一种抗虫耐除草剂基因表达载体及其应用的制作方法

al.appl.environ.microbiol.2002,68(8):3790-3794.)。cry1ab与cry2ae蛋白功能区域的氨基酸相似度极低，仅为17.9％。因此，二者的杀虫谱差异很大，也不容易产生交付抗性，非常适合联合使用。vip3a是一类对鳞翅目昆虫幼虫具有杀虫活性的蛋白质，从苏云金杆菌ab88中分离，在其生长的营养期、生长中期和产孢过程中均有表达。其基因产物对草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)、小地老虎(agrotis ipsilon)、甜菜夜蛾(spodtera exigua)、烟草夜蛾(heliothis virescons)和美洲棉铃虫(helicoverpa zea)等鳞翅目昆虫幼虫有杀虫作用(estruch,j j et al.proceedings of the national academy of sciences.1996,93(11):5389-5394)。vip3a蛋白无论从一级结构还是高级结构上与cry杀虫蛋白有显著差异，杀虫机理也显著不同。因此，通过cry1ab、cry2ae和vip3a三种蛋白可以有效增强转基因植物对主要的鳞翅目害虫的杀虫性能、扩展杀虫普，并且能有效延缓害虫抗性产生。
5.杂草是影响农作物生产的第二大重要因素。它与农作物竞争水资源、肥料、光源等，造成农作物的产量降低，同时还会降低农产品的品质。传统的手工除草方法费时费力并且效率很低，机械除草费用较高，而化学药剂除草对技术要求较高并且极易对植物造成药害，影响作物本身的生长发育，同时化学药剂还可能会影响到邻近敏感的农作物。
6.目前，通过转基因的方法让植物耐受草甘膦是应用最广泛的杂草解决方案。草甘膦，化学名称为n-(磷酸甲基)甘氨酸，是一种有机膦类除草剂，是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，拥有40多年的长期安全使用记录。可以通过在植物中表达cp4(来源于农杆菌cp4菌株，编码cp4-epsps蛋白)(padgette,s r et al.1996.pages 53-84in herbicide-resistant crops)等epsps基因和gat(来源于土壤微生物宏基因组的草甘磷n-乙酰转移酶的基因)等能表达降解草甘膦的酶的基因赋予植物耐草甘膦的性状。
7.让植物同时表达多种目的蛋白的方法主要包括多表达框分子克隆堆积法、杂交堆积法、基因融合法，其中多表达框分子克隆堆积法以其具备的稳定性好、可预见性强和后期植物转育容易等优势被广泛使用。而多表达框堆积策略的效果受诸多因素的影响，包括基因的选择、编码序列的选择、每个表达框包括启动子、终止子等在内的调控元件的选择、各读码框的排列等。这些因素都会对目的基因的表达水平、表达模式已经不同代次间的稳定性特别是高代次的基因沉默情况有不同的影响。因此一个能高效稳定的表达多个目的基因的表达载体需要经过严格的探索与测试，而这种载体对获得稳定高效的转基因作物起到决定性作用。
(三)

技术实现要素：

8.本发明目的是提供一种同时稳定高效表达多种抗虫基因(如cry1ab、vip3a、cry2ae)和抗除草剂基因(如cp4基因)的双元载体，及其在制备抗虫耐草甘膦植物细胞、农作物方面的应用，转基因植物抗草甘膦除草剂的同时，高抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等主要鳞翅目害虫，解决了现有转基因植物不能同时抗多种害虫且对杀虫蛋白产生抗性的问题。
9.本发明采用的技术方案是：
10.本发明提供一种同时稳定高效表达抗虫耐除草剂基因的表达载体，所述的表达载体含有抗虫基因cry1ab、vip3a和cry2ae，同时含耐草甘膦基因cp4。
engineering,2007,12(6):676-683.)、玉米hps70基因的内含子等(brown s m,santino c g.ca2108000a1.1993.)。同时，终止子可以是来源于植物自身的终止子，也可以是来源于病毒和其它生物，或者人工合成的终止子。
18.进一步，本发明提供了一种用于增强cry2ae基因表达的玉米epsps基因叶绿体信号肽序列，所述信号肽核苷酸序列如seq id no：10所示。
19.进一步，本发明提供了一种用于增强cp4基因表达的水稻epsps基因叶绿体信号肽序列，所述信号肽核苷酸序列如seq id no：11所示。
20.本发明中用于提供载体骨架的基础载体可以是pcambia系列载体(cambia,canberra,australia)或者其它载体，优选pcambia 1300载体。
21.本发明所述表达载体t-dna组成：启动子-cry2ae基因-启动子-vip3a基因-启动子-cry1ab基因-启动子-cp4基因。优选所述表达载体的t-dna：1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae。
