一种用于新城疫病毒检测的试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于新城疫病毒检测的试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.新城疫(newcastle disease，nd)是由新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病。该病常呈败血症，以高热、呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血为特征，具有很高的发病率和死亡率。ndv为副黏病毒科副黏病毒属的禽副黏病毒i型(apm
‑
i)，是一种具有囊膜的单股、负链、不分节段的rna病毒。ndv基因组长约15.2kbp，其中np、p、m、f、hn和l基因分别编码病毒的六种特异性结构蛋白。m基因长为1095bp，保守性高，其编码的m蛋白(即基质蛋白)位于囊膜的内层，在rna的合成和病毒的自身装配上起重要的作用。在自然条件下ndv主要通过呼吸道、消化道，也可经眼结膜、破损的皮肤或泄殖腔粘膜侵入宿主。nd是危害我国禽业养殖最重要的传染病之一，建立快速高效的检测方法对该病的防控具有重要的现实意义。
3.对于病毒检测，通常使用核酸检测方法，但目前的核酸检测方法的仍然存在多方面的不足。反转录
‑
聚合酶链反应(reverse transcription
‑
polymerase chain reaction，rt
‑
pcr)和荧光rt
‑
pcr需要特定温度循环的扩增仪器，不便于实现现场检疫。目前应用广泛的恒温扩增技术如环等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermalamplification，lamp)与重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aided amplification，raa)等可以满足现场检测的需求，但是由于lamp其特异性方面的缺陷容易导致假阳性，raa对引物的设计非常敏感，需要从多对引物中筛选才能达到高灵敏度检测的要求。
4.因此，开发新的新城疫病毒的检测方法，同时满足方便现场检疫和检测灵敏度的需求，具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于新城疫病毒检测的试剂盒，能够在恒温条件下进行检测，降低对荧光pcr检测设备的依赖，且具有较高的检测灵敏度。
6.本发明还提出上述试剂盒的使用方法。
7.本发明还提出上述试剂盒在非诊断治疗目的的新城疫病毒检测中的应用。
8.根据本发明的一个方面，提出了一种用于新城疫病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括：crrna、t7转录酶、ntp、探针、cas13a和核酸扩增试剂；
9.所述核酸扩增试剂包括引物对，所述引物对选自如seq id no.1和seq id no.2所示的核酸序列对、如seq id no.4和seq id no.5所示的核酸序列对、以及如seq id no.7和seq id no.8所示的核酸序列对中的至少一种；所述crrna选自如seq id no.3、seq id no.6和seq id no.9所示的核酸序列中的至少一种。由于病毒序列变异较大，因此使用三套
引物来实现对新城疫不同分型毒株检测的全覆盖。
10.在本发明中，引物对为seq id no.1和seq id no.2和crrna为seq id no.3，用于检测ndv15198型病毒；引物对为seq id no.4和seq id no.5和crrna为seq id no.6，用于检测ndv15192型病毒；引物对为seq id no.7和seq id no.8和crrna为seq id no.9，用于检测ndv15186型病毒。
11.根据本发明的一种具体的实施方式，至少具有以下有益效果：该试剂盒通过恒温扩增结合cas13a的方法可以实现高灵敏度检测；其中，cas13a蛋白识别并能结合了其靶rna序列后可以被激活，活化的cas13a可以分解所处环境中的非靶标rnas，cas13a介导的报告rna的非特异性断裂可以用来检测恒温扩增的目的核酸序列，该检测技术的优势主要表现在检测结果具有变异性低和灵敏度高等特点。
12.在本发明的一些实施方式中，所述探针为fam
‑
uuuuuuuuuuuuuu
‑
