牛AANAT和ASMT基因的SNP标记及应用

牛aanat和asmt基因的snp标记及应用
技术领域
1.本发明涉及牛遗传标记筛选技术领域，具体涉及牛褪黑素合成酶aanat、asmt基因中与血清及乳中褪黑素性状相关的snp标记及应用。


背景技术：

2.褪黑素(melatonin，mt)，化学式为n
‑
乙酰
‑5‑
甲氧基色胺，具有抗应激、抗炎症、提高机体免疫力、改善睡眠质量、调节情绪、繁殖等功能。在体内的分布具有昼夜、季节节律，在生物体中的含量水平随每天的时间变化而变化。褪黑素具有白天含量低，夜晚含量高的特点，其高峰值通常出现在午夜。褪黑素的合成前体是色氨酸，松果体细胞从血液中摄取色氨酸后，在羟化酶和脱羧酶的作用下生成血清素，然后在甲基化酶的作用下生成褪黑素。此过程需要羟基吲哚
‑
o
‑
甲基转移酶(asmt)参与，松果体中aanat水平和褪黑素水平基本保持一致并受到光照调控，后续研究表明，asmt同样具有调节褪黑素周期性分泌的作用，因此认为aanat和asmt均对褪黑素合成起到限速作用。
3.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)指的是由单个核苷酸——a、t、c或者g的改变而引起的dna序列的多态性，包括碱基的插入、缺失、转化和变换等。snp位点分布是均匀的，在非编码区比在编码区更常见，snp造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。
4.近年来，健康食品的发展趋势导致了奶制品的竞争加剧。为了满足消费者的需求，功能性牛奶已开发出含有更高生物活性化合物的产品。褪黑素牛奶作为一种天然褪黑素补充来源，在国外市场已经发售，具有很大的市场前景，深受消费者欢迎。牛本身体内褪黑素水平具有个体差异性，褪黑素合成酶基因aanat、asmt调控的合成酶影响牛褪黑素合成。本发明通过对牛aanat、asmt基因测序，对其发现的snp位点与牛血清及乳中褪黑素做性状关联性分析，找到与牛褪黑素水平相关的snp，为早期鉴定高褪黑素牛的分子标记辅助选择提供一种方案，为褪黑素功能乳开发的高褪黑素牛群选择奠定基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供牛褪黑素合成酶aanat、asmt基因中与血清及乳中褪黑素性状相关的snp标记及应用。
6.第一方面，本发明提供与褪黑素性状相关的snp标记，所述snp标记的序列如seq id no.1所示；所述seq id no.1所示的序列自5’端起第926位、第1710位、第1727位、第1754位、第1761位、第1816位、第1818位和/或第1820位碱基存在多态性。
7.作为本发明的实施方案，所述第926位碱基是c或t，第1710位碱基是t或c，第1727位碱基是t或c，第1754位碱基是c或t，第1761位碱基是t或c，第1816位碱基是a或g，第1818位碱基为g或a，和/或第1820位碱基为a或g。
8.作为本发明的实施方案，所述snp标记位于牛褪黑素合成酶aanat基因的部分编码区，其中所述第926位、第1710位、第1754位、第1761位和/或第1818位碱基的多态性与牛血
清褪黑素相关，所述第1727位、第1816位和/或第1820位碱基的多态性与牛乳褪黑素相关。
9.作为本发明的实施方案，与牛血清褪黑素相关的5个snp位点优势基因型分别为cc、ct、cc、tt和gg。
10.作为本发明的实施方案，与牛乳褪黑素相关的3个snp位点优势基因型分别为tt、aa和aa。
11.第二方面，本发明提供与褪黑素性状相关的snp标记，所述snp标记的序列如seq id no.2所示；所述seq id no.2所示的序列自5’端起第1714位、第3942位、第10121位、第10383位、第10417位、第13734位、第19616位、第22438位和/或第23667位碱基存在多态性。
12.作为本发明的实施方案，所述第1714位碱基是t或c，第3942位碱基是t或c，第10121位碱基是t或c，第10383位碱基是g或a，第10417位碱基是g或a，第13734位碱基是t或c，第19616位碱基为c或t，第22438位碱基为t或c，和/或第23667位碱基为g或a。
