一种菌剂及其在降解草坪枯草层中的应用

1.本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种菌剂及其在降解草坪枯草层中的应用。


背景技术：

2.枯草层是指由草坪草周期性脱落的根系、水平茎(匍匐茎和根状茎)和成熟的叶鞘叶片堆积起来而形成的，处于地表与绿色植物之间的半分解半腐烂状态的有机物。
3.枯草层形成影响着草坪草根系与外界水、肥、气的交流，从而影响草坪质量和使用年限以及弹性、缓冲及耐践踏能力等运动指标，尤其是高质量草坪(足球场、高尔夫球场果岭等)的枯草层防控直接影响着其使用功能及经济价值。枯草层的过度积累为草坪病原菌和害虫提供有利的生长环境，增加了病虫害防控的难度；所施肥料被枯草层截留，利用率降低；与外界环境交流难度增加，易形成旱害和冻害。过厚的枯草层使土壤的物理性状降低，通透性变差，影响草坪根系对土壤水、肥、气的吸收，降低草坪的观赏性和运动性，降低草坪的使用年限。适宜的枯草层厚度是草坪养护管理的主要目标之一。
4.现有技术中，运动场草坪常选用打孔、垂直刈割等物理方法，改善草坪通透性，或施尿素、硫酸铵等化学方法，促进微生物的生命活动，从而达到降解枯草层的效果。但都对原有草坪构成不同程度的影响。前人的研究中也曾提出利用微生物降解草坪枯草层的方法，但其较为笼统，仅提出选育一类符合特定要求的真菌，制成菌剂后喷施，对实际生产应用来说，相当于提供了概念和要求，没有具体的方法和结果，不具实操性，效率不高，且能用于降解枯草层的微生物种类，不应局限于前人所提出的胞外木质素降解酶和纤维素酶的活性高这一前提条件。
5.在枯草层与土壤接触的区域，湿度较高、温度变幅相对较小、受阳光紫外线幅照的强度微弱，为真菌生长提供了较为适宜的环境条件，同时枯草层和土壤又为真菌的生长提供了基本的营养物质，人工接种的真菌孢子、菌丝体能在枯草层上萌发、生长、分泌多种酶。但由于草坪浇水频率较高，易对枯草层中接种的菌剂形成冲刷，践踏频率相对较高，对真菌定殖环境造成很大扰动，所以微生物菌剂在枯草层的最佳施用量不能与其他凋落物一概而论。
6.综上，仍有必要研究一种可在多种草坪上均达到有效降解枯草层效果的新的方案。


技术实现要素：

7.针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种易操作、成本低、通用性强，省工省力、安全无害，且时效长的可降解枯草层的菌剂。
8.为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
9.一种菌剂在降解草坪枯草层中的应用，所述菌剂为淡紫拟青霉菌剂。
10.淡紫拟青霉菌寄主广、易培养、能产生大量孢子，常用于草坪草病虫害防治。本发
明经研究发现，在与枯草降解相关酶中，虽然淡紫拟青霉仅能产生葡聚糖酶，但将其单独使用，仍可实现有效降解多种草坪枯草层的效果，即，本发明发现淡紫拟青霉产生的其他酶及本身的生命活动也能影响其他相关酶活性，进而提高枯草层的降解效果。使用本发明方法屏蔽了常规枯草治理中采用的打孔、垂直刈割、火烧等物理方法对草坪草的伤害，减少了施氮肥、石灰、生长延缓剂等化学方法对草坪的负面影响，为淡紫拟青霉的田间应用提供了新的方法和思路。
11.本发明中，所述菌剂的施用量为20
‑
30亿淡紫拟青霉孢子/m2。
12.优选，所述菌剂的施用量为20亿淡紫拟青霉孢子/m2，以利于在保证治理效果的同时节约成本。
13.本发明应用时，在光照强度低于600μmol
·
m
‑2·
s
‑1的晴天时，将所述菌剂或所述菌剂的悬浮液直接喷洒在枯草层。
14.本发明具体应用时，可通过固体发酵等方式获得大量的淡紫拟青霉孢子；在每年的春末夏初至夏末秋初，将活孢子菌剂参照本发明施用量，直接喷洒在枯草层后浇适量水，或先将活孢子菌剂配置成悬浮液后喷洒在枯草层。本发明中，在枯草层与土壤接触的区域，湿度较高、温度变幅相对较小、受阳光紫外线幅照的强度微弱，为微生物生长提供了较为适宜的环境条件，同时枯草层和土壤又为微生物的生长提供了基本的营养物质，人工接种的淡紫拟青霉孢子能在枯草层上萌发、生长，利用菌丝分泌的各种特定物质相互配合，分解枯草中的几丁质、纤维素和蛋白质等，降解草坪枯草层。
