一种杂交瘤细胞株、A型流感病毒核蛋白单克隆抗体及其应用

no.1所示的猪流感病毒核蛋白基因与载体pcaggs 相连，获得重组质粒pcaggs
‑
np；以重组质粒pcaggs
‑
np为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株。
10.优选的，所述猪流感病毒核蛋白基因来源于猪流感病毒 a/swine/guangxi/18/2011(h1n1)。
11.本发明还提供了一种具有广谱生物学活性的a型流感病毒核蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。
12.本发明还提供了一种上述杂交瘤细胞株在制备检测猪流感病毒产品中的应用。
13.本发明还提供了一种上述单克隆抗体在制备检测猪流感病毒产品中的应用。
14.本发明还提供了一种上述单克隆抗体在制备猪流感病毒tcid
50
测定产品中的应用。
15.优选的，所述猪流感病毒包括h1n1、h1n2、h3n2、h5n1、 h7n9和h9n2亚型流感病毒。
16.优选的，所述产品包括免疫学诊断试剂、试纸条、试剂盒。
17.优选的，所述试剂盒包括酶联免疫吸附试验诊断试剂盒、胶体金试剂盒。
18.本发明的有益效果：
19.本发明提供的杂交瘤细胞株能够稳定分泌特异性好、效价高、具有广谱生物学活性的a型流感病毒核蛋白单克隆抗体，可与h1n1、 h1n2、h3n2、h5n1、h7n9和h9n2亚型流感病毒发生特异性反应。本发明提供的a型流感病毒核蛋白单克隆抗体可用于鉴定待测病毒是否为a型流感病毒，鉴定待测标本是否感染a流感病毒以及待测血清中是否含有a型流感病毒的抗体。本发明的单克隆抗体还可用于制备a型流感病毒或其抗体的免疫学诊断试剂，如酶联免疫吸附试验(elisa)诊断试剂盒、胶体金试剂盒等，用于检测动物(包括猪、禽等)排泄物、口鼻腔分泌物及粪便中是否含有a型流感病毒以及动物血清中是否含有a型流感病毒的抗体。本发明提供的a 型流感病毒核蛋白单克隆抗体能够用于流感病毒tcid
50
的测定，相比于血凝(ha)试验的检测结果，敏感性提高了大约47倍。
20.保藏说明
21.本发明提供的杂交瘤细胞株5e2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年6月23日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，保藏编号为cctccno:c2021165。
附图说明
22.图1为pcaggs
‑
np蛋白表达检测结果，其中a为重组质粒 pcaggs
‑
np ifa检测结果，b为pcaggs空载体ifa结果，c为空白对照ifa结果，d为western
‑
blot检测结果，在d图中m代表蛋白质相对分子质量标准，1代表pcaggs
‑
np转染293t细胞，2代表 pcaggs转染293t细胞；
23.图2为5e2 mab的western blot检测结果，其中m为蛋白质相对分子质量标准，1为5e2 mab孵育，2为sp2/0上清孵育；
24.图3为5e2 mab抗原结合活性的检测，其中a为h1n1亚型流感病毒；b为h1n2亚型流感病毒；c为h3n2亚型流感病毒；d为 h5n1亚型流感病毒；e为h7n9亚型流感病毒；f为h9n2亚型流感病毒。
具体实施方式
25.本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c2021165。所述杂交瘤细胞株的保藏时间为2021年6月23日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心。
26.在本发明中，所述杂交瘤细胞株的制备方法优选的包括如下步骤：将核苷酸序列如seq id no.1所示的猪流感病毒核蛋白基因与载体 pcaggs相连，获得重组质粒pcaggs
‑
np；以重组质粒pcaggs
‑
np 为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株。
27.在本发明中，所述核苷酸序列如seq id no.1所示的猪流感病毒核蛋白基因的获得过程，优选的包括如下步骤：取病毒 a/swine/guangxi/18/2011(h1n1)(哈尔滨兽医研究所分离、鉴定并保存)接种10日龄无特定病原(spf)鸡胚(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)，增殖72h后收获尿囊液，提取rna，逆转录获得病毒核蛋白(np)基因cdna，以cdna为模板进行pcr扩增即得。在本发明中，所述pcr扩增所用引物序列优选的为：上游引物npf: 5'
