一种实现单细胞定位和贴壁生长的单细胞生长控制平台

1.本发明涉及微纳器件制备与生物技术交叉领域，具体涉及一种实现单细胞定位和贴壁生长的单细胞生长控制平台。


背景技术：

2.随着现代生物学、现代医学的发展，人们开始更加关注单个细胞在环境微区的反应表现以及细胞与细胞间一些微小但可能非常重要的生化反应。并希望以此对生物体工作机制以及一些生理，病理有更深入的研究。
3.近年来，由于微纳加工技术的快速发展，人们可快速获得与单细胞、生物大分子等微小结构特征尺寸相似的图案。利用微纳加工技术来制造单细胞培养平台的技术层出不穷。目前，制备单细胞培养平台的技术主要有三种：
4.1.培养基底表面化学修饰法，利用含特异性基团的物质实现在表面的特异性的图案化。
5.2.微流控技术，采用表面特异性修饰实现图案化，通过形成的微通道网络使单细胞在限域内生长(如专利cn103421691b)。
6.这种方法其实是培养基底表面化学修饰法的改进，工艺相对较复杂。虽然后来qin等人(zhang p,yao j,wang b,et al.microfluidics
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based single
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cell protrusion analysis for screening drugs targeting subcellular mitochondrial trafficking in cancer progression[j].analytical chemistry,2020,92(4):3095
‑
3102.)经过改进，采用微流控技术得到了不需要表面修饰的单细胞培养平台，但是制备过程中所涉及的剥离，打孔等工艺仍旧相对复杂，价格昂贵，不适合大规模制备。
[0007]
3.在基底进行空间隔离法，通过微纳工艺在培养基底上形成互相隔离的小室以达到单细胞培养的目的(melamed s,elad t,belkin s.microbial sensor cell arrays[j].current opinion in biotechnology,2012,23(1):2
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8.)这种方案除了制备过程相对复杂外，所培养的细胞均为悬浮状态，与实际细胞在体内附着性生长相悖，因此悬浮培养法多适用于特定细菌和真菌的培养以及通过癌细胞改良出的特定细胞系，存在局限性。
[0008]
除此之外，更重要的一点是，上述这些解决方案都无法实现在新型微纳分析平台，如探测平台、传感平台、刺激平台上进行单细胞级别的定位集成，进而实现对单细胞的理化行为进行长期观测以及精准研究细胞间的信息传递(例如刺激其中一个细胞然后观察仅与其有联系的另一个细胞的生理变化。
[0009]
另外，为研究所有细胞潜在的生理、病理机制，需要根据在不同形变，应力下细胞的生理、病理表现提供一个可操作的柔性基底平台。但是目前现有制备单细胞培养平台无法实现机械柔韧性的功能。


