一种基于实时荧光定量PCR检测土壤小麦赤霉病菌含量的方法

一种基于实时荧光定量pcr检测土壤小麦赤霉病菌含量的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于实时荧光定量pcr检测土壤小麦赤霉病菌含量的方法。


背景技术：

2.以禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)为主要优势致病菌引起的小麦赤霉病是全球范围内极具毁灭性且防治困难的真菌病害，多发生在温暖湿润地区，具有周期性流行的特点，是引起小麦产量和品质大幅下降的重要原因之一。小麦赤霉病菌主要侵染小麦的穗部，当温度和湿度等气候条件适宜时，病原菌会在麦穗上形成大量粉红色霉层，其代谢产生的各种真菌毒素会对人畜健康造成极大危害。中国小麦赤霉病的发病面积为全球最大，其在淮河以南及长江中下游麦区发病最为严重，华南和东北麦区也经常流行成灾。目前，随着秸秆还田普及、灌溉面积扩大和全球气候变暖，小麦赤霉病已逐渐向西北扩展至黄淮海冬麦区。
3.小麦赤霉病属于多循环真菌病害，病原菌通常以子囊壳的形式在作物病残组织或土表秸秆残体上越冬越夏。待次年春季小麦处于抽穗扬花期时，病残体上大量的子囊孢子在子囊壳内发育成熟后从子囊壳顶部孔口释放到空气中，并借助风、雨水或者昆虫等介质散播，作为初侵染源侵染小麦穗部。而感病麦穗上携带的大量病原菌分生孢子又会在风雨作用下进一步扩散传播，成为赤霉病的再次侵染源。因此，病残体上携带的子囊孢子和分生孢子往往会同时侵染小麦穗部，加剧赤霉病害的循环发生。
4.近年来，为促进农业的可持续发展，我国大力倡导秸秆还田，但秸秆的直接还田往往加剧了农作物病虫害的发生。以田间秸秆为主要生长基质的小麦赤霉病菌通常会随秸秆等病残体在土壤中长期留存，当病原菌在田间土壤中的残留量积累量增加时，小麦赤霉病的发病率及危害程度也相应增加。由于小麦赤霉病具有“可防、可控、不可治”的特点，早期预防在实际生产中尤为重要。因此，建立一项快速、准确检测土壤小麦赤霉病菌的技术，实现对土壤残留菌源量的实时动态检测，对小麦赤霉病的综合防治具有重要意义。
5.当前土壤小麦赤霉病菌的定量检测方法通常采用选择性培养基进行病菌分离培养和菌落计数。这种方法准确性低、耗时费力，且易受杂菌影响，具有较强的经验性。实时荧光定量pcr技术是近年新发展起来的一种用于微生物定量研究的方法，该方法具有高度特异、灵敏、快速等特点，能对目标病原菌进行绝对定量研究，其结果与传统计数方法相比更为准确，而且避免了繁琐的分离培养过程。申请号为2020103703729公开了禾谷镰刀菌的rt
‑
qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法，该方法具有高度的特异性和良好的灵敏度，能准确检测出植物组织上的小麦赤霉病菌含量，但却检测不出土壤环境中的小麦赤霉病菌含量；申请号为201110419678x公开了通过荧光实时定量pcr建立转基因小麦生长期内根际土壤中镰刀菌拷贝数的方法，该方法虽能快速、准确地检测出土壤镰刀菌属的含量，但却不能在种水平上表征土壤小麦赤霉病菌的含量。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足之处，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于实时荧光定量pcr检测土壤小麦赤霉病菌含量的方法。
7.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
8.一种基于实时荧光定量pcr检测土壤小麦赤霉病菌含量的方法，包括以下步骤：
9.1)提取新鲜土壤样品总dna，稀释制成待测土壤样品模板dna溶液；
10.2)提取纯培养的小麦赤霉病菌的菌丝dna并测定其浓度，将菌丝dna倍比稀释制成系列浓度梯度的标准曲线模板dna溶液；
11.3)对待测土壤样品模板dna溶液和标准曲线模板dna溶液进行实时荧光定量pcr扩增，以标准曲线模板dna浓度的对数值和测定的循环数ct值绘制出标准曲线，y＝ax+b；其中y为循环数ct，x为小麦赤霉病菌dna浓度的对数值；
12.4)计算待测土壤样品模板dna中的小麦赤霉病菌dna浓度＝10
(ct
‑
b)/a
，单位为ng/μl；
13.5)计算土壤样品每克干土的小麦赤霉病菌含量＝c
×
d
×