‑
catcgatatggcgtctcaaggcaccaa
‑
3'；下游引物npr:5'
ꢀ‑
gctcgagttagttgtcatactcctctg
‑
3'；所述pcr反应条件优选的为：95℃预变性5min，94℃1min，55℃退火30s，72℃延伸 1min，35个循环。
28.本发明对于猪流感病毒核蛋白基因与载体pcaggs相连的具体方式没有特殊限定，在具体实施例中，使用clai和xhoi对np基因和质粒pcaggs分别进行双酶切处理，纯化后分别测浓度，用t4 dna连接酶16℃孵育16h。本发明将np基因连接至载体pcaggs 中，转化后挑取单菌落并扩大培养，测序验证后，确认获得重组表达质粒pcaggs
‑
np。
29.在本发明中，以重组质粒pcaggs
‑
np为免疫原，采用杂交瘤细胞融合技术获得所述杂交瘤细胞株的过程中，所述免疫动物优选的为 balb/c小鼠。本发明对于杂交瘤细胞融合技术的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规杂交瘤细胞融合技术均可。
30.本发明还提供了一种具有广谱生物学活性的a型流感病毒核蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。
31.本发明a型流感病毒核蛋白单克隆抗体经ig亚类鉴定为igm，轻链为κ链，优选的是用杂交瘤细胞株细胞接种到实验动物腹腔产生腹水而获得，所述实验动物优选为balb/c小鼠。本发明杂交瘤细胞培养上清效价为1∶102、腹水效价为1∶105。本发明a型流感病毒核蛋白单克隆抗体(mab 5e2)可与流感病毒的np蛋白发生特异性反应，ifa检测结果显示mab 5e2可与h1n1、h1n2、h3n2、h5n1、 h7n9和h9n2亚型流感病毒发生特异性反应。
32.本发明还提供了一种上述杂交瘤细胞株或上述单克隆抗体在制备检测猪流感病毒产品中的应用。本发明还提供了一种上述单克隆抗体在制备猪流感病毒tcid
50
测定产品中的应用。
33.在本发明中，所述猪流感病毒优选的包括h1n1、h1n2、h3n2、 h5n1、h7n9和h9n2亚型流感病毒，所述产品优选的包括免疫学诊断试剂、试纸条、试剂盒，所述试剂盒优选的包括酶联免疫吸附试验诊断试剂盒、胶体金试剂盒。本发明将mab 5e2纯化后用于流感病毒tcid
50
的测定，相比于ha试验的检测结果，敏感性提高了大约47倍。
34.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
35.实施例1
36.重组表达质粒pcaggs
‑
np的构建与鉴定
37.取病毒a/swine/guangxi/18/2011(h1n1)(哈尔滨兽医研究所分离、鉴定并保存)接种10日龄无特定病原(spf)鸡胚(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)，增殖72h后收获尿囊液，利用tianampvirus rna kit病毒rna提取试剂盒提取rna，用通用引物uni12 (序列为：5'
‑
agcaaaagcagg
‑
3')(seq id no.2)逆转录获得病毒np基因cdna。以cdna为模板进行聚合酶链反应(pcr)扩增 np基因，所用引物：上游引物npf:5'
‑ꢀ
catcgatatggcgtctcaaggcaccaa
‑
3'(seq id no.3)；下游引物npr:5'
‑
gctcgagttagttgtcatactcctctg
‑
3'(seq idno.4)；pcr反应条件为：95℃预变性5min，然后94℃1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环。胶回收pcr产物，利用clai 和xhoi对np基因和质粒pcaggs分别进行双酶切处理，纯化后分别测浓度，用t4 dna连接酶16℃孵育16h，将np基因连接至载体 pcaggs中，转化后挑取单菌落并扩大培养，测序验证后，确认获得重组表达质粒pcaggs
‑
np。
38.将pcaggs
‑
np和pcaggs按lipofectamine ltx转染试剂盒说明书分别进行转染293t细胞；将转染60h后的293t细胞用4％多聚甲醛固定1h，以鸡抗siv多克隆血清作为一抗，二抗为荧光标记的抗鸡抗体，于荧光显微镜下观察。结果如图1a所示，由图1a可知转染pcaggs
‑
np的293t细胞呈现绿色的荧光，而空载体pcaggs 及未转染质粒的293t细胞未观察到绿色荧光(图1b，图1c)，表明所构建的真核表达载体pcaggs
