一种适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片及其应用的制作方法

1.本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及一种适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片及其应用。


背景技术：

2.微流控芯片又被称芯片实验室，指的是在一块只有几平方厘米甚至更小的芯片上构建的化学或生物实验室。由微管通道构成网络，在微纳尺度下对液体进行可控化操作以实现一般化学或生物实验室的大部分操作。其优势在于所需样本体积小、通量高、自动化控制等，并作为前沿技术广泛发展并应用于临床实践、食物或环境分析、病毒检测等，还能够模拟体内的生理环境，进行生理或近似生理条件下的生物细胞实验。而现行的微流控芯片的通道尺寸与大多数细胞的尺寸相仿，具有网格式二维或三维通道结构及微米级的通道尺寸，可同时在时间和空间上控制流体等特点及优势，所以现阶段的微流控芯片在生物学的重要应用邻域之一就是细胞生物学。近年来，利用微流控芯片技术来研究细胞迁移生物学行为受到许多研究者的关注，使得微流控芯片成为细胞研究的重要平台。
3.由于其微型化和微环境控制的优势，在过去20年中，微流控芯片被广泛应用于研究细胞迁移和细胞趋化。此外，微流控芯片已被开发和改进为细胞迁移相关疾病的诊断工具。更具体地说，一些研究小组促进了细胞迁移相关的疾病在微流控芯片上的功能表型的研究。论文：杨柯.基于微流控芯片的中性粒细胞运动及趋化性研究[d].中国科学技术大学,2017中研究报道了在微流控芯片上的成纤维细胞生长因子介导下的人类血液中性粒细胞的趋化性。此外，我们的团队还在医院测试中展示了将微流控和智能手机集成用于研究正常志愿者和慢性阻塞性肺病(copd)患者中性粒细胞趋化性的优势和可行性。先前的先进成果为基于微流控装置的细胞迁移和趋化性功能表型研究奠定了坚实的基础。
[0004]
然而，大多数微流控芯片仅适用于在视场下(fov)一次监测单个微通道中的细胞迁移，这限制了在不同实验条件下对中性粒细胞趋化性进行平行性和可比性研究的应用。虽然平行排列多个微流控芯片可以提高检测通量，但这种方法仍然无法在单个fov下同时观察多个细胞迁移实验。观察多个通道时需要移动显微镜或微流控芯片，复杂且会增加时间成本和劳动强度。
[0005]
公开号为cn112501005a的专利申请公开一种细胞迁移特性分析用多通道微流控芯片及方法，但是该微流控芯片中的细胞进样管道长短不一，且其试剂进样管道不一致，实验过程中易导致误差的产生。


技术实现要素：

[0006]
本发明所要解决的技术问题在于现有技术中的微流控芯片中的细胞进样管道长短不一，且其试剂进样管道不一致，实验过程中易导致误差的产生，提供一种适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片及其应用。
[0007]
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
[0008]
一种适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片，包括玻璃基板及紧密贴合设置在玻璃基板上的芯片主体，所述芯片主体上刻蚀呈环形阵列分布的多组独立设置的细胞迁移运动分析单元；
[0009]
所述细胞迁移运动分析单元包括细胞加载单元、趋化迁移单元、细胞隔离单元；所述细胞加载单元与趋化迁移单元连通，所述趋化迁移单元包括细胞培养液注入口、细胞培养液输送通道、趋化因子注入口、趋化因子输送通道、第一蛇形通道、第二蛇形通道、第三蛇形通道和细胞迁移运动通道，所述第一蛇形通道和第二蛇形通道之间设有压力平衡处；