22.本发明还提供一种所述表达载体在制备转基因植物细胞中的应用，所述的应用是将所述的表达载体电击转化农杆菌eha105，获得含有表达载体的农杆菌菌株，用农杆菌菌液侵染植物，获得含表达载体的植物细胞。
23.本发明还提供了一种包含所述同时稳定高效表达抗虫耐草甘膦基因t-dna的植物细胞，在植物转基因细胞培养中将耐草甘膦基因cp4作为筛选标记。
24.本发明同时还提供了一种包含所述同时稳定高效表达抗虫耐草甘膦基因t-dna的转基因植物。
25.本发明进一步提供了利用所述载体获得同时稳定高效表达抗虫耐草甘膦基因的植物细胞或者植物的方法，该方法可以是农杆菌介导转化法、基因枪法、原生质体侵染法或者其他植物遗传转化方法，优选农杆菌介导转化法。
26.本发明构建的表达载体适于单子叶植物的表达或者双子叶植物的表达，单子叶植物包括：玉米、水稻等；双子叶植物包括：大豆、油菜、棉花等。
27.本发明所述表达载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等农作物的主要鳞翅目害虫。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明表达载体同时表达cry1ab、vip3a、cry2ae和cp4蛋白，用该载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等农作物的主要鳞翅目害虫，扩宽了转基因作物的抗虫范围。同时，本发明在cry2ae基因前面加了叶绿体信号肽序列，一方面增加了cry2ae蛋白的表达量，增加幅度为10％-50％；另一方面，降低了高表达量的cry2ae蛋白对植物生长发育造成的干扰。特别的，本载体中表达的vip3a基因对草地贪夜蛾具有高抗性，对入侵我国的草地贪夜蛾有非常好的抗性，而且多种作用机制不同的抗虫基因聚合使用还有效地延缓了害虫抗性的产生，同时使转基因作物具有抗草甘膦的能力，这种复合性状转基因作物符合目前转基因作物的研发方向，能更好满足大规模农业生产的需求。
(四)附图说明
29.图1：同时表达cry1ab、vip3a、cry2ae和cp4基因的表达载体t-dna结构示意图。
30.pzmubi表示玉米泛素启动子；ctp1表示玉米epsps基因叶绿体信号肽；ctp2表示水
稻epsps基因叶绿体信号肽；p35s-intron表示camv35s启动子和植物基因内含子组成的复合启动子；cry2ae表示cry2ae基因及其终止子；vip3a表示vip3a基因及其终止子；cry1ab表示cry1ab基因及其终止子；cp4表示cp4-epsps基因及其终止子。
(五)具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
32.在不背离本发明实质的情况下，对本发明的步骤、方法或者条件进行修改或者替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
33.实施例1、复合启动子p35s-intron的克隆
34.1、载体构建：
35.人工合成玉米hsp70基因内含子的核苷酸序列，其核苷酸序列如seq id no：9中第782bp-1591bp所示；人工合成包含水稻epsps基因叶绿体信号肽编码序列的cp4基因核苷酸序列，其中cp4基因核苷酸序列如seq id no：7所示，水稻epsps基因叶绿体信号肽序列如seq id no：11所示。
36.以人工合成的玉米hsp70基因内含子为模板，用引物(hcff1:5
’‑
ctctacaaatctatctctctcgagaccgtcttcggtac；hcrr1:5
’‑
tcgccgccatggtgccgcttggtatctgcattac)pcr扩增获得hsp70基因的内含子片段，记为intron片段。
37.以人工合成的包含水稻epsps基因叶绿体信号肽编码序列的cp4基因为模板，用引物hcff2:5
’‑
aagcggcaccatggcggcgaccatggcgtccaac和hcrr2:5
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cacattattatggagaaactcgagttatcaagcggccttc进行pcr扩增获得含水稻epsps基因叶绿体信号肽编码序列的cp4片段。
38.用限制性内切酶xhoi对pcambia1300载体进行酶切，同时用fastap对该载体进行去磷酸化处理，防止自连。通过同源重组的方法将上述两个片段和线性化的pcambia1300载体进行连接后获得载体1300-p35s-intron-cp4。
39.作为对照，以上述人工合成的包含水稻epsps基因叶绿体信号肽编码序列的cp4基因的核苷酸片段为模板，用引物cp4-f2:5
’‑
tctctcgagaccatggcggcgaccatggcgtcc和cp4-r:5
’‑
ggagcctcgagttatcaagcggccttcgtgtcagac进行pcr扩增，获得含叶绿体信号肽编码序列的cp4片段，序列5’端和3’端分别设置一个xhoi位点。用xhoi对上述pcr获得的核苷酸片段cp4进行酶切，将酶切后的cp4片段与之前线性化的pcambia1300载体进行连接，获得对照载体1300-p35s-cp4。
