一种地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶、方法及应用

一种地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件
γ-谷氨酰转肽酶、方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其是一种地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶、方法及应用。


背景技术：

2.γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，ggt)是广泛分布于微生物体内的特异酶，能专一性地催化γ-谷氨酰基的转移，在γ-谷氨酰基类化合物的合成方面具有重要的应用价值。并且γ-谷氨酰转肽酶具有双重催化特性。既能专一性催化γ-谷氨酰基化合物中的γ-谷氨酰键断裂，释放出谷氨酸，表现为水解作用；同时又能将γ-谷氨酰基转移到受体上，生成新的γ-谷氨酰化合物，表现为转肽作用。鉴于其双重催化特性，γ-谷氨酰转肽酶具有非常广阔的工业应用前景。但未有研究利用γ-谷氨酸转肽酶表达元件进行过外源基因的表达。
3.地衣芽胞杆菌2709(bacillus licheniformis 2709)作为碱性蛋白酶生产的工业菌株，不仅具有发酵周期短，易于培养，营养成分简单，产量高，遗传背景清晰等优点，还具有较强的蛋白质分泌能力，是目前极具应用价值和发展潜力的芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌作为重要的芽孢杆菌表达系统之一，能高效表达碱性蛋白酶，同时控制这些酶基因表达与分泌的启动子、信号肽等相关表达元件，也可以用于其他基因的分泌表达，分泌蛋白质的能力较强，所以地衣芽孢杆菌是用于分泌外源蛋白的理想宿主。
4.目前，随着基因工程技术的迅速发展，为了提高一些蛋白的产量，在高表达的宿主菌中进行外源基因的表达成了较好的途径。然而一些外源蛋白由于自身表达条件和蛋白性质不能实现高效表达。例如非特异性核酸酶能高效降解核酸，作为毒性蛋白，在宿主菌体内大量表达会造成宿主死亡，对其制备和重组表达造成不利。目前对于非特异性核酸酶的表达多在大肠杆菌中进行表达，但由于大肠杆菌中为胞内表达，核酸酶对菌体的生长有一定毒害影响，且大肠杆菌作为胞外表达宿主，其分泌能力有限，因此并不能实现其在大肠杆菌中的高效表达。有研究表明，核酸酶也在酵母中进行过表达研究，但由于酵母是真核生物，来源于原核生物的核酸酶基因在酵母中并不能充分的利用其表达系统进行表达，且酵母发酵周期较长。所以未能实现核酸酶在宿主菌中的高效表达。
5.通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。


技术实现要素：

6.本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶、方法及应用。
7.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
8.一种地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶，所述γ-谷氨酰转肽酶的基因序列为：seq id no.3。
9.进一步地，所述γ-谷氨酰转肽酶来源于地衣芽孢杆菌2709。
10.如上所述的地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶在胞外蛋白高表达方面中的应用。
11.如上所述的地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶在提高外源基因在地衣芽孢杆菌中的表达、积累方面中的应用。
12.如上所述的地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶的启动子，其基因序列为：seq id no.2。
13.如上所述的元件γ-谷氨酰转肽酶的获得方法，步骤如下：
14.首先以地衣芽孢杆菌2709为出发菌，pksvt为穿梭载体，构建基因敲除载体，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除地衣芽孢杆菌2709基因组apre基因，并在其敲除整合位点整合绿色荧光蛋白基因，上下游同源臂序列通过重叠pcr融合在一起；