[0010]
所述细胞注入口、趋化因子注入口分别连通至芯片主体，所述细胞培养液输送通道的两端分别与细胞培养液注入口和第一蛇形通道连通，所述趋化因子输送通道的两端分别与趋化因子注入口和第二蛇形通道连通，所述第一蛇形通道和第二蛇形通道均匀第三蛇形通道的一端连通，所述第三蛇形通道的另一端与细胞迁移运动通道连通，致使趋化因子在细胞迁移运动通道内产生线性浓度梯度；
[0011]
所述细胞隔离单元分别与细胞加载单元和细胞迁移运动通道连通，线性浓度梯度未形成时，所述细胞隔离单元用以阻拦细胞从细胞加载单元流入细胞迁移运动通道。
[0012]
工作原理：从细胞加载单元注入细胞，待细胞整齐排列在细胞迁移运动通道的边缘，通过注射泵同时将多组趋化因子和细胞培养液分别注入到相应的细胞迁移单元的趋化因子注入口和细胞培养液注入口；趋化因子和细胞培养液注入后，经过第一蛇形通道和第二蛇形通道的压力平衡处，来自高压流的部分介质被推到低压流中，使趋化因子注入口和培养液注入口的压力达到平衡，然后通过第三蛇形通道，从而在细胞迁移运动通道中构建成稳定的线性浓度梯度环境。
[0013]
列在细胞迁移运动通道边缘的细胞感受到趋化因子浓度梯度后，将会发生极化形变，随后穿过细胞隔离带，进入细胞迁移运动通道。
[0014]
在细胞进入细胞迁移运动通道时，通过显微镜采集图像参数，采集不同趋化因子浓度梯度环境中的细胞趋化迁移运动状态。
[0015]
有益效果：本发明有多个独立细胞迁移运动单元，可以同时观测多组通道，极大地提高了检测通量，突破了常规的单浓度趋化因子对细胞迁移作用的研究模式。
[0016]
现有技术中各通道长度不一致，梯度的建立存在差异，为减小数据差异，需要采用多块芯片重复实验，会影响细胞活力，本发明多个细胞迁移运动单元呈环形阵列分布，多个独立细胞迁移运动单元完全相同，每个细胞迁移运动单元对应的部分完全相同，可以排除由于通道长度不均带来的实验结果的误差。
[0017]
通过细胞隔离单元使细胞注入后整齐排列在细胞迁移运动通道的边缘。所有细胞起跑线一致，方便实验的进行并减少误差。
[0018]
通过第一蛇形通道、第二蛇形通道和第三蛇形通道产生稳定、持续的浓度梯度，减少因趋化因子快速扩散而造成浓度提取曲线不稳定对实验结果造成的影响。
[0019]
本芯片适用性较强，可用于免疫细胞、癌细胞、t细胞等的趋化迁移表型研究。
[0020]
在微纳尺度下模拟人体毛细血管微环境，模拟毛细血管中的细胞在受到不同浓度的趋化因子的刺激后趋化迁移状态。
[0021]
相比于四通道，通道的提升，然后通过对各个通道数据分析再取平均值，可极大的减少实验数据误差，如做糖尿病病人样本分析时，每个病人同时做3组再取得平均值，每个
芯片可以做两个病人。
[0022]
优选地，所述细胞加载单元包括细胞注入口和细胞传递通道，所述细胞传递通道的一端与细胞注入口连通，所述细胞传递通道的另一端与细胞隔离带的一侧连通。
[0023]
优选地，所述细胞隔离单元包括细胞隔离带，所述细胞传递通道的一端与细胞隔离带的一侧连通，所述细胞隔离带位于细胞迁移运动通道内，所述细胞隔离带的刻蚀高度远小于其他通道的高度。
[0024]
有益效果：由于细胞隔离带的高度小于细胞传递通道的高度，当细胞大于细胞隔离带的高度时，细胞在细胞传递通道内，细胞在细胞迁移通道的边缘处排列，所有细胞的运动初始点相同，同时保证所有细胞感受的初始趋化因子浓度条件相同，当所需的细胞足够时或者所有细胞在细胞迁移通道内的细胞数量接近时，再注入趋化因子，细胞才会形变趋化迁移。
[0025]
优选地，所述细胞迁移运动分析单元为六组。
[0026]
综合考虑设备的硬性条件如显微镜视场大小、迁移管道必须满足细胞足够长的迁移距离，从而对各管道不断进行排布、比对和测试所能做出的最大通量。
[0027]