tamra，其中，fam和tamra为荧光基团。在另一些实施例中，所述荧光基团还可以选择tet、hex、cy3、cy5、rox中的至少一种。所述探针可以适用于本发明的所有检测体系，具有广泛的适用范围和较高的灵敏度。
13.在本发明的一些实施方式中，所述核酸扩增试剂还包括rpa或raa的扩增试剂。
14.在本发明中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)和重组酶介导的扩增技术(recombinase
‑
aidamplification，raa)均为常用的恒温扩增技术，在扩增过程中均使用重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶，在37℃恒温下进行核酸快速扩增。其不同点在于重组酶的来源不同，rpa体系的重组酶来源于t4噬菌体，raa体系的重组酶来源于细菌或者真菌。在本发明的一些实例中，均可购买商业化的rpa或raa体系的核酸扩增试剂进行反应。
15.在本发明的一些实施方式中，所述crrna的浓度为10μm，所述t7转录酶的浓度为1mg/ml，所述ntp的浓度为100mm，所述探针的浓度为10μm，所述cas13a的浓度为1mg/ml。上述浓度均为各组分在体系内的终浓度。
16.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括：反应缓冲液和水。
17.在本发明的一些优选的实施方式中，所述反应缓冲液包括终浓度为40mm tris
‑
hcl、60mm nacl、6mm mgcl2和ph 7.3的缓冲液。
18.在本发明的一些优选的实施方式中，所述试剂盒包括：crrna 1μl、t7转录酶1.5μl、ntp 4μl、探针2.5μl、cas13a 0.5μl、核酸扩增产物2.5μl、反应缓冲液2.5μl和水11μl；所述核酸扩增产物通过所述核酸扩增试剂扩增得到。
19.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述试剂盒包括：crrna 1μl(浓度为10μm)、t7转录酶1.5μl(浓度为1mg/ml)、ntp 4μl(浓度为100mm)、探针2.5μl(浓度为10μm)、cas13a 0.5μl(浓度为1mg/ml)、核酸扩增产物2.5μl、反应缓冲液2.5μl和水11μl；所述核酸扩增产物使用rpa或raa的系统进行扩增，和/或通过苯酚氯仿法纯化得到。上述浓度均为各组分在体系内的终浓度。
20.根据本发明的再一个方面，提出了所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
21.s1、通过所述核酸扩增试剂得到核酸扩增产物；
22.s2、将所述核酸扩增产物与crrna、t7转录酶、ntp、探针和cas13a按比例混合得到反应溶液；
23.s3、所述反应溶液进行反应并收集荧光。
24.根据本发明的一种具体的实施方式的使用方法，至少具有以下有益效果：该方法用于新城疫病毒的检测，能够在恒温条件下进行，降低对荧光pcr检测设备的依赖，且具有较高的检测灵敏度；该方法丰富临了床检测手段，为基于恒温扩增的重大动物疫病的检测试剂的制备和生产提供参考。
25.在本发明的一些实施方式中，步骤s1中所述通过所述核酸扩增试剂得到核酸扩增产物包括：使用rpa或raa的系统进行扩增得到所述核酸扩增产物；和/或通过苯酚氯仿法纯化得到所述核酸扩增产物。
26.在本发明的一些实施方式中，步骤s2中所述反应溶液的组成为：crrna 1μl、t7转录酶1.5μl、ntp 4μl、探针2.5μl、cas13a 0.5μl、所述核酸扩增产物2.5μl、反应缓冲液2.5μl和水11μl。
27.在本发明的一些实施方式中，步骤s3中所述反应溶液进行反应并收集荧光包括：所述进行反应的温度为39℃；和/或所述收集荧光的时间为30min～120min。
28.根据本发明的再一个方面，提出了试剂盒在非诊断治疗目的的新城疫病毒检测中的应用。
29.本发明的有益效果至少在于：本发明的试剂盒通过恒温扩增结合cas13a的方法可以实现高灵敏度检测；该试剂盒及检测方法用于新城疫病毒的检测，能够在恒温条件下进行，降低对荧光pcr检测设备的依赖，且具有较高的检测灵敏度；该方法丰富了临床检测手段，为基于恒温扩增的重大动物疫病的检测试剂的制备和生产提供参考。
30.本发明的描述中，参考术语“一个实施方式”、“一些实施方式”等的描述意指结合该实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
附图说明