‑
np的np基因能够在真核细胞中得到表达。
39.取pcaggs
‑
np和pcaggs转染60h后的293t细胞样品进行 sds
‑
page电泳，转移至nc膜上用鸡抗siv多克隆血清进行westernblot鉴定，结果如图1d所示。由图1d可以看出，转染pcaggs
‑
np 的293t细胞样品在56ku处出现一条明显的条带，与预期大小相符；而空载体则无此反应条带，进一步证实np蛋白在真核细胞中获得表达。
40.实施例2
41.免疫原dna的制备及小鼠免疫
42.采用聚乙二醇纯化pcaggs
‑
np，分光光度计测定其dna含量约为10.8μg/μl。将pcaggs
‑
np按100μg/只的剂量经腿部肌肉注射免疫4～5周龄balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，共免疫3次，每次间隔2周，细胞融合前3d再次腿部肌注150μg/只的质粒。
43.阳性杂交瘤细胞的筛选
44.制备饲养层细胞
45.细胞融合前一天，将未免疫的balb/c小鼠脱颈处死，用75％酒精浸泡5min。将消毒后的小鼠腹部向上固定在解剖板上，剪开小鼠腹部皮肤然后钝性剥离露出腹膜，更换剪刀，于腹膜处剪开小口，吸取2
‑
3ml rpmi medium1640培养基打入小鼠腹腔，吸打几次，获取腹腔巨噬细胞，800rpm离心10min，弃上清后用含有hat的培养基悬浮，将其加入到96孔细胞培养板中，100μl/孔，置于细胞培养箱中培养。
46.s2/0细胞的培养
47.从液氮中取出sp2/0细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，室温 800rpm离心10min使细胞沉淀，用血清浓度20％的dmem培养液重悬细胞，补加培养液后置于细胞培养箱中培养。
48.免疫脾细胞的制备
49.将免疫后的balb/c小鼠采血后脱颈处死，用75％酒精浸泡5min。浸泡好的小鼠腹部向上固定好，打开腹腔后取出脾脏，置于装有 dmem基础培养液的培养皿中，研磨脾释放脾细胞，收取脾细胞到 50ml无菌离心管中。
50.细胞融合
51.(1)将上述收集的脾细胞离心，800rpm离心10min，弃去培养液，用dmem培养液重悬细胞，吹吸混匀后计数。
52.(2)收集sp2/0细胞，800rpm离心10min，弃去培养液，细胞沉淀用dmem培养液重悬，吹吸混匀，计数。
53.(3)按4:1比例将脾细胞与sp2/0细胞混匀，800rpm离心10min，小心吸去上层的培养液。将离心管在ep管架上轻轻拖动，使细胞沉淀松动、充分混合。
54.(4)一边轻轻搅动细胞，一边加入0.8ml 37℃预热的peg，在 1min内将peg加完。
55.(5)手部紧握离心管静置1min后，慢慢加入37℃预热的dmem 培养液，终止反应，1min内滴加dmem培养液1ml，第2分钟加入2ml dmem培养液，第3分钟加入3ml dmem培养液，以终止 peg作用。
56.(6)于37℃细胞培养箱中静置5min，800rpm离心10min，弃去上层培养液，用40ml hat培养液重悬细胞，加入之前培养饲养层细胞的96孔细胞培养板中，100μl/孔，置于培养箱中培养。
57.阳性杂交瘤细胞的筛选
58.按常规间接elisa方法操作，以矩阵法确定最佳抗原包被浓度、血清最佳稀释度以及一抗、二抗的最佳作用时间，建立单克隆抗体 (mab)的elisa筛选方法。具体操作如下：
59.(1)以纯化的gx18病毒蛋白为包被抗原，将其稀释至1μg/ml、 2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml，包被elisa板， 100μl/孔，置于4℃过夜包被。第二天，甩出包被液，pbst洗板3 次，5min/次。
60.(2)加入5％脱脂乳封闭elisa板，200μl/孔，37℃封闭2h， pbst洗涤3次，5min/次。
61.(3)分别对阴、阳性血清进行1:100、1:200、1:400、1:800、1:1 600倍稀释，100μl/孔，37℃中作用1h，用pbst洗板3次，5min/ 次。
62.(4)加入1:4000稀释的羊抗鼠hrp
‑
igg，100μl/孔，37℃孵育1h，pbst重复洗板3次，5min/次。
63.(5)按100μl/孔的量加入tmb底物显色液，置于37℃温箱中作用4min，加入2mol/l的h2s04终止反应，50μl/孔，读取od
450nm
。
64.(6)进行elisa结果判定，以阳性孔od值最接近于1，阴性孔od值小于0.2，p/n值≥2.1的抗原包被浓度和血清稀释度作为最佳工作浓度。