40.将获得的t-dna载体(1300-p35s-intron-cp4和1300-p35s-cp4)电击转化农杆菌eha105，获得含有植物转化载体的菌株，加甘油后保存至-80度冰箱，用于转基因作物侵染。
41.2、水稻转化：
42.转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。
43.农杆菌菌液的制备：将步骤1中构建的含载体1300-p35s-intron-cp4和1300-p35s-cp4的农杆菌划板，挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将农杆菌接种至培养基，28℃
培养至od为0.6，获得农杆菌菌液；培养基组成：3g/l k2hpo4、1g/lnah2po4、1g/lnh4cl、0.3g/l mgso4·
7h2o、0.15g/l kcl、0.01g/l cacl2、0.0025g/l feso4·
7h2o、5g/l蔗糖、20mg/l乙酰丁香酮，溶剂为水，ph＝5.8。
44.选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(ms+2mg/l 2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)+30g/l葡萄糖+30g/l蔗糖+3g/l琼脂(sigma 7921)+20mg/l乙酰丁香酮)中，28℃共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(ms+2mg/l 2,4-d+30g/l蔗糖+3g/l琼脂(sigma 7921)+20mg/l乙酰丁香酮+2mm草甘膦(sigma))上，28℃筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(ms+0.1g/l肌醇+5mg/l aba(脱落酸)+1mg/l naa(1-萘乙酸)+5mg/l 6-ba(6-苄氨基嘌呤)+20g/l山梨醇+30g/l蔗糖+2.5g/lgelrite(植物凝胶))上，28℃培养20天，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2ms+0.2mg/l naa+20g/l蔗糖+2.5g/l gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室。将载体1300-p35s-intron-cp4和1300-p35s-cp4的转基因水稻植株分别命名为icp和cp。
45.3、目的基因cp4表达量分析：
46.通过elisa的方法对步骤2获得的转基因水稻中的cp4的表达量进行分析。elisa测定使用上海佑隆生物科技有限公司的检测试剂盒进行(货号：aa0841)。实验方法参照试剂盒的说明书进行，具体步骤如下所述。
47.(1)将粗提取的蛋白样品进行适当稀释(如200-500倍)，同时将标样浓度稀释为2.5ppb、1.25ppb、0.625ppb、0.3125ppb；
48.(2)向酶联板的每个孔中加入100μl实验样品，用parafilm膜封住酶联板孔，室温下在水平振荡仪上慢速遮光孵育45min，注意避免孔中液体洒出或溅到封口膜上；
49.(3)孵育完毕后，迅速倒出孔中的液体，每孔用250μl washing buffer(pbst buffer)彻底洗3次，将板在吸水纸上甩干；
50.(4)向每个孔中加入100μl酶标液并摇匀，用parafilm膜封封住酶联板，室温下在水平振荡仪上慢速遮光孵育45min，
51.(5)孵育完毕后，迅速倒出孔中的液体，每孔用250μl washing buffer(pbst buffer)彻底洗3次，将板在吸水纸上甩干；
52.(6)向孔中加入100μl substrate并摇匀，用parafilm膜封封住酶联板，孵育15-30min，其间可以观察到孔中的溶液由无色逐渐转变为蓝色；
53.(7)向孔中加入100μl终止液并混匀，溶液由蓝色转变为黄色，30min内在酶标仪中测定od450值。根据标样的od450值，可以绘制出一条标准曲线；若样品od450值处于标样od450范围之外，重新稀释样品并重新检测；若样品od450值处于标样od450范围之内，即可计算出样品中目的蛋白的浓度。
54.以标准品吸光度值为纵坐标，以cp4 epsps标准品浓度(ppb)为横坐标，绘制标准曲线图。为了排除每次测定之间的系统误差，每次测定样品都同时制作标准曲线。本次测试的标准曲线公式是：y＝0.026x+0.114(r2＝0.9906)。
55.将样本的吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度。
56.cp4蛋白含量(μg/g)＝样本浓度(ppb)*稀释倍数*样品提取液体积(μl)/叶片质量(mg)/1000
57.分别选取20株长势良好且通过分子生物学鉴定为单拷贝的icp和cp转基因水稻植株叶片进行cp4基因的表达水平分析，结果如表1所示。
