条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法及其应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法及其应用。


背景技术：

2.抗体是指机体在抗原性物质的刺激下所产生的免疫球蛋白，其能够与相应抗原发生特异性结合。对于一般抗体而言，其结合抗原表位的部位由抗体的重链可变区(variable domain of heavy chain，vh)和轻链可变区(variable domain of light chain，vl)共同构成，但二者对于抗原结合的贡献是不同的，一般情况下，重链可变区发挥主要作用，单独的重链可变区仍具有抗原结合能力，但是轻链可变区的缺乏将使重链可变区对抗原的亲和力降低，并且易于积聚和沉淀。传统抗体来源主要包括鼠、兔和人等。1989年，ward等(nature 1989，341：544
‑
546)首次制备了仅由抗体的vh区构成的基因工程抗体，因为仅由一个结构域组成，故称之为单域抗体(single domain antibody)。之后，通过克隆一般抗体的可变区而构建的单域抗体在亲和力和稳定性等方面有了很大提高。
3.驼科动物和软骨鱼类等血清中不但存在常规的igg抗体，同时还存在一种天然缺失轻链，仅有重链的igg抗体，该类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区的单一结构域组成，被命名为重链抗体(vhh)或单域抗体，vhh同普通igg抗体分子一样保持了良好的、特异的抗原结合能力，是目前已知的具有完整抗体功能的最小分子片段，分子量仅为15kd，称为纳米抗体。重链抗体具有更长的抗原互补结合区，因此组织穿透性能力强，可以作用到一些普通抗体分子无法接触的抗原部位，发挥抗体的功能。鲨鱼的重链抗体被称为ignar，由1个可变结构域(vnar)与5个恒定结构域(cnar)组成，将可变结构域重组表达，即可获得具有完整功能的抗体分子片段，为鲨鱼的单域抗体。与传统的抗体相比，鲨鱼单域抗体具有组织渗透性好、稳定性高、制备成本低廉和生产周期短等独特优势。
4.目前，关于鲨鱼单域抗体的研究基本上是集中在单域抗体的应用、表达和检测，例如分子探针的开发、疾病诊断试剂盒以及治疗药物的研制。然而，由于市场上缺乏鲨鱼单域抗体的二抗，这就导致对鲨鱼单域抗体的制备、研究和应用都造成了限制，主要体现在：其一，目前单域抗体的筛选和制备主要通过免疫法，即以抗原对动物进行多次免疫，再建立免疫抗体库进行靶向筛选，在此过程中，抗体血清效价是检测免疫应答，以及确定抗体库时机的重要指标，但是，由于缺乏特异的二抗，目前尚无方法对免疫过程中的抗体血清效价进行有效的监测；其二，目前鲨鱼单域抗体通常携带标签蛋白，如his、flag、gst或ha等，再以标签抗体为二抗进行检测，但是，该方法的使用可能导致鲨鱼单域抗体失去其独特的优势；例如，由于动物组织的蛋白组中具有相当部分的蛋白质中存在多个his串联的情况，使用his标签抗体会产生非特异性结合，因此，带有his标签蛋白的单域抗体就不宜用于免疫检测中；此外，由于gst、mbp等标签蛋白分子量较大，这些标签蛋白的使用不仅使得单域抗体失去其“小”的优势，同时很可能导致其抗体功能及活性发生改变。
5.因此，亟需开发一种针对于鲨鱼单域抗体的多克隆抗体，以期为今后鲨鱼单域抗
体的开发、利用及相关的研究提供有力的支持。


技术实现要素：

6.为了提供针对于与鲨鱼单域抗体的多克隆抗体，以支持单域抗体的开发、利用及研究，本技术创造性地提出条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法及其应用，以克服由于鲨鱼单域抗体的二抗的缺少导致的制备和应用的限制。
7.本发明的技术方案如下：
8.本发明的目的之一在于提供条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体的制备方法，分别选取条纹斑竹鲨ignar可变区的氨基酸序列及ignar恒定区的氨基酸序列合成多肽，作为抗原，并经过动物免疫后制备得到多克隆抗体anti
‑
vnar和anti
‑
cnar。
9.进一步的，所述条纹斑竹鲨ignar可变区氨基酸序列如seq id no:1所示，为ignar可变区第18
‑
60位氨基酸序列；所述条纹斑竹鲨ignar恒定区氨基酸序列如seq id no:2所示，为ignar恒定区的第142
‑
173位氨基酸序列。
10.进一步的，所述动物免疫方法为将合成的多肽稀释后对实验级新西兰大白兔进行5次免疫，首次免疫多肽与等体积的弗式完全佐剂充分混合后，采取脊柱及后腿外侧皮下多点注射，每隔14天加强免疫1次，加强免疫选用弗式不完全佐剂，末次免疫14天后进行全血分离，收集血清，纯化得到条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体。