15.本发明中，在将所述菌剂或所述菌剂的悬浮液直接喷洒在枯草层前，还包括扩繁的步骤。
16.本发明中，所述扩繁时采用固体培养基，所述固体培养基中，麸皮和玉米粉的质量比为(3.5
‑
4.5)∶1，料水比为1∶(0.5
‑
0.7)g/ml，丙酸钠的含量为0.09
‑
0.11％，初始ph值为6.0
±
0.2。
17.优选，所述扩繁时采用固体培养基，所述固体培养基中，麸皮和玉米粉的质量比为4∶1，料水比为1∶0.6g/ml，丙酸钠的含量为0.10％，初始ph值为6.0
±
0.2。
18.本发明中，所述扩繁时的培养温度为25
±
1℃，培养时间为10
±
1d。
19.优选，所述扩繁时的培养温度为25℃，培养时间为10d。
20.作用一个具体实施方式，本发明的应用方法，包括以下步骤：
21.s1发酵：通过固体发酵的方式获得大量的淡紫拟青霉孢子。
22.s2菌剂加工：
23.1)用孢子收集器收集固体发酵培养物上的孢子；或
24.2)将固体发酵培养物低温干燥、粉碎，直接获得富含孢子的粉剂。
25.s3确定菌剂浓度：采用稀释涂布平板法分别确定菌剂的微生物浓度。
26.s4喷洒：
27.1)直接将淡紫拟青霉孢子或富含孢子的粉剂喷洒在枯草层；或
28.2)先将淡紫拟青霉孢子或富含孢子的菌剂配置成悬浮液，可加入能促进孢子萌发的营养物质，喷洒在枯草层；
29.3)菌剂的施用量参照本发明限定用量，浇水较为频繁的草坪或对使用效果有时间要求的草坪，可适当增加菌粉的用量。
30.s5补施：理论上菌剂在一次施用后无需补施，但不同地区气候，温湿度等影响，微生物的定殖扩繁效果会有差异，为达到更好的降解枯草层的效果，可在第一次施用两个月后进行二次补施，施用量可较第一次略有减少。
31.s6技术要点与注意事项：
32.1)勿与化学杀菌剂混合施用；
33.2)喷施时间不宜选择在阳光强烈的中午，以免紫外线杀伤菌粉中的孢子，勿使药剂直接放置于强阳光下；
34.3)喷施后让枯草层保持一定的湿度，以利微生物的生长，但要避免强灌水造成菌剂中大量微生物随地表径流流失，无法定殖；
35.4)注意安全使用，淡紫拟青霉可寄生眼角膜，如不慎进入眼睛，需立即用大量清水冲洗。
36.5)贮存于阴凉干燥处，勿使药剂受潮。
37.本发明的有益效果至少在于：
38.本发明利用纯微生物活孢子制剂进行枯草治理，可工厂化生产，具有高效、广谱、长效、安全、无致病作用、无污染、无残留等特点。本发明应用方式适用于多种草坪枯草治理，可以扩大淡紫拟青霉菌剂的使用范围，提高其应用价值，同时为降解草坪枯草层提供具体的长效生物方法，简单、安全、高效。
39.本发明方法还降低了打孔、垂直刈割等物理方法对草坪草的伤害，减少了施氮肥、生长延缓剂等化学方法对草坪的负面影响。
具体实施方式
40.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
41.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.实施例1
43.本实施例中淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)菌剂由中国农业科学院植物保护研究所提供(聂海珍,孙漫红,李世东,钟增明.棉隆与淡紫拟青霉联合防治番茄根结线虫病的效果评价[j].植物保护学报,2016,43(04)：689
‑
696.)，采用固体发酵(淡紫拟青霉固体发酵的最佳培养基组成为麸皮和玉米粉4∶1(质量比)、料水比1∶0.6g/ml，丙酸钠含量为0.10％、初始ph值为6.0，固体发酵最佳的培养温度25℃，培养时间为10d)的方式获得大量的淡紫拟青霉孢子后，将固体发酵培养物低温干燥、粉碎，制成富含孢子的淡紫拟青霉菌剂，浓度为2亿活孢子/g。供试植株是从北京林业大学昌平试验基地选择的初始土壤条件相同，生长年限均为8年的高羊茅、早熟禾、匍匐翦股颖三种常用草坪草，将其移栽至温室中后，测得初始枯草层厚度分别为0.87cm、0.74cm、0.75cm。移栽草坪草至温室条件(日夜温度约为29℃/17℃，光照时间为13h，光照强度约600μmol
