含人源APP和PSEN1基因的细胞模型及其构建方法与流程

含人源app和psen1基因的细胞模型及其构建方法
技术领域
1.本发明属于药物筛选模型技术领域，涉及含人源app和psen1基因的细胞模型及其构建方法。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer's disease，ad)是一种年龄相关的中枢神经系统变性疾病，是老年痴呆的最常见的原因。ad的发病机制十分复杂，至今尚未明确。目前主要有以下几种假说：基因突变假说，β淀粉样蛋白沉积假说，突触功能障碍假说，tau蛋白的过度磷酸化假说，兴奋性毒性氨基酸和免疫炎症假说等，β淀粉样蛋白的级联假说占主导地位。可溶性β淀粉酶(aβ)的增多和aβ过度沉积是ad的主要致病因素。该假说认为，β淀粉样前体蛋白(amyloidβprotein precursor，app)经β分泌酶、γ分泌酶剪切成aβ释放到细胞外，并且在细胞外蓄积、老化形成老年斑并可引发一系列ad病理症状的出现，这些病理过程又反过来加剧了β淀粉样蛋白的生成和沉积，从而产生级联效应，导致神经纤维缠结和神经元的丢失。
3.在研发ad药物中，通常会选择app/psen1转基因小鼠进行药效分析和机理研究，但是转基因鼠的费用相对昂贵，也不适合于大规模的筛选工作。


技术实现要素：

4.针对上述技术问题，本发明的目的在于提供含人源app和psen1基因的细胞模型及其构建方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.本发明提供了含人源app和psen1基因的细胞模型，是通过利用慢病毒转染cho细胞而导入人app和psen1基因序列构建而成的细胞系cho
‑
app/ps1。
7.优选地，所述慢病毒为lenti
‑
app/ps1
‑
gfp。
8.更优选地，所述慢病毒的包装系统为三质粒系统，组成为：pcmv
‑
dr8，pmd2.g，pgpd；慢病毒的包装细胞采用293t。
9.本发明还提供了含人源app和psen1基因的细胞模型的构建方法，包括：
10.1)构建人app(wt)/psen1(ps1,wt)双基因全长序列过表达的慢病毒；
11.2)采用组成为：pcmv
‑
dr8，pmd2.g，pgpd的三质粒系统作为慢病毒包装系统，采用293t作为慢病毒的包装细胞，转染48h后，收集病毒上清，过滤，浓缩；
12.3)将目的细胞接种于12孔板，培养过夜；
13.4)弃去培养基并添加0.5ml polybrene培养基混合物，每孔加入对应病毒0.5ml，对照细胞孔用培养基替代病毒；继续培养，慢病毒感染16h后，收集废弃病毒液，更换1ml新鲜培养基继续培养；
14.5)慢病毒感染48h后，通过荧光显微镜观察gfp的表达效率，更换含puromycin的新鲜培养基，筛选稳转细胞株，之后根据细胞状态，每2
‑
3天更换一次含有puromycin的新鲜培
养基，直至没有病毒感染的对照细胞被puromycin全部杀死，即得到稳转细胞株；最后将细胞再进行一轮单克隆筛选，获得目的细胞系cho
‑
app/ps1。
15.优选地，步骤1)包括：根据人app(wt)/ps1(wt)双基因全长序列及慢病毒载体序列设计并合成引物，合成引物序列如下：
16.app
‑
f：cctccatagaagattctagaatgctgcccggtttggcact，
17.app
‑
r：gatcgcagatccttctcgagctagttctgcatctgctcaa；
18.ps1
‑
f：cctccatagaagattctagaatgacagagttacctgcacc，
19.ps1
‑
r：gatcgcagatccttctcgagctagatataaaattgatgga。
20.优选地，步骤2)中，转染前一天，按照50％的细胞密度接种293t细胞。
21.优选地，步骤2)中，用0.22μm滤器过滤，采用millipore蛋白浓缩柱进行病毒浓缩。
22.优选地，步骤4)中，所述polybrene培养基混合物中polybrene的最适终浓度10μg/ml。
23.优选地，步骤5)中，含puromycin的新鲜培养基中puromycin的浓度为10μg/ml。
24.本发明还提供了上述含人源app和psen1基因的细胞模型在筛选能抑制aβ1
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42和aβ1
‑
40分泌的药物中的应用。
25.本发明选用慢病毒转染细胞，将人源的app和ps1导入到cho细胞中，可以得到稳定传代的细胞系，而且由于慢病毒本身携带有绿色荧光蛋白基因，能让细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光信号，增加了细胞的可识别性，以此判断细胞的外源基因稳定性。另外，携带有人源app和ps1基因的细胞，能稳定分泌出aβ1
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42和aβ1
‑
40。模拟ad细胞的发病特症而成为一个细胞筛选模型，用于高通量筛选能抑制aβ1
‑
42和aβ1
‑
40分泌的药物。
26.本发明的有益效果为：
27.1、使用慢病毒转染体系导入人源基因到cho细胞中，转染效率更好，基因插入拷贝数相对高。外源基因稳定。相比于用质粒导入，在以上几个方面的优势明显。
28.2、经过单克隆筛选后，稳定表达的细胞系可以持续传代。比纯用抗性筛选的细胞具有均一性好，基因组背景单一的优势。
29.3、细胞自身带荧光信号，可以根据荧光信号强弱判断外源基因的稳定性。
30.4、本细胞系已经经过药筛项目的投产测试，用于做细胞药效实验结果稳定。
附图说明
31.图1显示细胞系cho
‑
app/ps1在荧光显微镜下的检测结果。
32.图2显示荧光定量pcr检测外源基因app的转录水平。