65.融合10d后，用建立的elisa方法筛选杂交瘤细胞，阳性培养孔细胞用有限稀释法进行克隆纯化，直至所有克隆细胞100％阳性。
66.实施例3
67.mab亚类的鉴定
68.利用sbaclono
‑
typingtm systerm/hrp抗体亚类试剂盒对mab 亚型进行鉴定。具体方法如下：
69.(1)包被：将捕获抗体稀释，使其最终包被浓度为7μg/ml，每孔100μl加入elisa板
中，4℃过夜(16h左右)。
70.(2)封闭：弃去包被液，并用pbst洗板3次，每次5min。将 5％脱脂乳加入孔中，每孔200μl，37℃作用2h，pbst洗板3次。
71.(3)一抗：阳性杂交瘤细胞上清为一抗，每孔100μl，37℃孵育1h，pbst洗板3次。
72.(4)二抗：加入按1:500稀释的羊抗鼠二抗iggl、igg2b、igg2a、 igg3、iga、igm、λ、κ，每孔100μl，37℃孵育1h，pbst洗板3 次。
73.(5)显色：每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光作用10min，待显色完成之后，每孔加入50μl终止液，od
450nm
读取数值。
74.测得本发明杂交瘤细胞株(5e2)分泌的mab的抗体亚类为igm 型，轻链为κ链。
75.实施例4
76.5e2腹水制备及抗体纯化
77.腹水制备
78.向8周龄雌性balb/c小鼠腹腔内注射0.5ml fitc致敏，7天后每只小鼠接种约106个杂交瘤细胞(约0.5ml杂交瘤细胞悬液)，接种后7
‑
10天，观察小鼠生存状况，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水；将收集的腹水5000rpm离心10min，去除油脂等其他杂质之后冷冻保存。
79.igm亚型单抗的腹水纯化
80.根据pierce公司igm纯化试剂盒说明书对mab进行纯化，具体方法如下：
81.(1)mbp预装柱准备：打开mbp上部的盖子，将其下部的帽子去掉，让柱子里原有的贮存液靠重力作用自然流下，再用5ml的mbpcolumn preparation buffer冲洗柱子。
82.(2)腹水处理：腹水离心，5000rpm离心10min，去除油脂层，取其下部澄清液体，将其装入透析袋中，在ph为5.5的去离子水中透析，4℃透析24h(中间需要更换透析液2
‑
3次)，然后将预处理之后的腹水与binding buffer按1:3比例混合，备用。
83.(3)纯化腹水：
84.①
将mbp预装柱置于4℃冰箱，加入2ml的binding buffer自然沉降，去除废液。
85.②
加入4℃预冷的用binding buffer稀释的预处理的腹水，让其自然穿过凝胶，收集滤液，再次加入柱子中，如此重复3
‑
4次收集滤液(整个操作过程在4℃环境操作)。
86.③
加入42ml的binding buffer，让其自然流下，洗去未结合的蛋白，通过收集最后流下的3ml滤液(此操作过程在4℃环境操作)来检测洗脱效果。
87.④
将mbp预装柱及elution buffer在室温下放置一段时间，之后，加入4ml的elution buffer，让其自然流下，盖上底部盖子，室温下直立孵育至少1h。打开底部盖子，收集洗脱液。(通过加入更多的洗脱液0.5
‑
3ml检测洗脱效果)。
88.⑤
用10ml的去离子水清洗柱子，然后加入10ml binding buffer，先盖上底部盖子，再加入1.5ml binding buffer，盖上顶部盖子，将柱子直立于4℃冰箱内保存。
89.mab的elisa效价测定
90.纯化的全病毒蛋白包被elisa板，对其elisa效价进行测定。
91.具体方法如下：
92.(1)包被：用纯化的全病毒蛋白包被，每孔100μl加入elisa板中，4℃过夜(16h左右)。
93.(2)封闭：弃去包被液，并用pbst洗板3次，每次5min。将5％脱脂乳加入孔中，每孔200μl,37℃作用2h，pbst洗板3次。
94.(3)一抗：阳性杂交瘤细胞上清及制备腹水为一抗，其中，阳性杂交瘤细胞上清做10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6倍稀释，腹水做10
‑1、 10
‑2……
10
‑
12
倍稀释，同时设置sp2/0细胞上清为阴性对照，每孔100 μl，37℃孵育1h，pbst洗板3次。
95.(4)二抗：加入按1:5000稀释的hrp标记的羊抗鼠二抗，每孔100 μl，37℃孵育1h，pbst洗板3次。
96.(5)显色：每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光作用10min，待显色完成之后，每孔加入50μl终止液，od