优选地，所述细胞迁移运动分析单元还包括排出单元，所述排出单元包括废液口和废液通道，所述废液通道的一端与废液口连通，所述废液通道的另一端与细胞迁移运动通道连通。
[0028]
有益效果：废液通过液体压力从废液通道排入废液口储存。
[0029]
优选地，所述第一蛇形通道的中部与第二蛇形通道的中部连通。
[0030]
第一蛇形通道的中部与第二蛇形通道的中部连通，形成压力平衡处。
[0031]
优选地，所述第三蛇形通道的一端设有两个蛇形进液通道，两个蛇形进液通道分别与第一蛇形通道的另一端、第二蛇形通道的另一端连通，两个蛇形通道再分别与三个蛇形进液通道连通，所述第三蛇形通道的另一端汇集后与细胞迁移运动通道连通。
[0032]
优选地，所述细胞迁移运动通道长度方向与细胞隔离带的长度方向之间设有第一夹角，所述废液通道长度方向与细胞隔离带的长度方向之间设有第二夹角，所述第一夹角为30度，第二夹角为35度。
[0033]
采用适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片的细胞迁移分析方法，包括以下步骤：
[0034]
(1)从细胞加载单元注入细胞，待细胞整齐排列在细胞迁移运动通道的边缘；
[0035]
(2)通过注射泵同时将多组趋化因子和细胞培养液分别注入到相应的细胞迁移单元的趋化因子注入口和细胞培养液注入口，分别流入趋化因子输送通道和细胞培养液输送通道，经过第一蛇形通道和第二蛇形通道的压力平衡处，趋化因子注入口和培养液注入口的压力达到平衡，然后通过第三蛇形通道，在细胞迁移运动通道中构建成稳定的线性浓度梯度环境。
[0036]
有益效果：本芯片适用性较强，可用于免疫细胞、癌细胞、t细胞等的趋化迁移表型研究。使用注射泵同时注入，减少因人工注入导致加样速度和时间不均而引起的实验误差。
[0037]
本发明的优点在于：本发明有多个独立细胞迁移运动单元，可以同时观测多组通道，极大地提高了检测通量，突破了常规的单浓度趋化因子对细胞迁移作用的研究模式。
[0038]
现有技术中各通道长度不一致，梯度的建立存在差异，为减小数据差异，需要采用
多块芯片重复实验，会影响细胞活力，本发明多个细胞迁移运动单元呈环形阵列分布，多个独立细胞迁移运动单元完全相同，每个细胞迁移运动单元对应的部分完全相同，可以排除由于通道长度不均带来的实验结果的误差。
[0039]
通过细胞隔离单元使细胞注入后整齐排列在细胞迁移运动通道的边缘。所有细胞起跑线一致，方便实验的进行并减少误差。
[0040]
通过第一蛇形通道、第二蛇形通道和第三蛇形通道产生稳定、持续的浓度梯度，减少因趋化因子快速扩散而造成浓度提取曲线不稳定对实验结果造成的影响。
[0041]
本芯片适用性较强，可用于免疫细胞、癌细胞、t细胞等的趋化迁移表型研究。
[0042]
在微纳尺度下模拟人体毛细血管微环境，模拟毛细血管中的细胞在受到不同浓度的趋化因子的刺激后趋化迁移状态。
[0043]
相比于四通道，通道的提升，然后通过对各个通道数据分析再取平均值，可极大的减少实验数据误差，如做糖尿病病人样本分析时，每个病人同时做3组再取得平均值，每个芯片可以做两个病人。
[0044]
使用注射泵同时注入，减少因人工注入导致加样速度和时间不均而引起的实验误差。
附图说明
[0045]
图1为本发明实施例1中适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片的透视图；
[0046]
图2为本发明实施例1中适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片的实物图；
[0047]
图3为本发明实施例1中细胞迁移运动分析单元的结构示意图；
[0048]
图4为本发明实施例1中一组细胞迁移运动分析单元的结构示意图；
[0049]