v/m，单位为ng/g；式中，c为待测土壤样品模板dna溶液中的小麦赤霉病菌dna浓度，单位为ng/μl；d为土壤样品总dna稀释的倍数；v为提取的土壤样品总dna体积，单位为μl；m为土壤样品干重，单位为g。
14.本发明在绘制标准曲线时，供试小麦赤霉病菌菌株为fusarium graminearum fg0609，将其在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上于28℃条件下恒温避光培养7天后，用无菌接种铲轻轻刮取表层新鲜菌丝并置于液氮中研磨成粉末；利用fungal dna kit试剂盒提取所述粉末的总dna并测定其浓度，最后用灭菌双蒸水将小麦赤霉病菌菌丝总dna按10倍比稀释制作成
×
101ng/μl、
×
100ng/μl、
×
10
‑1ng/μl、
×
10
‑2ng/μl、
×
10
‑3ng/μl、
×
10
‑4ng/μl和
×
10
‑5ng/μl等7个系列浓度梯度的标准曲线模板dna溶液。
15.本发明中，标准曲线方程为y＝
‑
3.5627x+18.961，r2＝0.9985。
16.进一步的，实时荧光定量pcr扩增的反应体系为：premix ex taq
tm
12.5μl，上下游引物各0.3μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足至25μl。
17.进一步的，实时荧光定量pcr的反应条件为：95℃2min，95℃15s，60℃30s，72℃45s，40个循环。
18.进一步的，实时荧光定量pcr的熔解曲线程序为：温度从65℃逐渐升至95℃，增量为0.5℃/5s。
19.本发明中实时荧光定量pcr的熔解曲线为单峰，熔解温度为84.5℃；扩增曲线呈较好的“s”型，扩增效率为90.8％。
20.检测或辅助检测土壤小麦赤霉病菌的特异性引物对，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如下所示：
21.上游引物fg16f序列为5
′‑
ctccggatatgttgcgtcaa
‑3′
，
22.下游引物fg16r序列为5
′‑
ggtaggtatccgacatggcaa
‑3′
。
23.检测或辅助检测土壤小麦赤霉病菌的pcr试剂，包含有上述的特异性引物对。
24.检测或辅助检测土壤小麦赤霉病菌的pcr试剂盒，含有上述的特异性引物对。
25.有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
26.本发明方法可以快速、准确的检测出土壤小麦赤霉病菌含量，便于对土壤残留目
标菌源量进行实时动态检测，为小麦赤霉病害的早期防控提供了技术支持。该方法克服了传统平板菌落计数法具有的准确性低、耗时费力、经验性较强等缺点，能对目标病原菌进行绝对定量研究，其结果与传统计数方法相比更为准确，极大提高了土壤小麦赤霉病菌的检测效率。
附图说明
27.图1是以标准曲线模板dna浓度的对数值为横坐标，以循环数ct值为纵坐标建立的标准曲线图；
28.图2是以标准曲线和待测土壤模板dna进行实时荧光定量pcr的熔解曲线图，熔解温度为84.5℃；
29.图3是标准曲线和待测土壤模板dna进行实时荧光定量pcr的扩增曲线图。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
31.以下实施例所涉及的菌株和培养基：
32.供试禾谷镰刀菌菌株fusarium graminearum fg0609来源于江苏省农业科学院；
33.马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基：葡萄糖20g，马铃薯200g(将马铃薯洗净去皮切碎煮30min，四层纱布过滤，取滤液)，琼脂20g，蒸馏水1l，ph＝7.0。
34.以下实施例所涉及的试剂和仪器：
35.真菌基因组dna提取试剂盒为fungal dna kit(omega bio
‑
tek，美国)，规格为50次/盒，货号d3390
‑
01；
36.土壤总dna提取试剂盒为spin kit for soil(mp bio，美国)，规格为50次/盒，货号116560
‑
200；
37.premix ex taq
tm
试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，货号rr420a；