31.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
32.图1为本发明试验例中ndv15198毒株的不同浓度质粒下，raa方法的琼脂糖凝胶电泳图；
33.图2为本发明试验例中ndv15198毒株的不同浓度质粒下，raa
‑
cas13a方法的荧光检测图；
34.图3为本发明试验例中ndv15192毒株的不同浓度质粒下，raa方法的琼脂糖凝胶电泳图；
35.图4为本发明试验例中ndv15192毒株的不同浓度质粒下，raa
‑
cas13a方法的荧光检测图；
36.图5为本发明试验例中ndv15186毒株的不同浓度质粒下，raa方法的琼脂糖凝胶电泳图；
37.图6为本发明试验例中ndv15186毒株的不同浓度质粒下，raa
‑
cas13a方法的荧光检测图；
38.图7为本发明试验例中特异性检测中ndv15198阳性核酸和另外7种禽病病毒的阳性核酸的raa
‑
cas13a方法的荧光检测图；
39.图8为本发明试验例中特异性检测中ndv15192阳性核酸和另外7种禽病病毒的阳性核酸的raa
‑
cas13a方法的荧光检测图；
40.图9为本发明试验例中特异性检测中ndv15186阳性核酸和另外7种禽病病毒的阳性核酸的raa
‑
cas13a方法的荧光检测图。
具体实施方式
41.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
42.试剂材料来源：cas13a酶的制备按照文献(j.s.gootenberg et al.，science，nucleic acid detection with crispr
‑
cas13a/c2c2，2017)的方法表达和纯化；rt
‑
raa检测试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司；rnasealert lab test kit v2购自invitrogen公司，t7试剂盒购自neb公司。其他试剂为国产分析纯试剂。
43.实施例
44.一种用于新城疫病毒检测的试剂盒，包括：crrna、t7转录酶、ntp、探针、cas13a、核酸扩增试剂、反应缓冲液和水。
45.其中，核酸扩增试剂中包括根据新城疫病毒设计的引物对和crrna，包括：(1)引物对的序列为seq id no.1和seq id no.2，crrna的序列为seq id no.3，用于检测ndv15198毒株；(2)引物对序列为seq id no.4和seq id no.5，crrna的序列为seq id no.6，用于检测ndv 15192毒株；(3)引物对序列为seq id no.7和seq id no.8，crrna的序列为seq id no.9，用于检测ndv15186毒株。使用的核酸扩增试剂还包括raa体系的其它试剂。由于病毒序列变异较大，因此在本实施例中使用三套引物来实现对新城疫不同分型毒株检测的全覆盖。
46.具体的序列信息如下表1：
47.表1.新城疫病毒引物及crrna序列
[0048][0049][0050]
crrna利用crdna合成，其中，ndv15198crdna序列为(seq id no.10)：aattctaatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacaagacaatatatgtgattagggcagatg；ndv15192crdna序列为(seq id no.11)：aattctaatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacctctcttctacccgtatttttttctaat；ndv15186crdna序列为(seq id no.12)：aattctaatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaactgccctccatcatatctgcatacatcaa。
[0051]
本实施例中使用的探针为fam
‑
uuuuuuuuuuuuuu
‑
tamra，其中，fam和tamra为荧光基团。在另一些实施例中，荧光基团还可以选择tet、hex、cy3、cy5和rox。
[0052]
一种用于新城疫病毒检测的试剂盒的使用方法，即新城疫病毒raa
‑
cas13a检测方法，包括以下步骤：
[0053]
s1、通过核酸扩增试剂得到核酸扩增产物，以设计的引物对和raa的扩增试剂组成的体系，以新城疫病毒检测样本为模板进行扩增。
[0054]
