一种小分子化合物及其在制备治疗或预防阿尔兹海默症的相关产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域的新用途，属于阿尔兹海默症的相关药物研究领域，具体涉及一种小分子化合物及其在制备治疗或预防阿尔兹海默症的相关产品中的应用。


背景技术：

2.阿尔兹海默症(alzheimer's disease，ad)是一种逐渐加重的神经退行性疾病，广泛影响到患者的大脑皮质和海马区域，导致患者进行性记忆减退，严重影响正常老年人的认知功能，给患者带来严重的生活负担，也给社会带来沉重的经济压力。到2018年，全球大约有0.44亿人患有阿尔兹海默症，而这个数字将会在2050年达到1.5亿人，然而其中具体机制不是很清楚，并且尚无显著改善的药物治疗。
3.目前对于阿尔兹海默症的致病原因可能与细胞外空间和血管壁上的斑块状不溶淀粉状蛋白β(aβ)的积累以及神经元中微管tau蛋白聚集导致的神经缠结增加有关。aβ蛋白是由app蛋白上裂解下来，并以可扩散的寡聚物(aβο)的方式释放到细胞外环境中。aβo可以通过apoe介导从大脑中清除，也可以通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1(lrp1)被星形胶质细胞摄取从而降低脑组织中aβo的浓度。此外，aβo还可以在细胞间隙中聚集形成原纤维结构，然后将其组装成斑块。aβ斑块可通过吞噬作用被巨噬细胞和小胶质细胞清除，也可以在星形胶质细胞的内切蛋白酶(ide、nep、mmps)作用下降解。然而目前研究认为，在阿尔兹海默症临床前期，就可以出现脑脊液中aβo清除效率降低，增加脑脊液aβo浓度，这可能与这些降解蛋白酶功能失调有关。此外，并不是所有aβo都可以被清除，一些从aβ原纤维解离的低聚物可能未被清除，并且对相邻的突触有一定毒性，促使微管相关tau蛋白的过度磷酸化和聚集，使其失去了与微管结合和稳定微管的作用，聚集形成成对螺旋丝，加重认知功能的退变。
4.wnt信号通路在成人大脑中调控神经元突触可塑性和记忆功能中也起到重要作用，之前的研究发现在家族性ps1突变的家族性ad患者中，β-catenin蛋白表达显著下降，且在前脑神经元细胞中特异性敲除lrp6受体，可以显著损伤突触可塑性，增加aβ蛋白的表达，这可能与wnt信号受到抑制时，激活bace1蛋白的表达，促进aβ蛋白剪切体的形成。而gsk-3β参与wnt信号，当wnt信号受到抑制时促进gsk-3β去磷酸化，将其磷酸根转移至β-catenin蛋白中，加速其讲解，从而起到抑制wnt信号作用。因此，gsk-3β参与介导wnt信号调控的ad进展作用。gsk 3inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)作为一种gsk-3β抑制剂，因此可能在阿尔兹海默症发病中起到重要作用。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种小分子化合物及其在制备治疗或预防阿尔兹海默症的相关产品中的应用，该小分子化合物结构简单，目前治疗阿尔兹海默症药物提供了一种全新的选择和思路，拓宽了治疗阿尔兹海默症药物的选择领域。
6.一种小分子化合物，所述小分子化合物为6-溴靛玉红-3'-肟(6-bromoindirubin-3'-oxime，bio，gsk 3inhibitor ix)，具体结构式如下所示
7.优选的是，所述相关产品为药物。
8.一种药物组合物，其活性成分为上述小分子化合物，即gsk 3inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)。
9.作为改进的是，所述药物的给药途径包括口服、肌肉注射、静脉输注、皮下注射及鞘内注。
10.有益效果：
11.与现有技术相比，本发明一种小分子化合物及其在制备治疗或预防阿尔兹海默症的相关产品中的应用，具有如下优势：
12.1.本发明主要基于gsk 3inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)而进行药效学验证，实验证明其可以通过抑制gsk3β,从而抑制细胞内bace1表达，降低aβ蛋白产生的过程，可用于进一步制备治疗和/或预防阿尔兹海默症的相关产品。
13.2.本发明为目前治疗阿尔兹海默症药物提供了一种全新的选择和思路，拓宽了治疗阿尔兹海默症药物的选择领域。
附图说明
14.图1(a)为在不同浓度bio处理后的神经元细胞系n2a细胞中bace1 mrna表达水平；
15.图1(b)为在不同浓度bio处理后的神经元细胞系n2a细胞中β-catenin蛋白、bace1蛋白水平；
16.图2(a)为在2um bio处理后的阿尔兹海默症细胞模型(n2a-app)细胞上清中αβ40蛋白浓度差异；
17.图2(b)为在2um bio处理后的阿尔兹海默症细胞模型(n2a-app)细胞上清中αβ42蛋白浓度差异；
18.图3为将2um/只的浓度计量通过腹腔注射于5月龄阿尔兹海默症模型小鼠(app/ps1小鼠)中，3月后检测小鼠脑皮质中淀粉样蛋白板块形成情况。
具体实施方式
19.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
20.实施例1实验材料
21.1.1 gsk 3 inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)的准备从mce公司
(medchemexpress.co)购入纯度99.66％的gsk 3 inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)，其化学结构式如下：
[0022][0023]