33.图3显示荧光定量pcr检测外源基因psen1的转录水平。
34.图4显示elsia检测细胞中aβ1
‑
42的分泌量。
35.图5显示elsia检测细胞中aβ1
‑
40的分泌量。
具体实施方式
36.为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
37.实施例
38.一、主要材料
39.中国仓鼠卵巢细胞株(cho)：上海富衡生物科技有限公司，中国；293t：上海富衡生物科技有限公司，中国；无血清细胞冻存液：上海富衡生物科技有限公司，中国；1640培养基、pbs、胰酶、胎牛血清:gibico美国；青链霉素：gibco，美国；细胞培养耗材：corning，美国；depc水、te buffer：上海生工生物工程有限公司，中国；无水乙醇：生工生物工程(上海)股份有限公司，中国；异丙醇：生工生物工程(上海)股份有限公司，中国；质粒大抽试剂盒：mn公司，德国；细菌培养用琼脂粉(agar)：amresco公司，美国；细菌培养用胰化蛋白胨：oxoid公司，英国；细菌培养用酵母提取物：oxoid公司，英国；trans5α感受态细胞：北京全式金生物技术有限公司，中国；dna抽提试剂盒：axygen，美国；kod plus：toyobo，日本；引物合成及测序：金维智，中国；dna胶回收试剂盒：axygen，美国；重组酶：诺唯赞，中国；0.22um滤器：millipore，美国；puromycin：索莱宝，中国。
40.二、主要仪器
41.生物安全柜：海尔公司，中国；细胞培养箱：thermo公司，美国；医用冷藏冷冻箱：中科美菱低温科技有限公司，中国；台式低温高速离心机、冷冻离心机：heraeus，德国；制冰机：厦门国仪科学仪器有限公司，中国；磁力搅拌器：上海衡平仪器厂；电子天平、电子摇床：sartorius公司，德国；微量移液器：thermo公司，美国；恒温细菌培养箱：上海实验仪器厂有限公司，中国；vx200
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涡旋混合仪：labnet公司，美国；高压消毒锅、水浴锅：hirayama公司，日本；
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80℃立式超低温冰箱：esco公司，新加坡；跑胶系统及凝胶成像系统：bio
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rad，加拿大；倒置相差显微镜：olympus公司，日本；纯水仪：millpore公司，美国；低温超速离心机：eppendorf centrifuge，德国；nanodrop 2000微量紫外分光光度计：thermo，美国；pcr仪：bio
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rad，加拿大。
42.三、制备方法
43.1.细胞培养
44.中国仓鼠卵巢细胞株(cho)培养于1640培养基(10％胎牛血清，1％双抗)，培养条件为5％co2、95％湿度、37℃恒温；293t细胞培养于dmem高糖培养基(10％胎牛血清，1％双抗)，培养条件为5％co2、95％湿度、37℃恒温。
45.2.细胞传代
46.1)当中国仓鼠卵巢细胞株(cho)密度生长到80％左右，处于对数生长期时则可以进行传代。pbs洗1遍，除去残余血清，加入1ml 0.25％edta
‑
胰蛋白酶，使胰酶均匀铺满皿底，放入培养箱消化。1
‑
2min后取出培养皿并置于显微镜下观察，见贴壁细胞回缩变圆、透亮后，加入等体积完全培养液终止胰酶消化。小心吹打贴壁细胞形成细胞悬液，移入15ml无菌离心管，800rpm离心5min，将上清去除，根据培养皿大小取相应体积完全培养基重新悬起细胞沉淀。取大概1/4
‑
1/5的细胞进行传代，十字法轻摇晃培养皿使细胞分散均匀，置于37℃，5％co2培养箱继续培养。
47.2)当293t细胞密度生长到80％左右，处于对数生长期时则可以进行传代。pbs洗1遍，除去残余血清，加入1ml 0.25％edta
‑
胰蛋白酶，使胰酶均匀铺满皿底，放入培养箱消化。1
‑
2min后取出培养皿并置于显微镜下观察，见贴壁细胞回缩变圆、透亮后，加入等体积完全培养液终止胰酶消化。小心吹打贴壁细胞形成细胞悬液，移入15ml无菌离心管，800rpm
离心5min，将上清去除，根据培养皿大小取相应体积完全培养基重新悬起细胞沉淀。取大概1/4
‑
1/5的细胞进行传代，十字法轻摇晃培养皿使细胞分散均匀，置于37℃，5％co2培养箱继续培养。
48.3.构建人app(wt)/psen1(ps1,wt)双基因全长序列过表达的慢病毒
49.根据人app(wt)/ps1(wt)双基因全长序列及慢病毒载体序列设计并合成引物，合成引物序列如下：
50.app
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f:cctccatagaagattctagaatgctgcccggtttggcact
51.app
‑
r:gatcgcagatccttctcgagctagttctgcatctgctcaa
52.ps1
‑
f:cctccatagaagattctagaatgacagagttacctgcacc
53.ps1
‑
r:gatcgcagatccttctcgagctagatataaaattgatgga
54.将合成的粉末置于离心机中12000rpm离心5min，使管中粉末聚集于离心管的底部，加入ddh2o将其溶解为浓度为100μm的溶液。
55.4.慢病毒包装
56.该慢病毒包装系统为三质粒系统，组成为：pcmv