s2、制备反应溶液，构建恒温扩增后的酶切反应体系(25μl体系)为：10倍反应缓冲液2.5μl、crrna 1μl(10μm)、t7转录酶1.5μl(1mg/ml)、ntp 4μl(100mm)、探针2.5μl(10μm)、苯酚氯仿法纯化后的raa产物2.5μl、水11μl和cas13a 0.5μl(1mg/ml)。上述浓度均为各组分在体系内的终浓度。其中，反应缓冲液的为终浓度以下组分的试剂：40mm tris
‑
hcl、60mm nacl、6mm mgcl2，缓冲体系的ph 7.3。
[0055]
s3、将s2制备得到的反应溶液体系进行反应并收集荧光，反应温度为39℃，收集荧光30min。
[0056]
在本发明中，将实施例的检测方法称为“raa
‑
cas13a检测”或“raa
‑
cas13a方法”。
[0057]
对比例
[0058]
本对比例使用raa体系试剂盒(试剂盒购买自杭州众测生物科技有限公司)，使用对比例的试剂盒对新城疫病毒进行检测，具体过程为：
[0059]
s1、使用raa扩增体系，按照25μl反应体系，各试剂组分用量按照试剂盒说明书，模板用量为1μl，反应条件为37℃，30min。
[0060]
s2、raa扩增后利用琼脂糖凝胶电泳分析检测结果。
[0061]
在本发明中，将对比例的检测方法称为“raa检测”或“raa方法”。
[0062]
试验例
[0063]
本试验例测试了实施例和对比例的试剂盒对新城疫病毒的检测效果(下述试验中将实施例的检测方法称为“raa
‑
cas13a检测”或“raa
‑
cas13a方法”，对比例称为“raa检测”或“raa方法”)，主要包括其检测灵敏度、特异性和准确性，具体实验如下：
[0064]
1、raa
‑
cas13a检测的灵敏度
[0065]
分别依照实施例和对照例的检测方法，分别检测：
[0066]
(一)ndv15198毒株的不同浓度质粒，此时，使用的引物对为seq id no.1和seq id no.2，使用的crrna为seq id no.3。将梯度稀释的质粒作为模板，质粒浓度分别为1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
100拷贝/μl、0拷贝/μl。得到实验结果：
[0067]
对比例：对于ndv15198毒株的不同浓度质粒，利用普通raa可以检测到阳性质粒的最低拷贝数为104拷贝/μl，103拷贝/μl及低于该浓度的质粒不能被检出，结果如图1所示，其中，m:dna分子质量标准dl2000，孔1
‑
8：质粒浓度分别为1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
100拷贝/μl、0拷贝/μl。
[0068]
实施例：对于ndv15198毒株的不同浓度质粒，利用实施例的试剂盒进行检测(raa
‑
cas13a检测)，最低可以检测到102拷贝/μl的阳性质粒，结果如图2所示，其中，孔1
‑
8：质粒浓度分别为1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
100拷贝/μl、0拷贝/μl。
[0069]
(二)ndv15192毒株的不同浓度质粒，此时，使用的引物对为seq id no.4和seq id no.5，使用的crrna为seq id no.6。将梯度稀释的质粒作为模板，质粒浓度分别为1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
100拷贝/μl、0拷贝/μl。
[0070]
对比例：对于ndv15192毒株的不同浓度质粒，利用普通raa可以检测到阳性质粒的最低拷贝数为104拷贝/μl，103拷贝/μl及低于该浓度的质粒不能被检出，结果如图3所示，其中，m:dna分子质量标准dl2000，孔1
‑
8：质粒浓度分别为1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
100拷贝/μl、0拷贝/μl。
[0071]
实施例：对于ndv15192毒株的不同浓度质粒，利用实施例的试剂盒进行检测(raa
‑
cas13a检测系统)，最低可以检测到102拷贝/μl的阳性质粒，结果如图4所示，其中，孔1
‑
8：质粒浓度分别为1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
100拷贝/μl、0拷贝/μl。
[0072]
(三)ndv15186毒株的不同浓度质粒，此时，使用的引物对为seq id no.7和seq id no.8，使用的crrna为seq id no.9。将梯度稀释的质粒作为模板，质粒浓度分别为1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
