一种铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒及其制备方法与应用。


背景技术：

2.光热治疗指的是通过将光能转化为热能，并利用所转化的热能进行疾病治疗的一种方法。近年来，由于光热治疗的靶向性强、适应性广的特点受到了研究者们的广泛关注。相比于传统肿瘤治疗中的放射疗法以及手术疗法，光热治疗对人体的正常组织杀伤显著减小。
3.聚吡咯具有良好的生物相容性，还具有优异的光热效应和光稳定性，被广泛用于光热治疗领域。如中国专利申请cn108815524a公开了一种透明质酸修饰聚吡咯包裹载药相变材料光热治疗剂，该光热治疗剂的聚吡咯由三氯化铁作为氧化剂诱导聚合，会存在于最终产物中，不发挥作用，并且体内的清除途径不明确。另一方面，肿瘤微环境具有乏氧、高浓度过氧化物或谷胱甘肽过表达等特点，显著地限制了治疗效果，造成单纯的光热治疗往往无法彻底清除肿瘤，临床抗肿瘤效果有限。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有聚吡咯用于光热治疗癌症时效果有限的缺陷和不足，提供一种改善肿瘤微环境、结合光热治疗协同抗肿瘤，安全性高的铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒。
5.本发明的目的是提供所述铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的制备方法。
6.本发明另一目的是提供所述铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒在制备防治肿瘤药物中的应用。
7.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8.一种铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
9.s1、将稳定剂、氧化剂、吡咯单体混合制成混合溶液，4～30℃搅拌反应，3000～8000rpm第一次离心，收集上清10000～50000rpm第二次离心，收集沉淀，得聚吡咯纳米粒；
10.s2、将步骤s1所得聚吡咯纳米粒制成分散液，加入聚乙二醇超声反应完全，第三次离心，沉淀后处理，即得；
11.其中，所述氧化剂选自氯化铜、硝酸铜、氧化铜中的一种或多种。优选地，所述氧化剂选自氯化铜。
12.进一步地，步骤s1中，所述稳定剂选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、十二烷基硫酸钠中的一种或多种。
13.更进一步地，步骤s1中，所述稳定剂的添加量为0.1～10mg/ml。通过调整反应体系中稳定剂的添加量，可以实现调控聚吡咯纳米粒粒径大小的效果。
14.进一步地，步骤s1中，所述氧化剂的添加量为10～100mg/ml。
15.更进一步地，步骤s1中，所述吡咯单体与混合溶液总体积的体积比为1：(10～500)。
16.优选地，步骤s1中，所述搅拌的转速为200～1500rpm。
17.优选地，步骤s1中，所述搅拌反应的时间为8～30小时。
18.优选地，步骤s1中，所述搅拌反应的反应温度为20～30℃。
19.进一步地，步骤s2中，所述聚吡咯纳米粒与聚乙二醇的质量比为1：(4～20)。
20.优选地，步骤s2中，所述超声反应的时间为8～36小时。
21.另外的，本发明还提供了一种所述制备方法制备的铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒材料。
22.进一步地，所述聚吡咯纳米粒材料的粒径为20～300nm。
23.另外的，本发明还提供了所述铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒材料在制备防治肿瘤药物中的应用。
24.进一步地，所述药物结合光热疗法对肿瘤进行防治。
25.本发明提供的的铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒材料创造性地采用含铜氧化剂诱导吡咯单体氧化聚合，制备得到的聚吡咯纳米材料将氧化剂中的铜元素保留，所得聚吡咯纳米粒材料具有较好的光热性能，在近红外i区和ii区激光刺激下，都具有较高的温度升高，表现出良好的光热效应，利用光热效应烧灼、杀灭肿瘤，具有较高的安全性；并且，在缺氧的肿瘤微环境条件下，所制备的聚吡咯纳米粒材料可以发挥纳米催化作用，消耗具有抗氧化作用谷胱甘肽的同时产生大量羟氧自由基，且催化效率随着温度上升而增强，促进肿瘤微环境的紊乱和加速纳米粒的生物降解，实现安全有效的抗癌治疗。另外的，本发明中的聚吡咯具有优异的生物相容性和稳定性，可以被机体吸收，安全性高。
26.本发明具有以下有益效果：
27.本发明提供了一种铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒材料，采用含铜氧化剂诱导吡咯单体氧化聚合，制备方法操作简单，还可以通过稳定剂的添加量调控材料粒径大小；制备得到的聚吡咯纳米粒材料具有较好的光热效应，还能显著改善肿瘤微环境，到达肿瘤部位后可以协同增效达到显著杀死肿瘤细胞的效果；并且该聚吡咯纳米材料具有优异的生物相容性和稳定性，可以被机体吸收，安全性高，非常适合作为肿瘤药物在临床上应用。
附图说明
28.图1为本发明实施例3所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的电镜扫描图，其中，图1a：添加10mg聚乙烯醇；图1b：添加30mg聚乙烯醇；图1c：添加50mg聚乙烯醇；图1d：添加100mg聚乙烯醇。
29.图2为本发明实施例3所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的粒径分布图。
30.图3为本发明实施例3添加30mg聚乙烯醇所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的x射线光电子谱。
31.图4为本发明实施例3添加30mg聚乙烯醇所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的x射线衍射图谱。