·
m
‑2·
s
‑1)两周后，三种草均已适应温室的生长环境，此时正式开始试验。
[0044]
1、不同施量淡紫拟青霉菌剂在土壤中的定殖效果验证
[0045]
设定实验施量分别为20亿活孢子/m2，25亿活孢子/m2，30亿活孢子/m2。分别称取对应施量的淡紫拟青霉菌剂，在光照强度低于600mol
·
m
‑2·
s
‑1的晴天时，将其直接喷洒在供试高羊茅、早熟禾、匍匐翦股颖盆栽的枯草层，浇适量的水，以菌剂融入枯草层且盆栽底部无漏出水为宜。喷施后每两天取一次根系混合土样，采用稀释涂布平板法观察土壤样品中淡紫拟青霉含量。
[0046]
结果发现：喷施菌剂一周内，不同浓度处理的不同草坪草土壤中陆续出现淡紫拟青霉，喷施一周后所有处理的草坪草土壤中均稳定出现淡紫拟青霉，且淡紫拟青霉的含量差异不大，均为2500活菌/g土左右。
[0047]
结果说明喷洒淡紫拟青霉菌剂一周后，淡紫拟青霉可成功定殖于供试土壤中，并扩繁生长。淡紫拟青霉在不同草坪草土壤中定殖效果无显著差异。
[0048]
综合经济等因素考量，最终在应用中优选20亿活菌/m2的喷施浓度。
[0049]
2、淡紫拟青霉菌剂对不同草坪草枯草层降解效果试验
[0050]
参考上述试验结果和喷施方式，将淡紫拟青霉菌剂按照20亿活菌/m2的施量均匀喷施在三种供试草坪草盆栽中，每种草设置四个重复，另外设置无处理的空白对照。一个月后测定相关指标。
[0051]
有机质含量采用高温灼烧法测定，可溶性糖采用蒽酮比色法测定，纤维素酶活采用dns比色法测定，定义每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活单位u。
[0052]
(1)有机质含量，测试结果见表1。
[0053]
喷施菌剂的三种草坪草土壤有机质含量均显著高于未喷施处理，且三者间差异不显著。无菌剂处理的空白对照中，高羊茅的有机质含量相较于其他两种草种差异显著，明显高于早熟禾和匍匐翦股颖。
[0054]
表1淡紫拟青霉菌剂喷施前后不同草坪草土壤的有机质含量(％)
[0055][0056]
注：表格中同一列不同大写字母间差异显著(p<0.05)，同一行不同小写字母间差异显著(p<0.05)，下同。
[0057]
(2)可溶性糖含量，测试结果见表2。
[0058]
喷施菌剂的三种草坪草枯草层可溶性糖均显著高于未喷施处理，且高羊茅草坪枯草层的可溶性糖含量显著高于早熟禾和匍匐翦股颖。无菌剂处理的空白对照中，三种草坪草枯草层的可溶性糖含量均较低，且三者无显著性差异。
[0059]
表2淡紫拟青霉菌剂喷施前后不同草坪草枯草层的可溶性糖含量(％)
[0060][0061]
(3)纤维素酶活，测试结果见表3。
[0062]
喷施菌剂的三种草坪草枯草层纤维素酶活均显著高于未喷施处理，且三者间差异显著，高羊茅显著高于早熟禾，早熟禾显著高于匍匐翦股颖。无菌剂处理的空白对照中，三种草坪草枯草层的纤维素酶活均较低，且三者无显著性差异。
[0063]
表3淡紫拟青霉菌剂喷施前后不同草坪草枯草层的纤维素酶活(u/g)
[0064][0065]
结果表明，在盆栽条件下，对高羊茅、早熟禾、匍匐翦股颖草坪枯草层喷施淡紫拟青霉菌剂，可以使三种草坪草的土壤有机质含量、可溶性糖含量、纤维素酶活均显著提高，说明淡紫拟青霉在三种草坪定殖扩繁后，使其凋落物转化为土壤有机质的能力提高，枯草层中纤维素酶活升高，降解纤维素的速率加快，可溶性糖含量提高，枯草层转化为易吸收糖类的速率加快，枯草层更易降解，且淡紫拟青霉菌剂对高羊茅草坪的枯草层影响更为显著。
[0066]
实施例2
[0067]
本实施例中采用实施例1中的淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)制剂和枯草芽孢杆菌制剂(杨琦瑶,索雅丽,郭荣君,李世东,许修宏.枯草芽孢杆菌b006对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌组分分析[j].中国生物防治学报,2012,28(02)：235
‑