13.作为本发明的实施方案，所述snp标记位于牛褪黑素合成酶asmt基因的非编码区，其中所述第1714位、第3942位、第19616位和/或第22438位碱基的多态性与牛血清褪黑素相关，所述第10121位、第13734位、第10383位、第10417位和/或第23667位碱基的多态性与牛乳褪黑素相关。
14.作为本发明的实施方案，与牛血清褪黑素相关的4个snp位点优势基因型分别为tt、cc、gg和ag。
15.作为本发明的实施方案，与牛乳褪黑素相关的5个snp位点优势基因型分别为cc、aa、aa、tt和gg。
16.第三方面，本发明提供用于检测所述snp标记的试剂盒，所述试剂盒包括引物对。
17.优选地，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.3
‑
34所示。
18.第四方面，本发明提供所述snp标记或所述试剂盒在奶牛选育中的用途。
19.优选地，所述用途包括选育与褪黑素性状相关的奶牛，更优选地，所述用途为选育产褪黑素乳的奶牛。
20.本发明通过对荷斯坦奶牛褪黑素合成酶aanat、asmt基因进行sanger测序，根据ncbi数据库公布的牛aanat基因序列(登录号gene id:nc_037346.1)和牛asmt基因序列(登录号gene id:nc_037328.1)设计引物对，通过检测发现牛褪黑素合成酶aanat、asmt基因中与血清及乳中褪黑素性状相关的snp标记。
21.本发明的优点在于：
22.本发明为天然高褪黑素牛早期高褪黑素性状的标记辅助选育提供了一种新的分子育种标记，可作为选择辅助方案，筛选方法简单快速，为褪黑素功能乳研发的早期奶牛选育阶段奠定基础。
附图说明
23.图1为不同基因型碱基信号图。
具体实施方式
24.以下实施例仅用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
25.以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。
26.实施例：
27.1.牛基因组dna提取
28.血液样品未加抗凝剂，解冻后取血块和组织液的混合物先消化预处理，使用动物/血液dna提取试剂盒(通用型)，具体步骤如下：
29.1.1将spin column置于collection tube中，加入250μl buffer bl，12,000
×
g离心1min，活化硅胶膜。
30.1.2样品消化：取20μl proteinase k至1.5ml离心管底部，然后加入200μl高纯水稀释后的组织碎片，涡旋振荡10s；再加入200μl buffer ga1，旋涡振荡10s，56℃孵育1～3h或过夜，期间震荡3～5次。
31.1.3孵育结束后加入200μl无水乙醇，涡旋振荡混匀。
32.v无水乙醇≈(v样品+v buffer ga1)/2
33.1.4将步骤3所得溶液全部转入spin column中，12,000
×
g离心1min，弃废液。
34.1.5向spin column中加入500μl buffer pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000
×
g离心30s，弃废液。
35.1.6重复步骤1.5一次。
36.1.7向spin column中加入500μl wash buffer(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000
×
g离心30s，弃废液。
37.1.8将spin column放回collection tube中，12,000
×
g离心2min，开盖晾干1min。
38.1.9取出spin column，放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μl te buffer(65℃预热5min洗脱效果更佳)，20～25℃放置2min，12,000
×
g离心2min。如果需要较多量dna，可将得到的溶液重新加入spin column中，离心2min。
39.注意：洗脱体积越大，洗脱得率越高。若需得到较高浓度的dna，可以适当减少洗脱体积，但最小体积应不少于50μl，体积过小会降低dna洗脱得率，降低产量。
40.2.引物设计原则
41.2.1外围引物设计原则
42.引物长度在15bp
‑