32.图5为本发明试验例1中对实施例1所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳
米粒的电镜扫描图和粒径分布图。
33.图6为本发明试验例2中对实施例1所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的光学吸收和光热性能研究统计图，其中，图6a：紫外可见光吸收光谱；图6b：808nm激光激发；图6c：1064nm激光激发。
34.图7为本发明试验例3中对实施例1所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的催化性能结果统计图，其中，图7a：产氧能力测试结果；图7b：羟氧自由基产生能力测试结果；图7c：谷胱甘肽消耗能力测试结果。
35.图8为本发明试验例3中对实施例1所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的细胞毒性试验结果统计图，其中，图8a：无1064nm激光光照；图8b：1064nm激光光照。
具体实施方式
36.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
37.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
38.实施例1一种聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒
39.所述聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的制备方法包括以下步骤：
40.s1、于50ml单口圆底烧瓶中加入10ml去离子水，再加入30mg聚乙烯醇(pva)，在90℃加热环境下温和搅拌冷凝回流1小时，然后自然冷却至室温；在600～1500rpm转速搅拌条件下(磁力搅拌)，逐滴加入10ml氯化铜溶液(含1g氯化铜)，继续搅拌1小时；然后逐滴加入200μl吡咯单体(99％，阿拉丁)，600～1500rpm搅拌(磁力搅拌)反应24小时；将所得反应液用低温超速离心机5000rpm/min离心10min，除去大颗粒纳米粒，收集上清，20000rpm/min离心20min，收集沉淀，得聚吡咯纳米粒；
41.s2、在恒温冰水浴超声条件下，向1ml步骤s1所得聚吡咯纳米粒分散液(1mg/ml)中，逐滴加入1ml二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇(dspe-peg)溶液(5mg/ml，溶剂为丙酮:乙醇＝2:3)，继续超声30分钟，600～1500rpm磁力搅拌过夜反应；反应液20000rpm离心20min，沉淀用超纯水洗两次，即得。
42.实施例2一种聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒
43.所述聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的制备方法包括以下步骤：
44.s1、于50ml单口圆底烧瓶中加入10ml去离子水，再加入50mg聚乙烯醇(pva)，在90℃加热环境下温和搅拌冷凝回流1小时，然后自然冷却至室温；在600～1500rpm转速搅拌条件下(磁力搅拌)，逐滴加入10ml氧化铜溶液(含1g氧化铜)，继续搅拌1小时；然后逐滴加入200μl吡咯单体(99％，阿拉丁)，600～1500rpm搅拌(磁力搅拌)反应20小时；将所得反应液用低温超速离心机5000rpm/min离心10min，除去大颗粒纳米粒，收集上清，20000rpm/min离心20min，收集沉淀，得聚吡咯纳米粒；
45.s2、在恒温冰水浴超声条件下，向1ml步骤s1所得聚吡咯纳米粒分散液(1mg/ml)中，逐滴加入1ml二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇(dspe-peg)溶液(3mg/ml，溶剂为丙酮:乙醇＝2:3)，继续超声30分钟，600～1500rpm磁力搅拌过夜反应；反应液20000rpm离心20min，沉淀用超纯水洗两次，即得。
46.实施例3一种聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒
47.所述聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的制备方法参考实施例1，不同之处在于，步骤s1中分别添加10mg、30mg、50mg、100mg的聚乙烯醇，其余参数及操作参考实施例1。
48.对所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒进行电镜扫描观察和粒径分布分析其形态大小，结果参见图1～2。由图可见，随着聚乙烯醇加入量从高到低的变化，所得到的聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒电镜粒径和流体动力学粒径都逐渐变大，并在30mg聚乙烯醇添加量下所制得的纳米粒分散性最好，均一性最佳。表明可以通过控制反应体系中稳定剂聚乙烯醇的量来调控纳米粒尺寸大小及分散性。
49.对30mg添加量聚乙烯醇制备的纳米粒进行x射线光电子谱和x射线衍射图谱分析，结果参见图3～4。由图3可见，制备得到的纳米粒存在cu、c、n、o、cl元素，表明本发明聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒制备成功；由图4可见，制备得到的纳米粒存在聚吡咯特征吸收峰，表明本发明聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒制备成功。
50.试验例1理化性能测试
51.以实施例1所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒为例进行理化性能测试，其余实施例效果与实施例1效果相似。
52.对实施例1所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒进行电镜扫描观察和粒径分布分析其形态大小，结果如图5所示。
53.从图5可看出，聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒大小均一，分散性好，流体动力学粒径在99.67nm左右。