100拷贝/μl、0拷贝/μl。
[0073]
对比例：对于ndv15186毒株的不同浓度质粒，利用普通raa可以检测到阳性质粒的最低拷贝数为104拷贝/μl，103拷贝/μl及低于该浓度的质粒不能被检出，结果如图5所示，其中，m:dna分子质量标准dl2000，孔1
‑
8：质粒浓度分别为1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
100拷贝/μl、0拷贝/μl。
[0074]
实施例：对于ndv15186毒株的不同浓度质粒，利用实施例的试剂盒进行检测(raa
‑
cas13a检测系统)，最低可以检测到102拷贝/μl的阳性质粒，结果如图6所示，其中，孔1
‑
8：质粒浓度分别为1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
100拷贝/μl、0拷贝/μl。
[0075]
2、raa
‑
cas13a检测的特异性
[0076]
为了检测本方法的特异性，将ndv阳性核酸和另外7种禽病病毒的阳性核酸利用raa
‑
cas13a进行检测。具体包括：
[0077]
(一)利用检测ndv15198型病毒引物对和crrna(使用的引物对为seq id no.1和seq id no.2，crrna为seq id no.3)检测阳性临床样本，结果如图7所示，其中，孔1：ndv；孔2：aiv；孔3：ibv；孔4：iltv；孔5：ibdv；孔6：alv；孔7：ampv；孔8：aav
‑
1。
[0078]
(二)利用检测ndv15192型病毒引物对和crrna(使用的引物对为seq id no.4和seq id no.5，crrna为seq id no.6)检测阳性临床样本，结果如图8所示，其中，孔1：ndv；孔2：aiv；孔3：ibv；孔4：iltv；孔5：ibdv；孔6：alv；孔7：ampv；孔8：aav
‑
1。
[0079]
(三)利用检测ndv15192型病毒引物对和crrna(使用的引物对为seq id no.7和seq id no.8，crrna为seq id no.9)检测阳性临床样本，结果如图8所示，其中，孔1：ndv；孔2：aiv；孔3：ibv；孔4：iltv；孔5：ibdv；孔6：alv；孔7：ampv；孔8：aav
‑
1。
[0080]
阳性样本经raa扩增后，利用cas13a反应体系可以在反应10min后检测到ndv阳性核酸明显的荧光信号增强，其余7种禽病病毒的阳性核酸无荧光信号增强。
[0081]
3、与荧光rt
‑
pcr检测结果的一致性比较
[0082]
利用实施例中设计的三套引物及其相应的crrna同时检测，有一套检出阳性即判定为ndv检测阳性。为了评价本研究建立的方法与荧光rt
‑
pcr的一致性，对本实验室保存的17份ndv的阳性cdna样本和其他36份阴性核酸样本反转录制备的cdna进行检测，其中15份阳性crdna样本荧光rt
‑
pcr的ct值低于35。全部样本利用本研究建立的raa
‑
cas13a和mark g等公布的荧光rt
‑
pct方法进行检测，其中15份荧光rt
‑
pcr方法检测阳性的样本检出，κ值介于0.81
‑
1.00之间(κ＝0.91)，说明本研究建立raa
‑
cas13a方法的检测结果与行业普遍认可的检测方法的检测结果几乎完全一致，检测结果如下表2所示：
[0083]
表2.raa
‑
cas13a与荧光rt
‑
pcr检测ndv结果的一致性比较
[0084][0085]
通过与标准中的荧光rt
‑
pcr方法比较，本研究建立的raa
‑
cas13a方法的特异性为：36/(36+0)＝100.00％；灵敏性为:15/(15+2)＝88.24％；po＝(15+36)/53＝96.23％；pe
＝17/53
×
15/53+36/53
×
38/53＝57.78％；к＝(po
‑
pe)/(1
‑
pe)＝0.91。
[0086]
综上所述，本发明的试剂盒对于新城疫病毒的检测具有极高的特异性和灵敏度，通过三套引物对和相对应的crrna即可检测出不同类型的新城疫病毒，并且对于模板的浓度要求低，最低可以检测到102拷贝/μl的阳性质粒。因此，本发明的试剂盒及检测方法用于新城疫病毒的检测，丰富了临床检测手段，为基于恒温扩增的重大动物疫病的检测试剂的制备和生产提供参考。
[0087]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。