38.荧光定量pcr板及封膜购于无锡国盛生物工程有限公司，pcr板标准为96孔，100μl，pp，白色，半裙边，灭菌，无核酸酶，货号cp2001。
39.实施例涉及的荧光定量pcr仪型号为cfx96，产自美国伯乐公司，数据分析由cfx96定量pcr仪自带的软件完成。
40.实施例1
41.本实施例所使用的土壤来自江苏省南京市汤山周边撂荒5年的荒地(32
°0′
n，119
°4′
e)，土壤类型为黄棕壤。原始土壤样品过4mm筛后，将制备好的病麦粒与土壤统一按比例混合进行装盆，开展小麦盆栽试验。待测土壤样品为拔节期小麦非根际土；处理1为种植a品种小麦的土壤，处理2为种植b品种小麦的土壤，处理3为空白对照。
42.具体操作步骤如下：
43.1)将待测土壤样品过2mm筛以去除石子、根系等杂质，称取500mg的新鲜土壤，采用spin kit for soil土壤dna提取试剂盒提取土壤总dna并测定其浓度，在
‑
20℃
冰箱冷冻备用。
44.2)将纯化后的禾谷镰刀菌菌株fg0609接种到马铃薯葡萄糖琼脂(pda)固体培养基上，在28℃条件下恒温避光培养7天。用无菌接种铲将pda培养基上长满的新鲜菌丝刮取下来，置于液氮中研磨成粉末。称取100mg禾谷镰刀菌菌丝粉末，用fungal dna kit试剂盒提取菌丝总dna，使其作为标准曲线模板dna母液，在
‑
20℃冰箱冷冻备用。
45.测得标准曲线模板dna母液浓度为56.0ng/μl，用灭菌双蒸水将标准曲线模板dna母液按10倍比依次稀释制备成5.6
×
101ng/μl、5.6
×
100ng/μl、5.6
×
10
‑1ng/μl、5.6
×
10
‑2ng/μl、5.6
×
10
‑3ng/μl、5.6
×
10
‑4ng/μl和5.6
×
10
‑5ng/μl等7个系列浓度梯度的标准曲线模板dna溶液。
46.3)将已知浓度的土壤总dna样品用灭菌双蒸水稀释至20ng/μl，作为待测土壤模板dna溶液。在96孔荧光定量板上，按顺序依次加入灭菌双蒸水9.9μl，10μmol/l上游引物fg16f溶液0.3μl，10μmol/l下游引物fg16r溶液0.3μl，premix ex taq
tm
12.5μl，标准曲线或待测土壤模板dna溶液2μl；每个样品平行3次。用透明封膜密封96孔荧光定量板，采用微孔板离心机离心混匀；
47.上游引物fg16f序列为5
′‑
ctccggatatgttgcgtcaa
‑3′
，下游引物fg16r序列为5
′‑
ggtaggtatccgacatggcaa
‑3′
。fg16f/fg16r引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
48.4)利用cfx96实时荧光定量pcr仪进行实时荧光定量pcr扩增。扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共做40个循环。实时荧光定量pcr反应结束后进行熔解曲线分析，其程序为：温度从65℃升至95℃，增量为0.5℃/5s。
49.5)以标准曲线模板dna浓度的对数值和测定的循环数ct值绘制出标准曲线。图1的标准曲线方程为y＝
‑
3.5627x+18.961，r2＝0.9985；其中y为测得的循环数ct，x为小麦赤霉病菌dna浓度的对数值；
50.本实施例中实时荧光定量pcr的熔解曲线见图2，熔解曲线为单峰，熔解温度为84.5℃；扩增曲线见图3，其呈较好的“s”型，扩增效率为90.8％。
51.6)计算待测土壤样品模板dna中的小麦赤霉病菌dna浓度(ng/μl)＝10(
18.961
‑
ct)/3.5627
。
52.7)计算土壤样品每克干土的小麦赤霉病菌含量(ng/g)＝c
×
d
×
v/m，式中，c为待测土壤样品模板dna溶液的小麦赤霉病菌dna浓度，单位为ng/μl；d为土壤样品总dna稀释的倍数；v为土壤样品总dna的提取体积，单位为μl；m为土壤样品干重，单位为g。结果如表1所示，使用本发明专利涉及的实时荧光定量pcr检测方法具有较高的灵敏度和特异性，能准确地检测出土壤小麦赤霉病菌的含量。
53.表1不同处理的土壤小麦赤霉病菌含量(ng/g)
[0054][0055]
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于
以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。