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dr8，pmd2.g，pgpd。我们采用293t作为慢病毒的包装细胞，转染前一天，按照50％的细胞密度接种293t细胞。转染过程按照hieff trans tm liposomal transfection reagent(上海翊圣生物科技有限公司)说明书进行。以6cm培养皿为例，需转染的质粒成分如下：
57.pcmv
‑
dr8
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.5μg
58.pmd2.g
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.5μg
59.pgpd
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.25μg
60.转染48h后，收集病毒上清，用0.22μm滤器过滤，采用millipore蛋白浓缩柱进行病毒浓缩，后续可用于目的细胞感染。
61.5.慢病毒感染目的细胞cho：
62.1)目的细胞准备：将状态良好的目的细胞接种于12孔板，接种的细胞密度因细胞的生长速度而不同，一般是保证第二天进行慢病毒感染时细胞汇合率在20％
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40％之间，培养过夜(需多设置一孔作为不加病毒的对照细胞孔)。
63.2)慢病毒感染目的细胞：准备完全培养基和polybrene混合物，polybrene的浓度为摸索得到的最适终浓度10μg/ml；弃去培养基并添加0.5ml polybrene培养基混合物，每孔加入对应病毒0.5ml(对照细胞孔用培养基替代病毒)；继续培养，慢病毒感染16h后，收集废弃病毒液，更换1ml新鲜培养基继续培养。
64.6.稳转细胞株培养与筛选
65.慢病毒感染48h后，可通过荧光显微镜观察gfp的表达效率，更换含适当puromycin浓度(10μg/ml)的新鲜培养基，筛选稳转细胞株。之后根据细胞状态，每2
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3天更换一次含有puromycin的新鲜培养基，直至没有病毒感染的对照细胞被puromycin全部杀死，即得到稳转细胞株。最后将细胞再进行一轮单克隆筛选，最后获得目的细胞系cho
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app/ps1。
66.7.模型验证
67.1)如图1所示，在荧光显微镜下，可以检测到该细胞能因激发而发射出绿色荧光信号。
68.2)应用荧光定量pcr检测外源基因的转录水平，如图2和3所示，表明均有高转录。
69.3)elsia检测细胞中aβ1
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42和aβ1
‑
40的分泌量，结果如图4和5所示，可检测到该细胞能稳定分泌aβ1
‑
42和aβ1
‑
40。
70.本发明通过利用慢病毒(lenti
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app/ps1
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gfp)转染cho细胞而导入人app(ensembldatabase：hgnc：620)和ps1(ensembldatabase：hgnc：9508)基因序列，成功构建了能稳定表达这两种基因的细胞系cho
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app/ps1。该病毒载体自身携带有gfp基因，因此只要有病毒成功转染细胞，即可在荧光显微镜下检测到绿色荧光信号。利用elisa试剂盒检测该细胞培养上清，可检测到该细胞能稳定分泌aβ1
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42和aβ1
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40。从而可以将改细胞作为一个筛选抑制aβ1
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42和aβ1
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40分泌的模型。
71.8.应用
72.共表达人源app和psen1基因的荧光细胞药筛模型可以应用于治疗ad药物的前期细胞水平筛选。
73.如药物研发公司制备了某种药物，则可以通过设计不同分组，最后检测出该药物是否能有效降低细胞分泌aβ1
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42和aβ1
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40的量。
74.分组设计为：
75.1.正常对照组(无药物添加)
76.2.阳性药物组(加入阳性药物)
77.3.溶剂组(仅添加药物溶媒)
78.4.待测药物1低剂量组
79.5.待测药物1中剂量组
80.6.待测药物1高剂量组
81.7.待测药物2低剂量组
82.8.待测药物2中剂量组
83.9.待测药物2高剂量组
84.使用本发明构建的细胞模型，可以高效的筛选出能有效抑制细胞分泌aβ1
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42和aβ1
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40的药物，从而为后期进一步研发治疗ad的药物提供可靠的筛选数据。
85.显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。