15.根据绿色荧光蛋白在蓝色波长488nm的光线激发下，会发出绿色荧光的特性，对突变菌株进行相对荧光强度的筛选，取转化子中相对荧光明显的转化子进行发酵培养表达；
16.发酵结束后取上清，加sds-page loading buffer吹吸混匀，煮沸10min后离心，上样，进行sds-page凝胶电泳；
17.经sds-page凝胶电泳后得知，在地衣芽孢杆菌分泌型蛋白中表达量高的蛋白，经质谱图分析出γ-谷氨酰转肽酶的序列，即得。
18.进一步地，具体步骤如下：
19.(1)整合载体构建
20.以地衣芽孢杆菌基因组为模板，使用引物对up-f/up-r和down-f/down-r分别扩增绿色荧光蛋白整合位置的上下同源修复序列，使用引物egfp-f/egfp-r扩增绿色荧光蛋白基因，通过重叠pcr技术将上下游同源臂和绿色荧光蛋白基因融合在一起，之后通过无缝克隆技术将线性化的pksvt与上下游同源臂和绿色荧光蛋白连接，将连接产物转化到ec135感受态细胞中，并涂布于卡那霉素的平板上，置于37℃培养箱培养12h，挑取转化子进行验证，最后经过测序确认。构建得到整合egfp基因的质粒，命名为pksvt-egfp；
21.(2)甲基化修饰
22.将测序成功的载体通过热击转化入ec135/pm.bam感受态，并涂布于卡那霉素和壮观霉素的双抗lb平板上，37℃下培养12h，挑取转化子于带有抗性的液体lb试管中，37℃下培养至od600为0.2-0.3，加入终体积为0.2％的阿拉伯糖进行诱导，在30℃摇床中过夜培养18h，诱导质粒进行甲基化修饰；提取经芽孢杆菌限制-修饰系统基因pm.bam修饰后的重组载体质粒，并通过电转化转入地衣芽孢杆菌2709感受态细胞中；
23.(3)根据绿色荧光蛋白在蓝色波长488nm的光线激发下，会发出绿色荧光的特性，对突变菌株进行相对荧光强度的筛选，取转化子中相对荧光明显的转化子进行发酵培养表达；
24.(4)发酵结束后取上清，加sds-page loading buffer吹吸混匀，煮沸10min后离心，上样，进行sds-page凝胶电泳；
25.(5)经sds-page凝胶电泳后得知，在地衣芽孢杆菌分泌型蛋白中表达量高的分别为41kda和21kda左右分子量的蛋白，经质谱图分析出γ-谷氨酰转肽酶的序列，即得。
26.进一步地，所述发酵为将地衣芽孢杆菌于37℃下培养进行发酵培养表达，发酵培
养72h取样，12000rpm下离心2min后取上清，加10μl sds-page loading buffer吹吸混匀，煮沸10min后离心；
27.其中，发酵培养基为：6.4％玉米粉、4％豆饼粉、0.4％磷酸氢二钠、0.03％磷酸二氢钾、0.07％耐高温α-淀粉酶；
28.上述百分数均为质量百分数。
29.本发明取得的优点和积极效果为：
30.1、本发明通过利用地衣芽孢杆菌2709中内源信号肽、启动子等表达元件，相比于外源基因自身的表达元件，能使外源基因在地衣芽孢杆菌中实现高效转录，并且地衣芽孢杆菌自身的原核表达系统有利于目的蛋白在宿主菌中实现稳定积累，因此为后续其他基因在该系统中进行高效表达和目标蛋白纯化奠定基础。
31.2、本发明以一株b.licheniformis 2709为出发菌株，引入绿色荧光蛋白egfp作为报告基因，对地衣芽孢杆菌进行突变菌株筛选，筛选出荧光强度高的菌株进行发酵培养。对突变菌株中的高产分泌蛋白进行分析研究，筛选出能够进行胞外蛋白高表达的元件。为后续其他基因在该系统中实现高效可控表达提供了参考依据。
32.3、本发明引入绿色荧光蛋白基因作为筛选基因筛选重组菌株，省去了转化子挑选等步骤，节约了时间和劳动力。
33.4、本发明获得的γ-谷氨酰转肽酶表达元件具有较强的将蛋白分泌到胞外的能力，能在很大程度上提高外源基因在地衣芽孢杆菌中的表达和积累，并且能将其高效地分泌到胞外，相比于胞内表达的基因要更有利于后续的纯化等操作。
附图说明
34.图1为本发明中载体的构建及验证图；其中，a，敲除载体的构建流程图；b，1-2是上下游同源臂的扩增，分别为510bp、532bp；3是绿色荧光蛋白扩增，720bp；4-5是载体构建验证结果，2000bp；
35.图2为本发明中egfp基因整合及验证图；egfp突变体的筛选过程：其中，m是核酸marker，泳道1-7是单交换验证结果，2500bp；8是阴性对照，2500bp；9-13是双交换验证结果，其中9-11为正确条带，2200bp；
36.图3为本发明中egfp基因整合流程图；
37.图4为本发明中不同菌株荧光观察图；其中，a是对照；b-e是转化子培养验证；
38.图5为本发明中sds-page凝胶电泳图；其中，m是蛋白marker；1为突变体菌株；