技术实现要素：

[0010]
为了能够精确且直接地研究单个细胞的行为反应和理化性质并突破上述技术的
瓶颈，本发明提供一种实现单细胞定位和贴壁生长的单细胞生长控制平台，具体技术方案如下：
[0011]
一种实现单细胞定位和贴壁生长的单细胞生长控制平台，该平台包括：
[0012]
硬质衬底或功能芯片；
[0013]
柔性支撑层，沉积在所述硬质衬底上或功能芯片；
[0014]
抑制细胞生长层，沉积在所述柔性支撑层上，且所述抑制细胞生长层选用与所生长细胞生物不相容的材料；
[0015]
细胞生长层，沉积在所述抑制细胞生长层上，且根据所要生长的单细胞的尺寸以及位置对所述细胞生长层进行图案化，从而得到若干个在特定位置的单个细胞的生长空间；所述细胞生长层选用与所生长细胞生物具有生物相容性的材料。
[0016]
进一步地，对所述硬质衬底的特定位置进行刻蚀，暴露出所述柔性支撑层，通过调控所述硬质衬底间距，从而使所述柔性支撑层和抑制细胞生长层发生屈曲，实现对柔性平台弯曲曲率半径的调控，形成带有曲面的单细胞生长控制平台。
[0017]
进一步地，所述功能芯片为光电子探测平台或传感平台或刺激平台芯片。
[0018]
进一步地，所述细胞生长层选用su8、蚕丝蛋白、纤维素、pdms等生物兼容的细胞基质材料。
[0019]
进一步地，所述抑制细胞生长层选用聚丙烯酰胺、甲壳质或海藻酸纤维，厚度为5～500nm。
[0020]
进一步地，所述支撑层的厚度为0.5～5um，所述支撑层选自聚二甲基硅氧烷、聚乙烯、环氧树脂、聚酰亚胺、纤维素、聚丙烯、聚苯乙烯、蚕丝蛋白或su8。
[0021]
一种如上述的单细胞生长控制平台的制备方法，包括如下步骤：
[0022]
(1)在硬质衬底或功能芯片上沉积一层支撑层；
[0023]
(2)在所述支撑层上沉积一层抑制细胞生长层；
[0024]
(3)在所述抑制细胞生长层上沉积一层细胞生长层，并根据所要生长的细胞的尺寸以及细胞生长的位置对所述细胞生长层进行图案化，从而得到若干个在特定位置的单个细胞的生长空间；所述细胞生长层选用与所生长细胞生物具有生物相容性的材料。
[0025]
本发明的有益效果如下：
[0026]
(1)本发明的平台能够在未加入附着剂的情况下实现单细胞限域生长，实现高通量的单细胞培养，不需要对基底表面进行修饰；不需要使用多聚赖氨酸，胶原蛋白等额外需要特殊存储环境的细胞贴壁辅助试剂。
[0027]
(2)本发明的平台能够适用于所有类型的细胞及其对应的培养基和培养环境条件，这些优势使得这种简便，廉价的单细胞培养平台能够为研究所有细胞潜在的生理、病理机制提供一个可操作的平台技术。
[0028]
(3)本发明的平台可根据具体的实验应用需求，制定具有任意弯曲曲面的单细胞生长平台。
[0029]
(4)本发明的平台也可以实现通过构建特殊图案化实现单细胞之间的远程联系，并且可以通过多次接种以实现同一平台生长不同细胞的功能，有助于相同细胞间，异质细胞间功能联系的研究。
[0030]
(5)本单细胞生长控制平台适用于贴壁细胞的生长繁殖。进行贴壁细胞培养时仅
需将细胞培养基先铺满整个单细胞生长控制平台表面，之后再均匀加入已均匀悬浮的目的细胞。之后，将本单细胞生长控制平台放入100％湿度，5％二氧化碳，37摄氏度的普通细胞培养箱中，待贴壁细胞自行沉降即可在生长限定区域内形成单细胞状态的生长。相比于以往的单细胞培养策略，使用本单细胞生长控制平台不需要额外精密的仪器，例如不需要通过微流控技术将细胞吹到小孔中，也不需要使用微量移液器将单个细胞逐一移入培养孔中。同时，也不需要更改细胞培养箱的培养环境，因此该单细胞生长控制平台极大的减小了单细胞贴壁培养的难度和成本。
[0031]
(6)本发明的平台可以实现在新型微纳分析平台，如探测平台、传感平台、刺激平台上进行单细胞级别的定位集成，进而实现对单细胞的理化行为进行长期观测以及精准研究细胞间的信息传递(例如刺激其中一个细胞然后观察仅与其有联系的另一个细胞的生理变化。
附图说明
[0032]
图1为本发明的单细胞生长控制平台的示意图；
[0033]
图2为制备好的单细胞生长控制平台培养细胞后的实际显微镜成像图。
[0034]
图3是图2的局部放大图。左图是在方形图案上培养的单细胞成像图；右图是在长方形图案上培养的单细胞成像图。
[0035]
图4为带有曲面的单细胞生长控制平台的示意图。
[0036]
图5为实施例3的单细胞生长控制平台的示意图。
具体实施方式
[0037]
下面根据附图和优选实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明白，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0038]
本发明通过采用适合细胞正常的材料作为细胞生长层，同时通过控制图案化工艺能够准确定位所要生长细胞的位置以及图案的间隙，从而得到若干个在特定位置的单个细胞的生长空间。将本发明的平台用于进行细胞生长时，单个细胞能够在特定的生长空间内进行贴壁生长，从而可以实现高通量的单细胞培养，便于从单细胞水平上实现对细胞的增殖、分化和凋亡过程中细胞中的各种分子通路的变化的研究。