58.表1：p35s-intron启动子介导靶标基因表达水平分析
[0059][0060]
备注：icp代表载体1300-p35s-intron-cp4的转基因植株，cp代表载体1300-p35s-cp4的转基因植株。表中数据代表20个独立转基因材料的表达量的平均数
±
标准差。**表示通过t.test检验，在0.1％的显著水平上与对照相存在显著差异。
[0061]
测试结果表明，通过转化载体1300-p35s-intron-cp4获得的转基因水稻植株叶片中cp4的表达量显著高于通过转化载体1300-p35s-cp4获得的转基因水稻植株叶片中cp4的表达量。因此，我们认为启动子p35s-intron比p35s能更好的介导目的基因在水稻等植株中高表达。因此我们选择用启动子p35s-intron开展后续试验。
[0062]
实施例2、同时含抗虫蛋白编码基因cry1ab、vip3a、cry2ae和耐草甘膦基因cp4的表达载体构建
[0063]
为了构建同时高效表达cry1ab、vip3a、cry2ae和cp4基因的载体，人工合成包含cry1ab基因核苷酸序列和tnos终止子序列的核苷酸片段，其中cry1ab基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，tnos终止子核苷酸序列如seq id no:12所示；人工合成vip3a基因的核苷酸序列和35s终止子序列的核苷酸序列，其中vip3a基因的核苷酸序列如seq id no：3所示，35s终止子核苷酸序列如seq id no:13所示；人工合成包含玉米epsps基因叶绿体信号肽编码序列(zmctp)、cry2ae基因的核苷酸序列和tnos终止子序列的核苷酸序列，其中cry2ae基因的核苷酸序列如seq id no：5所示，玉米epsps基因叶绿体信号肽序列如seq id no：10所示，tnos终止子核苷酸序列如seq id no：12所示。
[0064]
1、抗虫基因cry1ab及其启动子的克隆：以人工合成的从5’端至3’依次为cry1ab基因和tnos终止子的核苷酸片段为模板，通过pcr克隆本核苷酸序列(引物为1ab-f:5
’‑
gcaggatccaccatggacaacaacccgaacatcaac；1ab-r:5
’‑
ccgcgccggaattcgatctagtaacatagatgacacc)，序列5’端和3’端分别设置一个bamhi位点和ecori位点，记为cry1ab片段。
[0065]
启动子pzmubi1：以玉米基因组(b73)为模板，通过pcr克隆玉米ubi启动子pzmubi(引物为ubi-f1:5
’‑
ctagatcggtaccctacagtgcagcgtgacccggtc；引物为ubi-r1:5
’‑
atggtggatcctgcagaagtaacaccaaacaacagggt)，核苷酸序列如seq id no：11所示。启动子5’端和3’端分别设置一个kpni位点和bamhi位点，记为pzmubi1片段。
[0066]
2、抗虫基因cry2ae及其启动子的克隆：
[0067]
以人工合成的从5’端至3’依次为玉米epsps基因叶绿体信号肽编码序列、cry2ae基因的核苷酸序列和35s终止子序列的核苷酸片段为模板，通过pcr克隆序列zmctp-cry2ae-tnos片段(引物为2ab-f:5
’‑
tttaggatccaccatggcggccatggcgaccaag；2ab-r:5
’‑
cccggctggtaccgatctagtaacatagatgacacc)，序列5’端和3’端分别设置一个bamhi位点和
10天的hi-ii玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。分别将实施例2中制备的含有t-dna载体(1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae和1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae(对照))的农杆菌与未成熟胚在共培养培养基上(ms+2mg/l 2,4-d+30g/l蔗糖+3g/l琼脂(sigma 7921)+40mg/l乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(ms+2mg/l 2,4-d+30g/l蔗糖+2.5g/l gelrite+5mg/l agno3+200mg/l乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mm草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含2mm草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(ms+30g/l蔗糖+0.5mg/l kinetin+2.5g/l gelrite+200mg/l乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2ms+20g/l蔗糖+2.5g/l gelrite+200mg/l乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。获得分别含转化载体(1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae和1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae(对照))t-dna的转基因玉米植株，分别名称为c1av2a和c1a2a。