30bp，其有效长度一般不大于38，否则pcr的最适延伸温度会超过taq酶的最佳作用温度，从而降低产物的特异性。gc含量应在40％
‑
60％之间，最适tm值在58℃
‑
60℃。引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
43.3.引物设计合成
44.aanat、asmt基因序列设计snp位点引物名称以rs登录号/基因名称/位点所在位置命名，外围扩增引物合成page引物。
45.aanat基因引物序列如下：
[0046][0047]
asmt基因引物序列如下：
[0048][0049][0050]
4.pcr扩增
[0051]
提取的dna样品稀释至20ng/μl后作为pcr模板，以1.1
×
t3 super pcr mix进行扩增，每个位点进行单一扩增，每对引物均按以下扩增体系和程序进行扩增，扩增体系及各组分如表1所示：
[0052]
表1.扩增体系及各组分
[0053]
组分体积1.1
×
t3 super pcr mix22μl10μm primer f1μl10μm primer r1μltemplate(gdna)1μltotal25μl
[0054]
以上扩增体系按照表2扩增程序扩增：
[0055]
表2.扩增程序
[0056][0057]
5.电泳检测
[0058]
将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μl样品+6μl溴酚蓝)，300v电压下12分钟，获取鉴定胶图，通过胶图确定目的条带大小。
[0059]
条带符合且单一的送到测序部门进行sanger测序。
[0060]
6.snp位点与性状关联性分析
[0061]
采用r语言软件进行snp位点与表型之间的关联性分析，所用模型如下：
[0062]
y
ij
＝μ+g
i
+p
j
+e
ij
，其中，y
ij
为性状观察值；μ为性状总平均值；g
i
为基因型效应；p
j
为固定效应；e
ij
为随机误差。
[0063]
7.实验结果
[0064]
7.1牛血清褪黑素与aanat基因snp关联性分析
[0065]
7.1.1如表3所示，牛aanat基因中的第926位、第1710位和第1818位碱基的snp与血清褪黑素浓度有相关性(p＜0.1)；牛aanat基因中的第1754位、第1761位碱基的snp与血清褪黑素浓度具有显著相关性(p＜0.05)。
[0066]
表3.aanat基因snp与血清褪黑素相关性
[0067][0068]
7.1.2牛aanat基因snp位点基因型频率和等位基因频率如表4所示。从表4中可以得出，检测到与血清褪黑素有相关性的5个snp位点均检测到3种基因型，这5个snp位点优势基因型分别为cc、ct、cc、tt和gg，优势基因为c、c、c、t和g。(见图1)
[0069]
表4.aanat基因snp位点基因型频率和等位基因频率
[0070][0071][0072]
7.1.3牛aanat基因5个snp不同基因型与牛血清褪黑素浓度关联性分析，统计分析结果如表5所示。aanat
‑
926bp、aanat
‑
1761bp和aanat
‑
1818bp纯和突变牛血清褪黑素显著提高(p＜0.05)；aanat
‑
1754bp杂合和纯和突变牛血清褪黑素显著提高(p＜0.05)；aanat
‑
1710bp杂合和纯和突变牛血清褪黑素显著降低(p＜0.05)。
[0073]
表5.aanat基因snp与血清褪黑素浓度关联性分析
[0074][0075]
注：表中相同字母表示差异不显著，字母a、b表示差异显著，n为该种基因型的个体数量。
[0076]
7.2牛生鲜乳褪黑素与aanat基因snp关联性分析
[0077]
7.2.1如表6所示，牛aanat基因中的第1816位和第1820位碱基的snp与生鲜乳褪黑素浓度有相关性(p＜0.1)；牛aanat基因中的第1727位碱基的snp与生鲜乳褪黑素浓度具有显著相关性(p＜0.05)。
[0078]
表6.aanat基因snp与生鲜乳褪黑素相关性
[0079][0080]
7.2.2牛aanat基因snp位点基因型频率和等位基因频率如表7所示。从表7中可以得出，检测到与生鲜乳褪黑素有相关性的3个snp位点均检测到3种基因型，这3个snp位点优势基因型分别为tt、aa和aa，优势基因为t、a和a。(见图1)
[0081]