图5为本发明芯片中细胞迁移方向示意图；其中细胞传递通道和细胞迁移运动通道高度均为70μm，细胞传递通道宽度为40μm，细胞迁移运动通道宽度为270μm，细胞隔离带高度为3μm，宽度为115μm。图片仅为演示说明，图片尺寸与实际尺寸比例略有不同；
[0050]
图6为本发明实施例1中第一蛇形通道和第二蛇形通道压力平衡处浓度梯度荧光图；
[0051]
图7为本发明实施例2中芯片多个管道浓度梯度荧光图；
[0052]
图8为本发明实施例2中芯片多个管道浓度梯度荧光曲线图；
[0053]
图9为本发明实施例5中芯片检测多种不同癌细胞中在相同浓度人表皮生长因子下的实际趋化迁移情况；
[0054]
图10为本发明实施例6中芯片检测乳腺癌细胞在相同浓度人表皮生长因子下的实际趋化迁移情况；
[0055]
图11为本发明实施例3中芯片检测中性粒细胞在相同浓度趋化因子下的实际趋化迁移情况；
[0056]
图12为本发明实施例4中芯片检测糖尿病患者中性粒细胞在相同浓度人表皮生长因子下的实际趋化迁移情况，其中管道1、2、3为同一样本，管道4、5、6为同一样本，每块芯片为每组样本提供三次重复独立实验，得出每组数据后再取平均值；
[0057]
图中：玻璃基板1；芯片主体2；细胞迁移运动分析单元21；细胞注入口211；细胞传递通道212；细胞培养液注入口213；细胞培养液输送通道214；趋化因子注入口215；趋化因
子输送通道216；第一蛇形通道217；压力平衡处2171；第二蛇形通道218；第三蛇形通道219；细胞迁移运动通道220；细胞隔离带221；废液口222；废液通道223。
具体实施方式
[0058]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0059]
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0060]
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
[0061]
实施例1
[0062]
一种适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片，如图1-图6所示，包括玻璃基板1和芯片主体2，芯片主体2上刻蚀多组细胞迁移运动分析单元21，多组细胞迁移运动分析单元21呈环形阵列分布，每组细胞迁移运动分析单元21旋转对称；本实施例中细胞迁移运动分析单元21为六组，设置为六组是在显微镜视场下的最大通量，芯片主体2设有细胞迁移运动分析单元21的一面与玻璃基板1通过清洗、除尘和等离子体键合工艺处理后实现两者之间的紧密贴合。流体在玻璃基板1和芯片之间流动，玻璃基板1具有较高的透光性和导热性，使用显微镜时方便观察和导热(设置37℃模拟人体体温时)。
[0063]
如图1-图4所示，细胞迁移运动分析单元21包括细胞加载单元、趋化迁移单元、细胞隔离单元和排出单元；细胞加载单元包括细胞注入口211和细胞传递通道212；趋化迁移单元包括细胞培养液注入口213、细胞培养液输送通道214、趋化因子注入口215、趋化因子输送通道216、第一蛇形通道217、第二蛇形通道218、第三蛇形通道219和细胞迁移运动通道220；细胞隔离单元包括细胞隔离带221；排出单元包括废液口222和废液通道223。
[0064]
细胞注入口211、趋化因子注入口215、细胞培养液注入口213、废液口222与芯片主体2连通，细胞注入口211、趋化因子注入口215、细胞培养液注入口213用以加入对应的细胞、趋化因子和细胞培养液，废液口222用以排出废液。
[0065]