11.本发明的目的之一还在于提供根据上述制备方法制得的条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体。
12.本发明的目的之一还在于将上述条纹斑竹鲨单域抗体的多克隆抗体应用在血清效价检测和病理检测方面。
13.相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
14.1、根据本发明制备得到的条纹斑竹鲨的多克隆抗体，填补了目前市场上缺乏能够用于检测内源性ignar以及重组表达的vnar单域抗体的二抗的空白，同时制得的条纹斑竹鲨ignar的多克隆抗体也具有很强的灵敏度和特异性，可用于elisa、western blot以及免疫组化等实验要求，为今后鲨鱼单域抗体的开发、利用及相关的研究提供了有力的支持；
15.2、根据本发明制得得到的多克隆抗体为检测抗体血清效价和病理切片免疫组化检测提供了一种新的有效途径。
附图说明
16.图1为根据本发明制得的多克隆抗体的western blot检测结果示意图；
17.图2为根据本发明制得的多克隆抗体用于免疫组化检测的结果示意图。
具体实施方式
18.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式和附图对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
19.下述实施例中的条纹斑竹鲨(chiloscyllium plagiosum)是一种小型鲨鱼，成年后体长不超过1米，便于实验操作，是目前最常用于单域抗体开发的研究模型。
20.实施例1抗原和抗体的合成
21.分别选取条纹斑竹鲨ignar可变区第18
‑
60位氨基酸序列以及ignar恒定区第142
‑
173位氨基酸序列作为抗原多肽序列进行抗原合成，经检测，两个多肽的纯度均达到95％以上；其中，条纹斑竹鲨ignar可变区氨基酸序列如seq id no:1所示，条纹斑竹鲨ignar恒定区氨基酸序列如seq id no:2所示；将合成的多肽作为抗原，并经过动物免疫后制备得到多克隆抗体anti
‑
vnar和anti
‑
cnar；
22.seq id no:1
23.tqrveqtpttttkeagesltincvlkgsscalgstywyftkkg；
24.seq id no:2
25.wmvdgkvrnedvqieaaninqyvtisrltst。
26.实施例2多克隆抗体的动物免疫制备方法
27.采购的新西兰大白兔先静养7天，免疫前静脉取血3ml，室温静置2
‑
3h，6000rpm
·
min
‑1，离心15min，离心后去上清液，作为阴性对照；
28.分别取10μg经过实施例1合成的抗原蛋白与等量的完全弗氏佐剂混匀，充分乳化后在兔脊柱及后腿外侧皮下多点注射；14天后，将抗原与不完全弗氏佐剂混合并充分乳化后进行免疫，以后每隔14天进行免疫，总共免疫5次；最后一次免疫前少量采血，通过elisa进行血清效价检测，经elisa检测效价在1:50000，之后进行全血分离，采集兔的全部血液，得到含有条纹斑竹鲨ignar的多克隆抗体的抗血清，对抗血清进行免疫亲和纯化，获得较高纯的多克隆抗体。
29.采用过碘酸纳法将纯化后的多克隆抗体标记辣根过氧化物酶，即得到酶标抗体；将分别根据条纹斑竹鲨ignar可变区氨基酸序列以及ignar恒定区第氨基酸序列，制备的抗条纹斑竹鲨ignar可变区结构域和恒定区结构域的酶标抗体分别命名为anti
‑
vnar
‑
hrp和anti
‑
cnar
‑
hrp。
30.实施例3多克隆抗体在血清效价检测的应用
31.对条纹斑竹鲨进行尾静脉采血，分离血清，按照1:10000的比例稀释后，200μl/well包被96孔酶标板(每孔200μl)370孵育1h；pbs洗涤3次，加入2％bsa，37℃封闭1h；实验组以酶标抗体anti
‑
vnar
‑
hrp和anti
‑
cnar
‑
hrp以1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000和1:5000的比例稀释作为二抗，阴性对照组以实施例2中第一次免疫前兔血清为一抗，以羊抗兔酶标抗体为二抗；完成孵育后，pbst洗涤，每孔加入120μl tbm显色底物，避光放置10min后，每孔加入120μl h2so4终止显色，使用酶标仪在od450nm处读值；以酶标二抗样品od450 nm值与阴性对照血清od450 nm值的比值≥3作为判定标准，以最大稀释度作为该抗体的有效效价，多克隆抗体的效价检测结果如表1a和1b所示，表明所制备酶标抗体anti
‑
vnar
‑
hrp和anti
‑
cnar
‑
hrp的最高稀释度分别为1:3000和1:2000；
32.表1a酶标抗体anti
‑
vnar
‑
hrp效价检测
[0033][0034]
表1b酶标抗体anti
‑
cnar
‑
hrp效价检测
[0035][0036]