450nm
读取数值。
97.测得杂交瘤细胞培养上清效价为1∶102、腹水效价为1∶105。
98.mab的western blot检测
99.将上述杂交瘤细胞株(5e2)分泌纯化获得的单克隆抗体(5e2 mab)进行western blot试验，结果如图2所示。由图2可知，5e2 mab 可与流感病毒的np蛋白在约56ku处产生特异性条带，而sp2/0上清则不与之发生反应，由此证明5e2 mab是针对siv np蛋白线性表位的单克隆抗体。
100.实施例5
101.mab抗原结合活性的检测
102.以h1n1、h1n2、h3n2、h5n1、h7n9和h9n2亚型流感病分别感染mdck单层细胞，感染72h后的mdck细胞用4％多聚甲醛固定1h，pbst洗3次；以5e2 mab作为一抗，37℃作用3h，pbst 洗3次；以羊抗鼠igg抗体(igg
‑
fitc)为二抗，室温作用45min， pbst洗三次后，于荧光显微镜下观察。结果如图3所示，所有病毒感染的细胞孔均出现明显的绿色荧光，表明本发明单克隆抗体可与 h1n1、h1n2、h3n2、h5n1、h7n9和h9n2亚型流感病毒发生特异性反应，具有广谱生物学活性。
103.实施例6
104.5e2 mab在病毒组织半数感染量(tcid
50
)测定中的应用
105.ha试验测定方法
106.将mdck细胞传代培养，铺制96孔细胞培养板，置于37℃、 5％co2培养箱中培养，待细胞汇合度达到80％时用于测定病毒的 tcid
50
；将待测病毒按照1:10、1:100、1:1000等依次作10倍倍比稀释，具体方法如下：在96孔细胞培养板进行，每孔中加入135μl 的细胞维持液(dmem营养液添加终浓度为1μg/ml的tpck
‑
胰酶)，在第一列中每孔加入15μl的病毒液，设置4个重复孔，吹打混匀后吸取15μl至第二列，按上述操作稀释至第12列，4℃放置备用；将 96孔细胞培养板弃去培养液，每孔加入100μl维持液洗2遍，弃去维持液；将稀释好的病毒转移至细胞培养板中，37℃、5％co2培养箱中培养。期间观察细胞病变，72h后，测ha活性，汇总ha阳性结果及其对应的病毒稀释倍数，按照reed
‑
muench法计算tcid
50
。
107.immunocytochemistry(icc)试验测定方法
108.溶液配制
109.洗涤液：含有0.05％吐温的pbs(1ml吐温+2lpbs)；固定液： 4％多聚甲醛；显色液：aec染色试剂盒；终止液：蒸馏水；一抗： np单抗，1：500稀释；二抗：hrp标记的山羊抗鼠二抗1：1000稀释。
110.操作步骤
111.(1)铺板：将mdck细胞传代培养，铺制96孔细胞培养板，置于37℃、5％co2培养箱中培养，待细胞汇合度达到90％时用于测定病毒的tcid
50
；
112.(2)病毒稀释：将待测病毒按照1:10、1:100、1:1000等依次作 10倍倍比稀释，具体方法如下：在96孔细胞培养板进行，每孔中加入135μl的细胞维持液(dmem营养液添加终浓度为1μg/ml的 tpck
‑
胰酶)，在第一列中每孔加入15μl的病毒液，设置4个重复孔，吹打混匀后吸取15μl至第二列，按上述操作稀释至第12列，4℃放置备用；
113.(3)洗板：将96孔细胞培养板弃去培养液，每孔加入100μl 维持液洗2遍，弃去维持液，将稀释好的病毒转移至细胞培养板中， 37℃、5％co2培养箱中培养，期间观察细胞病变；
114.(4)固定：72h后，弃去96孔板多余上清，洗涤液洗两次后每孔加入100μl固定液，室温1h；
115.(5)孵育一抗：弃上清，洗涤液洗板3次，5min/次，每孔加入100μlnp抗体，室温作用1h；
116.(6)孵育二抗：弃上清，洗涤液洗涤3次，5min/次，每孔加入 100μl二抗，室温作用10min；
117.(7)显色：弃上清，洗涤液洗涤3次，5min/次，每孔加入100 μl显色剂(现配现用)，室温作用60min；弃上清，每孔加入50μl 蒸馏水，镜下观察，统计含有染色细胞的对应孔及其相应的病毒稀释倍数，按照reed
‑
muench法计算tcid
50
。
118.利用上述两种方法，分别测定了两株流感病毒gx18和gd9的 tcid
50
，结果如表1所示。由表1可以看出，采用本发明单克隆抗体检测(icc检测)病毒的敏感性比血凝(ha)检测的敏感性提高了大约47倍。
119.表1两株流感病毒tcid
50
的测定结果
[0120][0121]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。