肪酶，固定化脂肪酶的添加量为混合物总重量的10％，冲入氮气，盖上翻口塞，于200rmp条件下保温反应4h。反应完成后，过滤去除固定化脂肪酶，蒸馏脱酸纯化后，得到富含一丁酸二月桂酸甘油酯的丁酸月桂酸结构酯(lbl)。
50.取10.0mg丁酸月桂酸结构酯置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声完全溶解后，转移至2ml进样瓶中进行gc
‑
ms分析。
51.仪器型号为7890a
‑
5975c型气质联用仪(gc
‑
ms)，美国安捷伦科技有限公司。色谱条件：色谱柱为hp
‑
5ms(30.0m
×
250μm,0.25μm)；色谱柱起始温度50℃保持2min，然后以15℃/min到280℃，保持20min；气化室温度280℃；传输线温度280℃；载气he；载气流量1.0ml/min；分流比为10:1；进样量为0.5μl。质谱条件：ei源；电子能量70ev；离子源温度300℃；四极杆150℃；扫描模式为scan；扫描质量范围为20～800u。
52.经鉴定，富含一丁酸二月桂酸甘油酯的丁酸月桂酸结构酯s
lbl
的构成如表1所示。
53.表1丁酸月桂酸结构酯组成成分表
54.物质名称含量(％)月桂酸5.46一丁酸甘油酯1.58三丁酸甘油酯3.671
‑
丁酸
‑3‑
月桂酸甘油酯1.032
‑
丁酸
‑1‑
月桂酸甘油酯3.231.2
‑
二丁酸
‑3‑
月桂酸甘油酯17.421.3
‑
二丁酸
‑2‑
月桂酸甘油酯17.421.2
‑
二月桂酸甘油酯0.441.3
‑
二月桂酸甘油酯1.131.2
‑
二月桂酸
‑3‑
丁酸甘油酯23.621.3
‑
二月桂酸
‑2‑
丁酸甘油酯20.62三月桂酸甘油酯1.74
55.由结果可知，丁酸月桂酸结构酯中比较主要的成分为一丁酸二月桂酸甘油酯和二丁酸一月桂酸甘油酯。丁酸月桂酸结构酯中一丁酸二月桂酸甘油酯约占总量的44.24％。此外，还有部分的一丁酸一月桂酸甘油酯存在，约占4.26％。
56.上述结果说明通过酸解酯交换方法，以三丁酸甘油酯和月桂酸为原料可以成功合成富含一丁酸二月桂酸甘油酯的丁酸月桂酸结构酯。
57.实施例2
58.验证富含一丁酸二月桂酸甘油酯的脂肪酸结构酯的体内外消化特性。
59.本实施例采用摩尔比为1:4的三丁酸甘油酯和月桂酸为原料，70℃反应，制备(制备过程可参照实施例1)获得的丁酸月桂酸结构酯作为实验组(s
lbl
：富含一丁酸二月桂酸甘油酯)，以相等摩尔含量的三丁酸甘油酯和三月桂酸甘油酯(m
lbl
)为对照组，在体外消化模型和体内小鼠模型中进行实验。
60.在体外消化模型中，取消化后0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min和240min的消化样品，其中前120min为体外模拟胃消化，120min至240min为模拟肠消化。
61.在体内小鼠模型中，取灌胃后0min、60min、120min、240min、320min的肠道内容物样品(回肠、盲肠、空肠和结肠)。
62.对收取得的样品进行gc
‑
fid分析，丁酸和单月桂酸甘油酯gml为监测对象，结果图1～图4。
63.由图1可知，在静态模拟消化模型中，s
lbl
和m
lbl
的丁酸释放规律相近，表明甘油骨架上的月桂酸分子对丁酸分子的保护效果不佳。体内消化中体现s
lbl
与m
lbl
相似的丁酸释放规律(图3)，与体外模拟消化的结果相近。
64.由图2可知，在静态模拟肠消化的过程中，s
lbl
的gml释放速率显著低于m
lbl
，表明甘油骨架中的丁酸可能优先被脂肪酶攻击从而一定程度上保护了月桂酸分子。在模拟消化结束时s
lbl
的gml释放程度低于m
lbl
，这可能是模拟肠消化时间过短导致其gml累积峰还没有出现。
65.s
lbl
对gml的缓释作用在小鼠体内模型中也得到证实，参照图4，在消化初始阶段(空肠1h),m
lbl
中的三月桂酸甘油酯被胰脂肪酶迅速分解为gml，此时m
lbl
处理组的gml含量显著高于s
lbl
处理组。但随着消化的进行，在灌胃4h后，回肠部位的gml含量呈现s
lbl
处理组显著高于m
lbl
处理组的现象。
66.体内体外的gml释放规律对比显示了s
lbl
中的gml有更加缓慢的释放速度，并且这在肠道消化中更为明显。这一现象表示s
lbl
可将gml输送至肠道微生物更为密集的后消化道部分，而先前的研究表明gml对肠道微生物的调节作用往往是积极的，这表明s
lbl
可能具有比m
lbl
更好的肠道菌群调节作用。
67.实施例3
68.验证富含一丁酸二月桂酸甘油酯的丁酸月桂酸结构酯对肠道微生物的瞬时改变作用。
69.饮食成分的变化可能会引起肠道微生物的瞬时改变，这种改变会随着饮食变化得持续而积累，最终影响机体健康。本实施例采用摩尔比为1:10的三丁酸甘油酯和月桂酸为原料，62℃反应，制备(制备过程可参照实施例1)获得的丁酸月桂酸结构酯作为实验组(s
lbl
)，以相等摩尔含量的三丁酸甘油酯和三月桂酸甘油酯(m
lbl
)为对照组，对小鼠进行灌胃，通过收集灌胃24h之后的盲肠样品，采用16s rna测序分析组s
lbl
和m
lbl
对小鼠肠道微生物的扰动作用，检测结果参照图5。
70.梭菌属是肠道内潜在的益生菌，其发酵难消化多糖产生的短链脂肪酸在维持肠道屏障、抑制炎症和调节微生物菌群等方便都显示出积极作用。由图5中a、c、d可以看出，相比于m
lbl
处理组，灌胃s
lbl
后肠道内梭菌属的丰度有显著增加的趋势，cc
‑
115菌属以及未识别的梭菌属丰度也呈现相似的规律。m
lbl
对梭菌属丰度的上调作用可能进一步的对机体健康产生积极影响。
71.此外，candidatus arthromitus属是与免疫调节相关的重要微生物，其丰度的减少可能导致肠道免疫系统应激和炎症的发生。由图5中c可以看出，在s
lbl
处理组中观测到的candidatus arthromitus属丰度相比于m
lbl
处理组显著增加，表明s
lbl
可能具有更高的健康
价值。
72.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。