39.图6为本发明中γ-谷氨酰转肽酶突变菌株验证图；其中，m为marker；图a是同源臂扩增验证：泳道1是上游扩增同源臂，524bp；泳道2是下游扩增同源臂，527bp；图b是敲除载体验证，泳道1是构建载体验证，1500bp；图c是γ-谷氨酰转肽酶单交换突变体的筛选验证：泳道1-6是正确单交换重组菌，约为1400bp；泳道7是阴性对照，无条带；图d是突变体双交换验证：泳道4-5是正确双交换的突变体，条带约为1000bp；泳道1-3是阴性对照，约为1582bp；
40.图7为本发明中地衣芽孢杆菌γ-谷氨酰转肽酶蛋白凝胶电泳图；其中，m是蛋白marker；1-2是敲除γ-谷氨酰转肽酶验证，3-4是阴性对照。
具体实施方式
41.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
42.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
43.一种地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶，所述γ-谷氨酰转肽酶的基因序列为：seq id no.3。
44.较优地，所述γ-谷氨酰转肽酶来源于地衣芽孢杆菌2709。
45.如上所述的地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶在胞外蛋白高表达方面中的应用。
46.如上所述的地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶在提高外源基因在地衣芽孢杆菌中的表达、积累方面中的应用。
47.如上所述的地衣芽孢杆菌中胞外蛋白高表达的元件γ-谷氨酰转肽酶的启动子，其基因序列为：seq id no.2。
48.如上所述的元件γ-谷氨酰转肽酶的获得方法，步骤如下：
49.首先以地衣芽孢杆菌2709为出发菌，pksvt为穿梭载体，构建基因敲除载体，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除地衣芽孢杆菌2709基因组apre基因，并在其敲除整合位点整合绿色荧光蛋白基因，上下游同源臂序列通过重叠pcr融合在一起；
50.根据绿色荧光蛋白在蓝色波长488nm的光线激发下，会发出绿色荧光的特性，对突变菌株进行相对荧光强度的筛选，取转化子中相对荧光明显的转化子进行发酵培养表达；
51.发酵结束后取上清，加sds-page loading buffer吹吸混匀，煮沸10min后离心，上样，进行sds-page凝胶电泳；
52.经sds-page凝胶电泳后得知，在地衣芽孢杆菌分泌型蛋白中表达量高的蛋白，经质谱图分析出γ-谷氨酰转肽酶的序列，即得。
53.较优地，具体步骤如下：
54.(1)整合载体构建
55.以地衣芽孢杆菌基因组为模板，使用引物对up-f/up-r和down-f/down-r分别扩增绿色荧光蛋白整合位置的上下同源修复序列，使用引物egfp-f/egfp-r扩增绿色荧光蛋白基因，通过重叠pcr技术将上下游同源臂和绿色荧光蛋白基因融合在一起，之后通过无缝克隆技术将线性化的pksvt与上下游同源臂和绿色荧光蛋白连接，将连接产物转化到ec135感受态细胞中，并涂布于卡那霉素的平板上，置于37℃培养箱培养12h，挑取转化子进行验证，最后经过测序确认。构建得到整合egfp基因的质粒，命名为pksvt-egfp；
56.(2)甲基化修饰
57.将测序成功的载体通过热击转化入ec135/pm.bam感受态，并涂布于卡那霉素和壮观霉素的双抗lb平板上，37℃下培养12h，挑取转化子于带有抗性的液体lb试管中，37℃下培养至od600为0.2-0.3，加入终体积为0.2％的阿拉伯糖进行诱导，在30℃摇床中过夜培养18h，诱导质粒进行甲基化修饰；提取经芽孢杆菌限制-修饰系统基因pm.bam修饰后的重组载体质粒，并通过电转化转入地衣芽孢杆菌2709感受态细胞中；
58.(3)根据绿色荧光蛋白在蓝色波长488nm的光线激发下，会发出绿色荧光的特性，
对突变菌株进行相对荧光强度的筛选，取转化子中相对荧光明显的转化子进行发酵培养表达；
59.(4)发酵结束后取上清，加sds-page loading buffer吹吸混匀，煮沸10min后离心，上样，进行sds-page凝胶电泳；
60.(5)经sds-page凝胶电泳后得知，在地衣芽孢杆菌分泌型蛋白中表达量高的分别为41kda和21kda左右分子量的蛋白，经质谱图分析出γ-谷氨酰转肽酶的序列，即得。