趋化因子输送通道216的一端与趋化因子注入口215连通，趋化因子输送通道216的另一端与第一蛇形通道217的一端连通，细胞培养液输送通道214的一端与细胞注入口211连通，细胞培养液输送通道214的另一端与第二蛇形通道218的一端连通，第三蛇形通道219的一端设有两个蛇形进液通道，两个蛇形进液通道分别与第一蛇形通道217的另一端、第二蛇形通道218的另一端连通，两个蛇形通道再分别与三个蛇形进液通道连通，以此类推，形成金字塔形网络分支微通道，其中金字塔形网络分支微通道为现有技术，第三蛇形通道219的另一端汇集后与细胞迁移运动通道220连通。
[0066]
第一蛇形通道217的中部与第二蛇形通道218的中部连通，形成压力平衡处2171，压力平衡出浓度梯度荧光图如图5所示，两种不同浓度的流体分别沿第一蛇形通道217和第二蛇形通道218行进，在连通处相遇，使流速和压力相同，来自高压流的部分介质被推入低压流中，使趋化因子注入口215和培养液注入口的压力达到平衡。
[0067]
第三蛇形通道219用于分离合并和混合流体，使来自两个不同浓度的输入的扩散
混合能够产生近乎线性的浓度梯度，每个微通道含有不同比例浓度的趋化因子，趋化因子在细胞迁移运动通道220中汇聚，使得浓度梯度垂直于趋化因子流体，并且梯度通过对流扩散原理在细胞迁移运动通道220产生稳定的线性浓度梯度，细胞迁移运动通道220用于观察细胞的迁移表型。
[0068]
细胞传递通道212的一端与细胞注入口211连通，细胞传递通道212的另一端与细胞隔离带221的一侧连通，细胞隔离带221位于细胞迁移运动通道220内，细胞隔离带221的刻蚀高度远小于其他通道的高度，如细胞隔离带221的高度为3μm，细胞传递通道212、第一蛇形通道217、第二蛇形通道218、第三蛇形通道219、第四蛇形通道和细胞迁移运动通道220的高度为70μm。
[0069]
由于细胞隔离带221的高度小于细胞传递通道212的高度，当细胞大于细胞隔离带221的高度时，细胞在细胞传递通道212内，细胞在细胞迁移通道的边缘处排列，所有细胞的运动初始点相同，同时保证所有细胞感受的初始趋化因子浓度条件相同，当所需的细胞足够时或者所有细胞在细胞迁移通道内的细胞数量接近时，再注入趋化因子，细胞才会形变趋化迁移。
[0070]
废液通道223的一端与废液口222连通，废液通道223的另一端与细胞迁移运动通道220连通，废液通过液体压力从废液通道223排入废液口222储存。
[0071]
为配合细胞迁移运动分析单元21的呈环形阵列分布，细胞迁移运动通道220长度方向与细胞隔离带221的长度方向、废液通道223长度方向与细胞隔离带221的长度方向之间设置一定的角度，具体角度大小根据实际需要设置，本实施例中细胞迁移运动通道220长度方向与细胞隔离带221的长度方向之间的夹角为30度，废液通道223长度方向与细胞隔离带221的长度方向之间的夹角为35度。
[0072]
工作原理：
[0073]
(1)制备不同浓度的趋化因子溶液、细胞培养溶液以及细胞粘附溶液，将细胞置于细胞培养溶液中培养；
[0074]
(2)将细胞粘附溶液通过注入每个孔以铺满整个芯片的通道；
[0075]
(3)将细胞粘附溶液吸出，将细胞培养液注入芯片所有通道；
[0076]
(4)将适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片放入显微镜系统，显微镜设置在37℃以模拟人体环境，找到细胞迁移运动区域并调整好焦距；
[0077]
(5)先将细胞培养液吸出，再将细胞注入细胞注入口211；
[0078]
(6)从显微镜中观察细胞，待其整齐排列在细胞迁移运动通道220的边缘，通过注射泵同时将多组趋化因子和细胞培养液分别注入到相应的细胞迁移单元的趋化因子注入口215和细胞培养液注入口213；趋化因子和细胞培养液注入后，经过第一蛇形通道217和第二蛇形通道218的压力平衡处2171，来自高压流的部分介质被推到低压流中，使趋化因子注入口215和培养液注入口的压力达到平衡，然后通过具有金字塔形网络分支微通道结构的第三蛇形通道219，以便于在细胞迁移运动通道220中构建成稳定的线性浓度梯度环境。