[0080]
实施例4、转基因抗虫耐除草剂水稻的获得
[0081]
本实施例中水稻转化方法同实施例1，利用该方法获得实施例3中制备的载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae和1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae(对照)的转基因水稻植株。
[0082]
实施例5、转基因抗虫耐除草剂大豆的获得
[0083]
这里使用的获得转基因大豆的步骤来自于已有的技术(deng et al.,1998,plant physiology communications 34:381-387；ma et al.,2008,scientia agricultura sinica 41:661-668；zhou et al.,2001,journal of northeast agricultural university 32:313-319)。选取健康、饱满、成熟的“天隆1号”大豆，用80％乙醇消毒2分钟，再用无菌水清洗，然后放置在充满氯气(由50mlnaclo与2ml浓hcl反应生成)的干燥器中灭菌4-6个小时。灭菌后的大豆在超净工作台里被播撒到b5培养基中，25℃条件下培养5天，同时光密度在90-150μmol光子/m2·
s水平。当子叶变绿并顶破种皮，无菌的豆芽就会长出。去掉了下胚轴的豆芽在长度上被切成五五开，使得两片外植体都具有子叶和上胚轴。在子叶和上胚轴的节点处切外植体大约7-8处，即可用作被侵染的目标组织。
[0084]
含有实施例2中制备的载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae和1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae(对照)的单克隆农杆菌被分开培养待用。准备好的外植体浸没在农杆菌悬浮液中共培养30分钟左右。然后，将侵染的组织上多余的细胞悬浮液用吸水纸吸收干净，再转移到1/10b5共培养培养基里25℃暗培养3-5天。
[0085]
共培养的植物组织用b5液体培养基清洗，以除去多余的农杆菌，然后放置到b5固体培养基中25℃下培养5天，待其发芽。诱导发生的胚芽组织转移到含有0.2mm草甘膦的b5筛选培养基中，25℃光照培养4周，期间每两周更换一次培养基。筛选出来的胚芽组织再转移到固体培养基中，25℃培养，待其长成小苗。随后，将转基因植株苗转移到1/2b5培养基中进行生根诱导。最后，长成的小植株经清洗去除琼脂后栽种在温室中。
[0086]
实施例6、转基因玉米抗虫能力的测定
[0087]
1、试验玉米品系：本试验的转基因玉米是导入cry1ab、vip3a、cry2ae和cp4基因的抗虫耐草甘膦转基因品系c1av2a，以及转入cry1ab、cry2ae和cp4基因的对照抗虫转基因品系c1a2a。对照为非转基因亲本材料ph4cv(鲁宝良,关国志,赵文媛.2017,中国种业,2:9-11.)。
[0088]
2、草地贪夜蛾抗性测定：
[0089]
(1)室内生测：
[0090]
不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天喷洒草甘膦确定是转基因植株后，各取10株，每株接1龄草地贪夜蛾10头，观察死亡率。草地贪夜蛾来自本课题组田间收集草地贪夜蛾雌虫养殖后产的卵块(饲养方法参考“广东省农药协会团体标准，t/gdp 011-2020”)。将卵块于28
±
1℃，rh 70
±
5％，16h:8h(l:d)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。测试结果如表3所示。
[0091]
表3草地贪夜蛾室内生物活性测定结果
#
[0092][0093]
#
表3中数据为死亡率的平均数
±
标准差，n＝10。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pubi pzmubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1av2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。
[0094]
(2)大田生测：
[0095]