对经人pdl
‑
1免疫过后(6次免疫)的条纹斑竹鲨进行静脉采血，分离血清；将人pdl
‑
1重组蛋白稀释至0.5μg/ml，200μg/ml包被96孔酶标板，37标孵育1h；pbs洗涤后，加入2％bsa，37℃封闭1h；将分离得到的血清按照1:1000、1:2000、1:5000、1:10000和1:20000的比例稀释作为一抗，37℃孵育1h；pbst洗涤后，实验组以酶标抗体anti
‑
vnar
‑
hrp和anti
‑
cnar
‑
hrp作为二抗(稀释倍数分别为1:3000和1:2000)；阴性对照组以实施例2中第一次免疫前兔血清为二抗，以羊抗兔酶标抗体为三抗；完成孵育后，pbst洗涤，每孔加入120μltbm显色底物，避光放置10min后，每孔加入120μl 2m的h2so4终止显色，使用酶标仪在od450nm处读值；以酶标二抗样品od450 nm值与阴性对照血清od450 nm值的比值≥3作为判定标准；实验结果如表2a和2b所示，表明酶标抗体anti
‑
vnar
‑
hrp和anti
‑
cnar
‑
hrp在用于检测条纹斑竹鲨免疫过程中的抗体血清效价检测中具有较好的准确性和特异性。
[0037]
表2a酶标抗体anti
‑
vnar
‑
hrp检测免疫鲨鱼血清抗体效价
[0038][0039]
表2b酶标抗体anti
‑
cnar
‑
hrp检测免疫鲨鱼血清抗体效价
[0040][0041]
实施例4多克隆抗体western blot检测
[0042]
(1)多克隆抗体对内源性ignar的western blot检测
[0043]
蛋白样品：条纹斑竹鲨血清蛋白，浓度为100ug/ml，上样量为500ng；
[0044]
sds电泳结束后，将蛋白电转移到pvdf膜上；5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入以封闭液稀释的酶标抗体anti
‑
vnar
‑
hrp和anti
‑
cnar
‑
hpr，抗体稀释倍数分别为1:3000和1:2000，37℃孵育1h；tbst洗涤后，将ecl化学发光液a液和b液等体积混合后淋于膜上，利用化学发光凝胶成像仪(biorad chemidoc xrs)进行曝光显色；实验结果如图1a所示，在75kda上方有特异条带(条纹斑竹鲨ignar单链由730个氨基酸组成，约82kda)，表明所制备多克隆抗体均能够特异地识别条纹斑竹鲨内源性产生的ignar。
[0045]
(2)酶标抗体anti
‑
vnar
‑
hrp对重组表达vnar单域抗体的western blot检测蛋白样品：人源pdl
‑
1重组蛋白，浓度为50ug/ml，上样量为500ng；
[0046]
sds电泳结束后，将蛋白电转移到pvdf膜上；5％脱脂奶粉室温封闭2h，tbst洗涤后，以本实验室前期制备的条纹斑竹鲨抗人pdl
‑
1vnar单域抗体为一抗，37℃孵育1.5h；tbst洗涤后，以酶标抗体anti
‑
vnar
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hrp作为二抗(稀释倍数1:3000)，37℃孵育1h；tbst洗涤后，将ecl化学发光液a液和b液等体积混合后淋于膜上，利用化学发光凝胶成像仪(biorad chemidoc xrs)进行曝光显色；检测结果如图1b所示，在35kda处有特异条带(人源pdl
‑
1重组蛋白由290个氨基酸组成，约33kda)，表明所制备酶标抗体anti
‑
vnar
‑
hrp能够特异地识别条纹斑竹鲨来源的重组表达vnar单域抗体。
[0047]
实施例5多克隆抗体用于免疫组化检测
[0048]
采用冰冻切片将人胎盘组织以6盘组厚度进行切片；3wt％h2o2避光孵育10min，以阻断内源过氧化物酶的影响；pbs洗涤后，5％bsa溶液37℃封闭1h；以本实验室前期制备的条纹斑竹鲨抗人pdl
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1vnar单域抗体为一抗，37℃孵育1h；以酶标抗体anti
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vnar
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hrp作为二抗，37℃孵育1h；pbs洗涤3次后dab显色，苏木精复染、脱水透明及树胶封片，检测结果如图2所示，酶标抗体anti
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vnar
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hrp可用于免疫组化检测。
[0049]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。