[0079]
(7)列在细胞迁移运动通道220边缘的细胞感受到趋化因子浓度梯度后，将会发生极化形变，随后穿过细胞隔离带221，进入细胞迁移运动通道220。
[0080]
(8)在细胞进入细胞迁移运动通道220时，通过显微镜采集图像参数，采集不同趋化因子浓度梯度环境中的细胞趋化迁移运动状态。
[0081]
有益效果：本发明有多个独立细胞迁移运动单元，可以同时观测多组通道，极大地提高了检测通量，突破了常规的单浓度趋化因子对细胞迁移作用的研究模式。
[0082]
采用旋转式设计，多个独立细胞迁移运动单元完全相同，每个细胞迁移运动单元对应的部分完全相同，可以排除由于通道长度不均带来的实验结果的误差。
[0083]
芯片母模采用双层光刻技术，使芯片拥有细胞预校准结构，即细胞隔离带221，注入细胞后，其会整齐排列在细胞迁移运动通道220的边缘。所有细胞起跑线一致，方便实验的进行并减少误差。
[0084]
拥有基于蛇形通道的梯度发生器，能够产生稳定、持续的浓度梯度，减少因趋化因子快速扩散而造成浓度提取曲线不稳定对实验结果造成的影响。
[0085]
本芯片适用性较强，可用于免疫细胞、癌细胞、t细胞等的趋化迁移表型研究。
[0086]
在微纳尺度下模拟人体毛细血管微环境，模拟毛细血管中的细胞在受到不同浓度的趋化因子的刺激后趋化迁移状态。
[0087]
相比于四通道，通道的提升，然后通过对各个通道数据分析再取平均值，可极大的减少实验数据误差，如做糖尿病病人样本分析时，每个病人同时做3组再取得平均值，每个芯片可以做两个病人。
[0088]
实施例2
[0089]
采用实施例1中适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片的细胞迁移分析方法，包括以下步骤：
[0090]
(1)制备fluoresein isothlocyanate荧光溶液和浓度为0.4％的bsa溶液；
[0091]
(2)将芯片放入显微镜系统中，调节焦距并设置荧光观察模式和参数；
[0092]
(3)利用注射泵同时将100μl的荧光溶液和0.4％的bsa溶液分别注入到6组趋化因子注入口215和细胞培养液注入口213；
[0093]
(4)实时观察多个细胞迁移运动通道220中的荧光强度情况，并设置显微镜的拍摄时间参数，持续拍摄30min；
[0094]
(5)观察荧光图像变化以确定浓度梯度的保持时间，多个管道浓度梯度荧光图和荧光曲线图如图7和图8所示。
[0095]
实施例3
[0096]
采用实施例1中适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片测定不同浓度趋化因子(fmlp)对中性粒细胞趋化影响，包括以下步骤：
[0097]
(1)从血液中分离中性粒细胞后放入培育箱中培育；
[0098]
(2)制备0nm、10nm、20nm、50nm、100nm、150nm的fmlp溶液，0.4％的bsa溶液以及1g/l fibronectin溶液；
[0099]
(3)将fibronectin溶液注入每个注入口，约一个小时后吸出，再注入0.4％bsa溶液；
[0100]
(4)半小时后将芯片放入显微镜系统中，调节焦距并将0.4％bsa溶液吸出；
[0101]
(5)将中性粒细胞通过注射泵同时注入6个细胞注入口211中；使用注射泵同时注入，减少因人工注入导致加样速度和时间不均而引起的实验误差；
[0102]
(6)观察细胞是否均匀整齐排列在细胞定位通道中；
[0103]
(7)待细胞整齐排列在定位通道中，再通过注射泵同时往细胞培养液注入口213和
趋化因子注入口215中分别注入0.4％的bsa溶液和0nm、10nm、20nm、50nm、100nm、150nm的fmlp溶液；