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)、抽雄前期和抽丝散粉期分别进行人工接草地贪夜蛾初孵幼虫。将黑头卵块(约40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶中期接虫后10d，20d调查食叶级别。
[0096]
抗虫分级：采用9级标准(marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
[0097]
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。
[0098]
草地贪夜蛾大田抗性效果测试结果如表4所示。
[0099]
表4草地贪夜蛾大田测试结果
[0100]
玉米品系t2代抗虫情况c1a2a-12100％
#
少量取食斑点1c1a2a-18100％少量取食斑点1c1a2a-3677％少量取食3
c1a2a-55100％少量取食斑点1c1a2a-88100％少量取食斑点1c1av2a-6100％少量取食斑点1c1av2a-1889％少量取食2c1av2a-41100％少量取食斑点1c1av2a-52100％少量取食斑点1c1av2a-93100％少量取食斑点1ph4cv大量取食，叶片有大量空洞8.5
[0101]
#
代表草地贪夜蛾的死亡率。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pzmubi 1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1av2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
[0102]
室内生测结果表明大多数转化体在72小时内对草地贪夜蛾低龄幼虫有100％的杀灭效果，大田测试结果表明大多数转化体对草地贪夜蛾表现出高抗。
[0103]
3、棉铃虫抗性鉴定：
[0104]
室内生测：
[0105]
不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天喷洒草甘膦确定是转基因后，各取10株，每株接1龄棉铃虫10头，6天后观察死亡率。棉铃虫卵块均购自是河南科云生物农药(河南济源白云实业有限公司)。将卵块于28
±
1℃，rh 70
±
5％，16h:8h(l:d)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。测试结果如表5所示。
[0106]
表5棉铃虫室内生物活性测定结果
[0107][0108]
#
表中数据为死亡率的平均数
±
标准差，n＝10。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1av2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。
[0109]
大田生测：
[0110]
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)、抽雄前期和抽丝散粉期分别进行人工接棉铃虫初孵幼虫。将黑头卵块(约40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶中期接虫后10d，20d调查食叶级别。
[0111]
抗虫分级：采用9级标准(marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
[0112]
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。
[0113]
棉铃虫大田抗性效果测试结果如表6所示。
[0114]
表6棉铃虫大田测试结果
[0115]
玉米品系t2代抗虫情况c1a2a-12100％
#
少量取食斑点1c1a2a-18100％少量取食斑点1c1a2a-3680％少量取食3c1a2a-55100％少量取食斑点1c1a2a-88100％少量取食斑点1c1av2a-6100％少量取食斑点1c1av2a-18100％少量取食斑点1c1av2a-41100％少量取食斑点1c1av2a-5295％少量取食2c1av2a-93100％少量取食斑点1ph4cv大量取食，叶片有大量空洞8.5
[0116]
#
代表棉铃虫的死亡率。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1av2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
[0117]
室内生测结果表明大多数转化体在72小时内对棉铃虫低龄幼虫有100％的杀灭效果，大田测试结果表明大多数转化体对棉铃虫表现出高抗。
[0118]
4、玉米螟抗性鉴定
[0119]
室内生测
[0120]
不同代次的转基因玉米和对照常规玉米在温室中发芽后20天喷洒草甘膦确定是转基因后，各取10株，每株接1龄玉米螟10头，6天后观察死亡率。玉米螟卵块均购自是河南科云生物农药(河南济源白云实业有限公司)。将卵块至于28
±
1℃，rh 70
±