表7.aanat基因snp位点基因型频率和等位基因频率
[0082][0083]
7.2.3牛aanat基因3个snp不同基因型与牛生鲜乳褪黑素浓度关联性分析，统计分析结果如表8所示。aanat
‑
1727bp和aanat
‑
1820bp纯和突变牛生鲜乳褪黑素显著提高(p＜0.05)。
[0084]
表8.aanat基因snp与生鲜乳褪黑素浓度关联性分析
[0085][0086]
注：表中相同字母表示差异不显著，字母a、b表示差异显著，n为该种基因型的个体数量。
[0087]
7.3牛血清褪黑素与asmt基因snp关联性分析
[0088]
7.3.1如表9所示，牛asmt基因中的第1714位、第3942位和第19616位碱基的snp与血清褪黑素浓度有相关性(p＜0.1)；牛asmt基因中的第22438位碱基的snp与血清褪黑素浓度具有显著相关性(p＜0.05)。
[0089]
表9.asmt基因snp与血清褪黑素相关性
[0090]
[0091]
7.3.2牛asmt基因snp位点基因型频率和等位基因频率如表10所示。从表10中可以得出，检测到与血清褪黑素有相关性的4个snp位点中有3个snp检测到3种基因型，1个snp检测到2种基因型。这4个snp位点优势基因型分别为tt、cc、gg和ag，优势基因为t、c、g和g。(见图1)
[0092]
表10.aanat基因snp位点基因型频率和等位基因频率
[0093][0094]
7.3.3牛asmt基因4个snp不同基因型与牛血清褪黑素浓度关联性分析，统计分析结果如表11所示。asmt
‑
22438bp纯和基因型牛血清褪黑素显著提高(p＜0.05)。
[0095]
表11.asmt基因snp与血清褪黑素浓度关联性分析
[0096][0097]
注：表中相同字母表示差异不显著，字母a、b表示差异显著，n为该种基因型的个体数量。
[0098]
7.4牛生鲜乳褪黑素与asmt基因snp关联性分析
[0099]
7.4.1如表12所示，牛asmt基因中的第10121位和第13734位碱基的snp与生鲜乳褪黑素浓度有相关性(p＜0.1)；牛asmt基因中的第10383位、第10417位和第23667位碱基的
snp与生鲜乳褪黑素浓度具有显著相关性(p＜0.05)。
[0100]
表12.asmt基因snp与生鲜乳褪黑素相关性
[0101][0102]
7.4.2牛asmt基因snp位点基因型频率和等位基因频率如表13所示。从表13中可以得出，检测到与生鲜乳褪黑素有相关性的5个snp位点均检测到3种基因型，这5个snp位点优势基因型分别为cc、aa、aa、tt和gg，优势基因为c、a、a、t和g。(见图1)
[0103]
表13.asmt基因snp位点基因型频率和等位基因频率
[0104][0105][0106]
7.4.3牛asmt基因5个snp不同基因型与生鲜乳褪黑素浓度关联性分析，统计分析结果如表14所示。asmt
‑
10383bp和asmt
‑
10417bpgg基因型生鲜乳褪黑素浓度显著高于aa基因型(p＜0.05)，asmt
‑
13734bp、asmt
‑
23667bp纯和突变生鲜乳褪黑素浓度显著提高(p＜0.05)。
[0107]
表14.asmt基因snp与生鲜乳褪黑素浓度关联性分析
[0108][0109]
注：表中相同字母表示差异不显著，字母a、b表示差异显著，n为该种基因型的个体数量。
[0110]
结论：
[0111]
综合上述实验结果，在本实施例的实验群体中褪黑素合成酶aanat上具有与牛血褪黑素含量相关的snp位点5个，其优势基因型分别为cc、ct、cc、tt和gg；与牛乳褪黑素含量相关的snp位点3个，其优势基因型分别为tt、aa和aa。褪黑素合成酶asmt上具有与牛血褪黑素含量相关的snp位点，其优势基因型分别为tt、cc、gg和ag；与牛乳褪黑素相关的5个snp位点，其优势基因型分别为cc、aa、aa、tt和gg。本发明的褪黑素合成酶snp位点可以作为牛褪黑素性状的潜在遗传标记，以用于高褪黑素奶牛的标记辅助选择。
[0112]
以上所述，仅是对本发明的一般性说明及具体实施方案的描述而已，并非是对本发明作其它形式的限制。任何熟悉本领域的技术人员均可以基于本技术公开的技术内容加以更改或变型为其等同实施例。在不背离本发明的构思和精神的前提下，对本发明进行的任何修改或变型均属于本发明技术方案的保护范围。