242.；由中国农业科学院植物保护研究所提供)，采用固体发酵(淡紫拟青霉发酵方式见实施例1。枯草芽孢杆菌的培养基为：豆粕40g/l、玉米粉20g/l、葡萄糖15g/l、磷酸氢二钾3g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸按0.35g/l、酵母浸粉0.2g/l、硫酸锰0.2g/l、硫酸亚铁0.1g/l、碳酸钙0.1g/l。发酵条件为：初始ph7.2，接种量5％，发酵温度35℃，摇床转速250r/min)的方式分别获得大量的淡紫拟青霉孢子和枯草芽孢杆菌芽孢后，将固体发酵培养物低温干燥、粉碎，制成富含孢子的淡紫拟青霉制剂和枯草芽孢杆菌制剂，浓度分别为2亿活孢子/g和100亿活菌/g。试验在北京某高尔夫球场高草区(高羊茅与草地早熟禾3∶7混播草坪)展开。
[0068]
1、不同微生物处理对草坪枯草层的影响
[0069]
设定本试验中淡紫拟青霉菌剂施量为20亿活孢子/m2，枯草芽孢杆菌菌剂施量为200亿活菌/m2。
[0070]
试验采用随机区组设计，在光照强度低于600mol
·
m
‑2·
s
‑1的晴天进行。处理组为喷施淡紫拟青霉制剂(pl)，并设置未喷施菌剂为空白对照(k)，喷施枯草芽孢杆菌制剂为效果对照(bs)，每种处理设置三个重复，试验持续两个月。在试验进行1天、4天、7天、14天分别取样进行微生物含量检测，在整个试验周期结束时取样，测定其他相关指标。
[0071]
两种微生物的含量采用荧光定量pcr的方法测定；草坪质量采用9分制(陈谷，马其东.ntep评价体系在草坪草评价中的应用[j].草业科学，2000(01)；63
‑
69,40)，依据草坪颜色、均一度、盖度等方面打分来评价草坪质量，1代表草坪完全死亡，9代表草坪颜色浓绿、稠密、均一，有茂盛的地上茎叶，6代表可接受的最低草坪质量水平；有机质含量采用高温灼烧法测定；纤维素酶活采用dns比色法测定，定义每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活单位u；半纤维素酶活采用dns比色法测定，定义每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活单位u；葡萄糖苷酶活采用比色法测定，定义1毫升酶液每分钟水解p
‑
npg产生p
‑
np的
量(nmol)为1个酶活单位u；半乳糖苷酶活采用比色法测定，定义1毫升酶液每分钟水解o
‑
npg产生o
‑
np的量(nmol)为1个酶活单位u。测试结果见表4、表5、表6。
[0072]
表4不同微生物处理下枯草层中淡紫拟青霉的含量(cfu/g)
[0073][0074]
表5不同微生物处理下枯草层中枯草芽孢杆菌的含量(cfu/g)
[0075][0076]
注：表4和表5中的0d的数据指试验开始前未进行喷施处理时的数据。
[0077]
由表4、表5可知，两种微生物制剂在施用后，均可在草坪正常养护管理条件下定殖在枯草层中，并扩繁生长；其中施用淡紫拟青霉制剂也可在一定程度上提高枯草层中枯草芽孢杆菌的含量。
[0078]
表6不同微生物处理下草坪质量、枯草层有机质、土壤有机质、纤维素酶活、半纤维素酶活、葡萄糖苷酶活、半乳糖苷酶活变化
[0079][0080]
注：同一行不同小写字母间差异显著(p<0.05)。
[0081]
由表6可知，淡紫拟青霉制剂处理下，草坪质量较空白组显著提升；土壤中有机质含量未受到微生物处理的显著影响，但枯草层有机质含量均因微生物的影响而显著上升，且淡紫拟青霉制剂处理的草坪枯草层有机质上升更显著，说明相较于土壤层，添加的微生物更易在枯草层定殖扩繁；两种微生物处理下，枯草层中纤维素酶活、半纤维素酶活、葡萄糖苷酶活、半乳糖苷酶活均显著提高，说明淡紫拟青霉能显著提高枯草层中多种降解酶活性，且其效果较枯草芽孢杆菌更为显著。
[0082]
综合可知，在温室和大田条件下，淡紫拟青霉制剂处理均能提高草坪土壤中多种相关酶活性，从而影响草坪枯草层的降解速率。
[0083]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因
此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。