61.较优地，所述发酵为将地衣芽孢杆菌于37℃下培养进行发酵培养表达，发酵培养72h取样，12000rpm下离心2min后取上清，加10μl sds-page loading buffer吹吸混匀，煮沸10min后离心；
62.其中，发酵培养基为：6.4％玉米粉、4％豆饼粉、0.4％磷酸氢二钠、0.03％磷酸二氢钾、0.07％耐高温α-淀粉酶；
63.上述百分数均为质量百分数。
64.具体地，相关制备及检测实施例如下：
65.1.材料与方法
66.1.1主要菌株、质粒、培养基、试剂
67.本发明中涉及的主要菌株、质粒和试剂的名称、来源及用途见表1、表2。
68.表1主要菌株和质粒
[0069][0070]
表2主要工具酶及相关试剂
[0071][0072]
1.2培养基与培养条件
[0073]
lb培养基：1％nacl、1％蛋白胨、0.5％酵母提取物；固体培养基在lb培养基的基础上加入2％琼脂；地衣芽孢杆菌发酵培养基：6.4％玉米粉、4％豆饼粉、0.4％磷酸氢二钠、
0.03％磷酸二氢钾、0.07％耐高温α-淀粉酶。除了质粒敲除实验在45℃环境下培养，其余菌株均置于37℃下培养。50mg/ml卡那霉素溶液(kan)：称取5g卡那霉素粉末，用100ml过膜水定容，然后用0.22μm的无菌微孔滤膜除菌，-20℃保存，该配置的母液浓度为50mg/ml，使用浓度为50μg/ml。
[0074]
本发明首先以地衣芽孢杆菌2709为出发菌，pksvt为穿梭载体，构建基因敲除载体，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除地衣芽孢杆菌2709基因组apre基因，并在其敲除整合位点整合绿色荧光蛋白基因。上下游同源臂序列通过重叠pcr融合在一起。所有元件的pcr扩增引物设计如表3。基因扩增反应体系如表4所示。
[0075]
表3主要引物及核苷酸序列
[0076][0077][0078]
表4基因扩增反应体系
[0079][0080]
1.3整合载体构建
[0081]
以地衣芽孢杆菌基因组为模板，使用引物对up-f/up-r和down-f/down-r分别扩增
绿色荧光蛋白整合位置的上下同源修复序列，使用引物egfp-f/egfp-r扩增绿色荧光蛋白基因，通过重叠pcr技术将上下游同源臂和绿色荧光蛋白基因融合在一起，之后通过无缝克隆技术将线性化的pksvt与上下游同源臂和绿色荧光蛋白连接，将连接产物转化到ec135感受态细胞中，并涂布于卡那霉素的平板上，置于37℃培养箱培养12h，挑取转化子进行验证，最后经过测序确认。构建得到整合egfp基因的质粒，命名为pksvt-egfp。
[0082]
1.4甲基化修饰
[0083]
将测序成功的载体通过热击转化入ec135/pm.bam感受态，并涂布于卡那霉素的lb平板上，37℃下培养12h，挑取转化子于带有抗性的液体lb试管中，37℃下培养至od600为0.2-0.3，加入终体积为0.2％的阿拉伯糖进行诱导，在30℃摇床中过夜培养18h，诱导质粒进行甲基化修饰。提取经芽孢杆菌限制-修饰系统基因pm.bam修饰后的重组载体质粒，并通过电转化转入地衣芽孢杆菌2709感受态细胞中。
[0084]
1.5sds-page
[0085]
sds变性聚丙烯酰胺凝胶配制成分如表5。
[0086]
表5sds-page凝胶配方
[0087][0088]
2.结果与分析
[0089]
2.1整合质粒的验证
[0090]
选择绿色荧光蛋白基因(egfp)为报告基因，基因敲除载体构建如图1-a。将上述构建得到的pksvt-egfp重组质粒化转到ec135的感受态细胞中，挑取转化子进行验证，采用引物pksvt-ef/pksvt-er进行pcr验证，正确的条带大小约为2000bp(图1-b)，条带大小与理论值一致，经测序验证正确。经测序成功后转至大肠杆菌ec135 pm.bam甲基化修饰，最后电转化至2709感受态细胞中，涂布于50μg/ml卡那霉素抗性平板37℃静置培养约12h。
[0091]
挑取转化成功的单克隆至含50μg/ml卡那霉素的lb试管中，45℃传代培养2-3代后，将菌液稀释涂布于卡那霉素平板上，45℃静置培养。采用引物对pksvt-ef/egfp-vr进行菌落pcr验证单交换，结果如图2，成功单交换重组菌dna条带大小约为2500bp。将验证正确的单菌落挑无抗试管在37℃进行2-3传代培养，传代结束后将菌液稀释涂布于无抗lb平板，37℃静置培养约12h，用灭菌过的枪头挑取无抗平板上的数个单克隆菌体分别对点于50μg/ml卡那霉素平板和无抗lb平板上，进行双交换验证，采用引物egfp-vf/egfp-vr进行菌落pcr验证，结果如图2，条带大小约2200bp，从而鉴定出整合绿色荧光蛋白的突变菌株。图3为基因整合过程。