将购买的gsk 3 inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)粉末溶于dmso中，配制浓度为10mm的gsk 3 inhibitor ix(bio)，分装后冷冻保存备用，使用时用dmso稀释成相应浓度。
[0024]
1.2阿尔滋海默细胞模型(n2a-app细胞)准备
[0025]
n2a-app细胞系的构建方法如下：
[0026]
一、实验材料：
[0027]
1.细胞株和慢病毒：
[0028]
病毒(prlenti-cmv-mcs-3flag-pgk-puro，和元构建：gl102)；
[0029]
病毒(prlenti-cmv-app695swe(k595n/m596l)-3flag-pgk-puro，和元构建：h13319)；neuro-2a细胞来源于atcc公司，
[0030]
培养基：mem+10％fbs，37℃，5％co2培养；
[0031]
2.主要试剂耗材：
[0032]
mem(hyclone,sh30023.01b)；胎牛血清(gibco：10099-141)；polybrene(sigma:h9268)；puromycin(sigma:p8833)；24孔板(corning:3524)；6孔板(corning:3516)；60mm dish(corning:430166)；100mm dishcorning:430167)
[0033]
3.主要仪器设备：
[0034]
荧光显微镜(dmi8，leica)；co2培养箱(311，thermo)；生物安全柜(bsc
‑ⅱ‑
a2，上海净化)。
[0035]
二、实验步骤
[0036]
1、细胞铺板：
[0037]
将neuro-2a细胞按30％汇合度接种到6cm培养皿
[0038]
1)neuro-2a细胞配成0.33
×
105cells/ml细胞悬液，待铺板；
[0039]
2)每皿铺3ml，即1
×
106cells/well，铺6个6cm培养皿。
[0040]
2、感染慢病毒：
[0041]
12～20小时后感染病毒
[0042]
加病毒量计算方法：(细胞数
×
moi值/病毒原液滴度)
×
103＝病毒加药量(μl)
[0043]
病毒量，见下表所示。
[0044][0045]
1)加polybrene：每皿加15μl、1mg/ml polybrene，最终在细胞样品中polybrene终浓度为5μg/ml；
[0046]
2)感染12-20小时后换培养基：弃去培养基，每皿加入3ml新鲜的培养基。
[0047]
3、稳定株筛选
[0048]
1)72h以后，加入终浓度1μg/ml puromycin；每隔2-3天换一次终浓度1μg/ml puromycin新鲜培养基；
[0049]
2)药物筛选约两周后，拍荧光照片；
[0050]
3)稳定细胞株冻存。
[0051]
实施例2 gsk 3 inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)对wnt信号激活抑制bace1表达
[0052]
为了验证gsk 3 inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)对神经系统作用，将不同浓度bio(2um、5um)加入实施例1准备的神经细胞系n2a细胞中，24小时后检测细胞wnt信号通路蛋白含量，明确bio对神经细胞wnt信号的激活作用。具体为检测bio对bace1蛋白表达情况，24小时后检测n2a细胞bace1 mrna表达水平发现，bio可以显著抑制bace1 mrna的表达(图1(a))。
[0053]
此外，将不同浓度bio(2um、5um)加入神经细胞系n2a细胞中培养48小时后，发现其细胞内β-catenin蛋白含量显著增加，同时在不同浓度作用下，bace1蛋白含量显著降低。这表明，gsk 3inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)可以通过激活神经元细胞中wnt信号通路，从而抑制bace1蛋白表达，参与到阿尔兹海默症发病过程。
[0054]
实施例3 gsk 3 inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)抑制aβ蛋白产生
[0055]
为了明确gsk 3 inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)通过激活wnt信号，参与aβ蛋白产生，我们通过构建n2a-app阿尔滋海默细胞模型，向其中加入2um浓度bio，24小时后收集细胞培养基上清，elisa检测上清中aβ40和aβ42浓度发现，bio组其浓度显著降低。这表明gsk 3inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)可以显著抑制aβ蛋白产生。
[0056]
实施例4 gsk 3inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)治疗抑制阿尔兹海默症小鼠淀粉样蛋白板块沉积
[0057]
将2um/只的浓度计量通过腹腔注射于5月龄阿尔兹海默症模型小鼠(app/ps1小鼠)中，3月后进行脑组织淀粉样蛋白板块染色检测，bio治疗组可以显著降低阿尔兹海默症模型小鼠大脑皮质淀粉样蛋白板块形成。这表明，gsk 3inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)对阿尔滋海默症具有一定的治疗作用。
[0058]
综上所述，gsk 3 inhibitor ix(6-bromoindirubin-3'-oxime；bio)在细胞和动
物层面中具有减少神经元细胞内bace1蛋白水平，进而抑制aβ蛋白的产生的作用，可用于制备具有缓解或治疗阿尔兹海默症的相关产品中。
[0059]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。