[0039]
本发明的单细胞生长控制平台的制备方法包括如下步骤：
[0040]
(1)在硬质衬底或所需功能芯片上沉积一层支撑层；
[0041]
(2)在所述支撑层上沉积一层抑制细胞生长层；
[0042]
(3)在所述抑制细胞生长层上沉积一层细胞生长层，并根据所要生长的细胞的尺寸以及细胞生长的位置对所述细胞生长层进行图案化，从而得到若干个在特定位置的单个细胞的生长空间；所述细胞生长层选用与所生长细胞生物具有生物相容性的材料。
[0043]
其中，硬质衬底可以为硅晶圆、玻璃片、石英片。支撑层可以为聚二甲基硅氧烷、聚乙烯、环氧树脂、聚酰亚胺、纤维素、聚丙烯、聚苯乙烯、蚕丝蛋白、su8等。支撑层厚度在0.5～5um。
[0044]
支撑层的制备可以采用提拉法，溶胶凝胶法，溶液法，喷涂法，化学气相沉积等工艺技术。
[0045]
抑制细胞生长层的材料可以为聚丙烯酰胺、甲壳质、海藻酸纤维等，厚度在5～500nm。抑制细胞生长层的制备可以采用旋涂法、提拉法、热蒸发沉积法、喷涂法等工艺。
[0046]
细胞生长层的材料可以为su8、蚕丝蛋白、纤维素、聚二甲基硅氧烷、细胞基质材料等，厚度为5～1000nm。细胞生长层的制备可以采用旋涂法、提拉法、热蒸发沉积法、喷涂法、纳米压印法等工艺技术。采用的图案化工艺可以采用光刻法、纳米压印法等。所谓的纳米压印法，是在硅片上旋涂一层50
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100um的su
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8，通过光刻技术得到与最终细胞培养所需图案相反的图案。光刻后，在光刻好的片上浇筑pdms 50
‑
100um，自然固化。固化后，剥离pdms，在带有图案面旋涂所需的细胞生长层材料，随后压印在抑制细胞生长层。取下pdms，待细胞生长层材料室温～100℃干燥。
[0047]
另外，根据不同曲面需求，对硬质衬底进行不同程度的深刻蚀，可实现不同曲面的柔性单细胞生长平台，不进行刻蚀即可得到平面的单细胞生长平台。
[0048]
实施例1
[0049]
在硅晶圆衬底上采用旋涂法镀一层具有2um的纤维素膜作为支撑层。在支撑层采用喷涂法上镀一层30nm聚丙烯酰胺作为抑制细胞生长层。在抑制细胞生长层上镀一层细胞生长层su8 100nm，根据所选细胞形态对细胞生长层进行光刻。为得到平面单细胞生长控制平台，对硬质衬底不进行深刻蚀即可得到平面的单细胞生长控制平台，如图1所示。
[0050]
将本单细胞生长控制平台用于贴壁细胞的生长繁殖时，由于本单细胞生长控制平台表面材料的理化性质类似于普通贴壁细胞培养所需的培养皿、培养孔和培养瓶的表面材料理化性质，因此使用该单细胞生长控制平台的操作流程与普通贴壁细胞培养的流程无明显差异：进行贴壁细胞培养时仅需将细胞培养基先铺满整个单细胞生长控制平台表面，之后再均匀加入已均匀悬浮的目的细胞。之后，将本单细胞生长控制平台放入100％湿度，5％二氧化碳，37摄氏度的普通细胞培养箱中，待贴壁细胞自行沉降即可在生长限定区域内形成单细胞状态的生长。图2和图3是相应的单细胞培养成像图。
[0051]
实施例2
[0052]
在硅晶圆衬底上采用提拉法镀一层600nm的聚酰亚胺膜作为支撑层。在支撑层采用热蒸发沉积法上镀一层50nm甲壳质作为抑制细胞生长层。在抑制细胞生长层上采用纳米压印法镀一层带有所需图案的细胞生长层蚕丝蛋白200nm，在50℃下烘干。为得到柔性曲面单细胞生长控制平台，对衬底的特定位置进行刻蚀，暴露出所述柔性支撑层，通过调控所述硬质衬底间距，从而使所述柔性支撑层和抑制细胞生长层发生屈曲，实现对柔性平台弯曲曲率半径的调控，形成带有曲面的单细胞生长控制平台。平台示意图如图4所示。
[0053]
实施例3
[0054]
在刺激芯片上采用旋涂法镀一层具有1um的聚酰亚胺膜作为支撑层。在支撑层采用旋涂法上镀一层30nm聚丙烯酰胺作为抑制细胞生长层。在抑制细胞生长层上镀一层50nm厚的细胞生长层su
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8，根据所选细胞形态以及细胞生长所需的位置对细胞生长层进行光刻(此步骤通过光刻技术(对准工艺)即可实现对单细胞培养位点在平台上的精准定位)，即可实现在所需芯片测试平台上的单细胞精准定位。如图5所示，图5中采用的是一个利用光栅耦合器发射光的细胞光刺激芯片。基于实施例1中细胞培养方案，可将所需细胞定位培养在光栅耦合器上方后，将光通过芯片上的光栅耦合器，实现光束的垂直出射，进一步实现片上定位对细胞进行光刺激。
[0055]
本领域普通技术人员可以理解，以上所述仅为发明的优选实例而已，并不用于限制发明，尽管参照前述实例对发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在发明的精神和原则之内，所做的修改、等同替换等均应包含在发明的保护范围之内。