[0104]
(8)实时观察多个细胞迁移运动通道220中的细胞迁移情况，并设置显微镜的拍摄时间参数，获得90张细胞运动图像；
[0105]
(9)得到数据进行分析，得到细胞的趋化性指数、总迁移距离、运动速度等其他数据。
[0106]
如图11所示，从实施例3中可以得出，对于中心粒细胞，趋化因子浓度为100nm时，迁移效果最好。
[0107]
实施例4
[0108]
采用实施例1中适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片对糖尿病病人中心粒细胞的趋化能力进行测试，步骤如下：
[0109]
(1)采集两例糖尿病2期病人2ml血液样本，从血液中分离中性粒细胞后放入培育箱中培育；
[0110]
(2)制备100nm的fmlp溶液(通过实施例3验证该浓度下细胞趋化效果最好)、0.4％的bsa溶液以及1g/l fibronectin溶液；
[0111]
(3)将fibronectin溶液注入每个孔，约一个小时后吸出，再注入0.4％的bsa溶液；
[0112]
(4)半小时后将芯片放入显微镜系统中，调节设置温度为37℃以模拟人体温度，调节焦距并将0.4％bsa溶液吸出；
[0113]
(5)将两份血液样取出混合摇匀，其中一份样本注入细胞注入口211中，另一份样本注入细胞注入口211；
[0114]
(6)观察细胞是否均匀整齐排列在细胞定位通道中；
[0115]
(7)待细胞整齐排列在定位通道中，再通过注射泵同时往细胞培养液注入口213和趋化因子注入口215中分别注入0.4％的bsa溶液和100nm的fmlp溶液；使用注射泵同时注入，减少因人工注入导致加样速度和时间不均而引起的实验误差；
[0116]
(8)实时观察多个细胞迁移运动通道220中的细胞迁移情况，并设置显微镜的拍摄时间参数，获得90张细胞运动图像；
[0117]
(9)得到数据进行分析，得到细胞的趋化性指数、总迁移距离、运动速度等其他数据，分析糖尿病病人的中心粒细胞的迁移数据，评估细胞迁移能力，其中实际趋化迁移情况如图12所示。
[0118]
实施例5
[0119]
采用实施例1中适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片对各类癌细胞的趋化能力进行测试，步骤如下：其中包括乳腺癌细胞(mda-mb-231)，正常胃黏膜上皮细胞(ges-1)，甲状腺未分化癌细胞(cal-62)，宫颈癌细胞(hela)，脑胶质癌细胞(u118)，肝癌细胞(hepg2)；
[0120]
(1)配制浓度为10％的胎牛血清，并且按照每100ml加入1ml双抗(青霉素/链霉素)，再取少许将10％胎牛血清加入dmem配制成浓度为1％的胎牛血清；
[0121]
(2)配制浓度为2μg/ml rat tail collagen(鼠尾i型胶原)和浓度为200ng/ml的egf(人表皮生长因子)；
[0122]
(3)将2μg/ml鼠尾i型胶原注入每个孔，放入培养箱孵育30min，然后吸出，在室温
下每个孔注入10％胎牛血清，等待一小时；
[0123]
(4)选用多种癌细胞进行实验，细胞需在添加10％fbs和1％青霉素/链霉素的dme/f12培养基中培养。所有培养物定期传代，并在含有5％co2的加湿培养箱中保持在37℃；
[0124]
(5)分别制备含1％胎牛血清的各类癌细胞细胞悬液：取正常培养的对数生长期的细胞，弃原培养基(含10％胎牛血清)，用pbs清洗，加入0.5ml胰蛋白酶于37℃消化1min，加入2ml dmem培养基，终止消化，轻轻将细胞从培养皿底吹打下来，收集到离心管中，在转速为1000rpm的离心机中离心5min，弃上清液，加入适量1％胎牛血清细胞重悬细胞，形成均匀的细胞悬液，放入培养箱中备用。
[0125]