5％，16h:8h(l:d)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。测试结果如表7所示。
[0121]
表7玉米螟室内生物活性测定结果
[0122][0123]
#
表中数据为死亡率的平均数
±
标准差，n＝10。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1av2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。
[0124]
大田生测：
[0125]
在玉米植株生长至心叶中期(6-8叶完全展开)、抽雄前期和抽丝散粉期分别进行人工接玉米螟初孵幼虫。将黑头卵块(约40-60头幼虫)放置在1.5ml离心管中，待幼虫孵化后投放在心叶丛中。每处理接虫10株。心叶中期接虫后10d，20d调查食叶级别。
[0126]
抗虫分级：采用9级标准(marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。
[0127]
试验玉米的种植和管理：在全部种植过程中没有使用杀虫农药。化肥使用：播种前复合肥料每亩15公斤，6-7叶期(播种后大约40天)再加复合肥料每亩20公斤。
[0128]
玉米螟大田抗性效果测试结果如表8所示。
[0129]
表8玉米螟大田测试结果
[0130]
玉米品系t2代抗虫情况c1a2a-12100％
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少量取食斑点1c1a2a-18100％少量取食斑点1c1a2a-36100％少量取食斑点1c1a2a-55100％少量取食1c1a2a-88100％少量取食斑点1c1av2a-6100％少量取食斑点1c1av2a-18100％少量取食斑点1c1av2a-41100％少量取食斑点1c1av2a-52100％少量取食1c1av2a-93100％少量取食斑点1ph4cv大量取食，叶片有大量空洞8.0
[0131]
#
代表玉米螟的死亡率。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-pzmubi2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1av2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab-p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
[0132]
室内生测结果表明大多数转化体在72小时内对玉米螟低龄幼虫有100％的杀灭效果，大田测试结果表明大多数转化体对玉米螟表现出高抗。
[0133]
上述试验结果表明，同时表达cry1ab、cry2ae和vip3a基因的玉米对棉铃虫、草地贪夜蛾和玉米螟的抗性普遍高于同时表达cry1ab和cry2ae基因的玉米。
[0134]
实施例7、转基因玉米抗草甘膦能力的测定
[0135]
试验玉米品系：本试验的转基因玉米是导入cry1ab、vip3a、cry2ae和cp4基因的抗虫耐草甘膦转基因品系c1av2a。对照为非转基因亲本材料ph4cv。
[0136]
大田抗草甘膦性能测定：t2代转基因玉米和常规玉米种子在发芽后15-20天，4-6叶时期，分别喷施体积比1：100和1：200稀释的41％草甘膦异丙胺盐(孟山都公司)，剂量为40l/亩，7天后记录玉米生长发育情况和死亡率。
[0137]
通过在4-6叶期间大田喷施草甘膦，测定了不同代次的转基因玉米的抗草甘膦能
力。结果见表9。
[0138]
表9转基因抗虫耐除草剂玉米耐草甘膦能力试验
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[0139][0140]
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每亩喷施40l的1：100；1：200或者1:50倍稀释的农达(41％草甘膦，孟山都产品)。c1a2a表示1300-p35s-intron-cp4-pzmubi 1-cry1ab-pzmubi 2-cry2ae载体的转基因玉米植株；c1av2a表示载体1300-p35s-intron-cp4-pzmubi1-cry1ab
‑‑
p35s-intron-vip3a-pzmubi2-cry2ae的转基因玉米植株；ph4cv表示非转基因对照植株。品系名称后面的数字代表不同转化体的编号。
[0141]
结果表明，大多数转化体可以耐受较高浓度的草甘膦。c1a2a-12、c1a2a-55、c1a2a-88、c1av2a-6、c1av2a-18、c1av2a-52和c1av2a-93的抗性水平比较高，其在每亩喷施40l的1：50稀释的农达(41％草甘膦异丙胺盐，孟山都)的条件下没有对转基因玉米有可以看到的不利影响。
[0142]
还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接到导出或联想到的所有延伸，均应认为是本发明的保护范围。