[0092]
2.2突变菌株的筛选
[0093]
将筛选正确的单菌落接种至50ml lb培养基培养至od
600
为0.8-1.0，再以2％的接种量接种于发酵培养基，取菌液制片，观察发现不同筛选菌株表达绿色荧光的荧光强度差异明显。结果如图4所示。
[0094]
根据绿色荧光蛋白在蓝色波长(488nm)的光线激发下，会发出绿色荧光的特性，对突变菌株进行相对荧光强度的筛选，取转化子中相对荧光明显的。挑取不同的转化子进行发酵培养，筛选得到荧光强度高的转化子。挑取筛选正确的单菌落于5ml的lb试管中，37℃摇床培养12-14h，以2％的接种量接种至50ml lb培养基中培养至od
600
为0.8-1.0后，再以2％的接种量接种于发酵培养基培养。将发酵菌液涂布制成玻片，在荧光显微镜下观察各个转化子之间的荧光差异，以各个转化子之间的差异进行相互对比，筛选获得表达绿色荧光相对较强的菌株。以出发菌株作为对照，使用荧光显微镜进行绿色荧光观察，参数设置为：激发波长488nm。成功构建绿色荧光蛋白表达菌株，挑取不同转化子进行发酵培养表达。通过荧光显微镜观察到，不同转化子产生的荧光强弱差异明显，以此来筛选其表达元件的表达能力，并挑取荧光强度高的转化子进行发酵培养表达。
[0095]
2.3突变菌株的发酵培养
[0096]
将筛选的荧光强度高的菌株进行发酵培养表达，发酵培养72h取样，12000rpm下离心2min，发酵结束后取上清，加10μlsds-page loading buffer吹吸混匀，煮沸10min后离心，上样，进行sds-page凝胶电泳。其中，发酵培养基为：6.4％玉米粉、4％豆饼粉、0.4％磷酸氢二钠、0.03％磷酸二氢钾、0.07％耐高温α-淀粉酶；上述百分数均为质量百分数结果如图5所示。
[0097]
经sds-page凝胶电泳后得知，在地衣芽孢杆菌分泌型蛋白中表达量高的分别为41kda和21kda左右分子量的蛋白，其蛋白分泌到胞外的能力较强，蛋白积累效果也较好。
[0098]
2.4γ-谷氨酰转肽酶的敲除验证
[0099]
经质谱分析结果获得，该蛋白可能为γ-谷氨酰转肽酶，通过基因编辑技术对该基因进行阻断，发酵培养，进行sds-page凝胶电泳确认，进一步确认该蛋白。结果如图6所示。
[0100]
以温敏型质粒pksvt构建基因敲除载体，通过基因编辑技术敲除γ-谷氨酰转肽酶。敲除载体的构建pksvt-γ同egfp整合流程，采用载体引物对pksvt-γf/pksvt-γr进行pcr验证，正确条带为1500bp左右，如图6-b。经测序正确后电转化至地衣芽孢杆菌感受态中，突变体的筛选过程如图3所示，成功发生正确单交换的菌株条带约为1400bp，如图6-c所示；成功发生双交换并丢失质粒的菌株经引物对γ-uf/γ-dr验证，pcr条带大小约为1000bp。经测序确认成功阻断γ-谷氨酰转肽酶的表达。
[0101]
2.5γ-谷氨酰转肽酶sds-page验证
[0102]
经质谱图分析出γ-谷氨酰转肽酶的序列，通过基因敲除技术对γ-谷氨酰转肽酶进行蛋白表达阻断，再利用sds-page凝胶电泳对γ-谷氨酰转肽酶进行验证。结果如图7所示。
[0103]
由sds-page凝胶电泳图得，成功对γ-谷氨酰转肽酶进行蛋白表达阻断，经测序确认。同时，经电泳图显示，地衣芽孢杆菌发酵生产的γ-谷氨酰转肽酶含有两种亚基，分别为41kda和21kda左右。同时蛋白凝胶电泳图显示，作为胞外分泌型蛋白，γ-谷氨酰转肽酶的分泌能力较强，表达蛋白的积累量也较大。所以后续将使用γ-谷氨酰转肽酶的表达元件对
其他胞外蛋白进行高效可控表达。
[0104]
pksvt基因序列：
[0105]
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[0106]
γ-谷氨酰转肽酶启动子序列：
[0107]
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[0108]
γ-谷氨酰转肽酶基因序列：
[0109]
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[0110]
egfp基因序列:
[0111]
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[0112]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。