54.试验例2光学性能测试
55.以实施例1所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒为例进行光学性能测试，其余实施例效果与实施例1效果相似。
56.在808nm和1064nm波长激光条件下，对不同浓度聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的光学吸收和光热性能进行评估，结果如图6所示。
57.从图6a可看出，聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒在近红外i和ii区具有很强的光学吸收，且具有浓度依赖性；从图6b和6c可看出，聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒在808nm和1064nm激光激发下具有较高的温度升高，具备优异的光热性能。
58.可见，聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒具备光热治疗烧灼肿瘤的所需温度，且近红外ii区激光响应能力可大大增加深层次肿瘤的治愈率。
59.试验例3催化性能测试
60.以实施例1所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒为例进行催化性能测试，其余实施例效果与实施例1效果相似。
61.对聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒的产氧能力、羟氧自由基产生能力和谷胱甘肽消耗能力分别进行测试，结果如图7所示。
62.产氧能力测试方法为：将不同浓度聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒(0、10、20、40μg/ml)分散在磷酸盐缓冲液(ph 7.4)中，一旦用注射器加入h2o2(10mm)，即用jpsj-605f便携式溶解氧仪测量溶液不同时间点的氧气浓度，结果如图7a所示。
63.羟氧自由基产生能力测试方法为：将不同浓度聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒(0、10、20、40μg/ml)分散在磷酸盐缓冲液(ph 7.4)中，然后加入10μg/ml亚甲基蓝指示剂，最后加入h2o2(10mm)，用紫外可见光光谱仪测量溶液不同时间点的紫外吸收，结果如图7b所示。
64.谷胱甘肽消耗能力测试方法为：将不同浓度聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒(0、0.625、1.25、2.5、5μg/ml)分散在磷酸盐缓冲液(ph 7.4)中，然后加入0.1mm gsh，最后利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)探针检测gsh的消耗，结果参见图7c。
65.从图7a可看出，聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒具有很强的氧气产生能力，且具有浓度依赖性，可以缓解肿瘤低氧；从图7b可看出，聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒具有显著的羟氧自由基产生能力，且具有浓度依赖性，可以加剧肿瘤氧化微环境。从图7c可看出，聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒具有明显的谷胱甘肽清除能力，可以减轻肿瘤抗氧化能力。
66.可见，本发明提供的聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒具备重塑肿瘤微环境和强效纳米催化治疗的能力，具备杀死肿瘤及预防肿瘤复发转移的能力。
67.试验例4细胞毒性测试
68.以实施例1所得聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒为例分别对正常细胞和肿瘤细胞进行细胞毒性测试，其余实施例效果与实施例1效果相似。
69.测试方法为：分别将小鼠乳腺癌细胞4t1、人神经胶质瘤细胞u87、人脐静脉内皮细胞huvec、小鼠小胶质细胞bv2以每孔8
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103个细胞的密度接种于96孔板并培养12小时；用pbs洗涤一次后，将细胞与梯度浓度(0、2.5、5、10、20、40、80、120μg/ml)的聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒孵育24小时；用pbs洗涤后，使用cell counting kit-8(cck-8)孵育2小时，在450nm波长处测量吸光度，进行标准细胞活力测定以确定相对细胞活力，结果参见图8a。
70.将小鼠乳腺癌细胞4t1细胞以每孔8
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103个细胞的密度接种于96孔板并培养12小时；用pbs洗涤一次后，将细胞与梯度浓度(0、2.5、5、10、20、40μg/ml)的聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒共孵育4小时，然后进行不同功率(0.5、1.0、1.5w/cm2)的1064nm激光照射5分钟；继续培养20小时，用pbs洗涤后，使用cell counting kit-8(cck-8)孵育2小时，在450nm波长处测量吸光度，进行标准细胞活力测定以确定相对细胞活力，结果参见图8b。
71.从图8a可看出，在无激光光照条件下，不同浓度聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒对正常细胞和肿瘤细胞几乎没有毒性；但在1064nm激光光照条件下，聚乙二醇修饰铜诱导氧化聚合的聚吡咯纳米粒对肿瘤细胞的毒性呈现出浓度和功率依赖性。
72.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。