(6)从培养箱中取出芯片，将多种不同的癌细胞分别注入细胞注入口211；
[0126]
(7)观察细胞是否均匀整齐排列在细胞定位通道中；
[0127]
(8)待细胞整齐排列在定位通道中，再通过注射泵同时往细胞培养液注入口213和趋化因子注入口215中分别注入1％胎牛血清和200ng/ml的egf；使用注射泵同时注入，减少因人工注入导致加样速度和时间不均而引起的实验误差；
[0128]
(9)待细胞整齐排列在定位通道中，再通过注射泵同时往细胞培养液注入口213和趋化因子注入口215中分别注入1％胎牛血清和200ng/ml的egf；
[0129]
(10)得到数据进行分析，得到细胞总迁移距离，分析癌细胞迁移数据，评估乳腺癌细胞的细胞迁移能力，其中图9为不同癌细胞中在相同浓度人表皮生长因子下的实际趋化迁移情况。
[0130]
实施例6
[0131]
采用实施例1中适用于细胞迁移分析的多通道微流控芯片对乳腺癌细胞的趋化能力进行测试，步骤如下：
[0132]
通过实施例5验证在相同的趋化因子浓度下，乳腺癌细胞趋化效果最好。
[0133]
(1)配制浓度为10％的胎牛血清，并且按照每100ml加入1ml双抗(青霉素/链霉素)，再取少许将10％胎牛血清加入dmem配制成浓度为1％的胎牛血清；
[0134]
(2)配制浓度为2μg/ml rat tail collagen(鼠尾i型胶原)和浓度为10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml和200ng/ml的egf(人表皮生长因子)；
[0135]
(3)将2μg/ml鼠尾i型胶原注入每个孔，放入培养箱孵育30min，然后吸出，在室温下每个孔注入10％胎牛血清，等待一小时。
[0136]
(4)选用乳腺癌细胞株(mda-mb-231)进行实验，细胞需在添加10％fbs和1％青霉素/链霉素的dme/f12培养基中培养。所有培养物定期传代，并在含有5％co2的加湿培养箱中保持在37℃；
[0137]
(5)制备含1％胎牛血清的dme/f12(mda-mb-231细胞)细胞悬液：取正常培养的对数生长期的细胞，弃原培养基(含10％胎牛血清)，用pbs清洗，加入0.5ml胰蛋白酶于37℃消化1min，加入2ml dmem培养基，终止消化，轻轻将细胞从培养皿底吹打下来，收集到离心管中，在转速为1000rpm的离心机中离心5min，弃上清液，加入适量1％胎牛血清细胞重悬细胞，形成均匀的细胞悬液，放入培养箱中备用；
[0138]
(6)从培养箱中取出芯片，将mda-mb-231注入细胞注入口211；
[0139]
(7)观察细胞是否均匀整齐排列在细胞定位通道中；
[0140]
(8)待细胞整齐排列在定位通道中，再通过注射泵同时往细胞培养液注入口213和
趋化因子注入口215b1注入1％胎牛血清，往趋化因子注入口215中分别注入浓度10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml和200ng/ml的egf；使用注射泵同时注入，减少因人工注入导致加样速度和时间不均而引起的实验误差；
[0141]
(9)每隔一小时观察多个细胞迁移运动通道220中的细胞迁移情况，共7小时，并在成像时间点之间将设备保存在37℃、含5％co2的孵箱中；
[0142]
(10)得到数据进行分析，得到细胞总迁移距离，分析癌细胞迁移数据，评估乳腺癌细胞的细胞迁移能力。其中图10为不同癌细胞中在200ng/ml相同浓度人表皮生长因子下的实际趋化迁移情况.
[0143]
从实施例5和实施例6得出，对于癌细胞，乳腺癌细胞迁移效果最好，且在200ng/ml浓度下最好。
[0144]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。