与短裸甲藻毒素-A特异性结合的适配体及其应用的制作方法

与短裸甲藻毒素
‑
a特异性结合的适配体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药工程技术领域，具体地说，是一条基于磁珠selex技术筛选获得的与短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)特异性结合的高亲和力适配体，可用于临床样本中短裸甲藻毒素
‑
a的快速检测诊断和水体、食品中短裸甲藻毒素
‑
a的监测。


背景技术：

2.短裸甲藻毒素是一种脂溶性的神经性贝类毒素，具较长的半衰期和较强的热稳定性，根据基本化学结构可以分为a型(btx
‑
a)和b型(btx
‑
b)。一般的烹饪加工方法无法去除毒素或者让毒素失活，因此这类毒素对人类健康有严重的潜在威胁。btx可以通过食物链在贝类等组织中富集，误食后可引起一系列神经性的中毒症状，如恶心、腹泻、麻痹、痉挛、支气管收缩、昏迷等。btx在空气中形成气溶胶被吸入后也能引起呼吸衰竭或心室纤颤等症状。全球范围内已经有许多btx因吸入或者误食引起的中毒事件。目前还没有特效药用于btx中毒的治疗。因此，亟需建立一种准确、灵敏的btx
‑
a检测方法，以便更好的监控水体和水产品中btx
‑
a的水平，进而保障人们和水生生物的安全。
3.目前，常用的btx
‑
a检测方法主要分为三大类，即小鼠生物法、色谱法和免疫化学法。小鼠生物法(mba)是检测btx
‑
a最传统的生物分析方法。然而，该方法不仅成本高、特异度低、重现性差，而且还存在伦理道德问题。色谱法，如高效液相色谱法(hplc)和液相色谱质谱联用(lc
‑
ms)等也逐渐完善，其中液相色谱质谱联用技术已经被欧盟确定为首要的检测方法。然而，该方法需要进行复杂的样品前处理过程，相关仪器设备昂贵，对技术人员有较高的技术要求。免疫化学法需要制备高灵敏性和高特异性的抗体，抗体为蛋白质，容易受到温度的影响而使其稳定性产生很大的波动，同时抗体的制备，周期相对较长，成本高，检测中会受到抗体的交叉发应及结构类似物的假阳性干扰，且操作较繁琐，这些都限制了该技术的进一步发展和应用。因此，亟需建立一种快速、灵敏的新型检测方法。
4.近年来，生物传感器检测法因能克服传统检测方法的众多缺点而备受研究者们的关注。生物传感器的核心部件是分子识别元件，抗体是一种发展完善且备受关注的分子识别元件，但是，抗体不仅价格昂贵，容易变性，还会出现批次间的差异。因此，需要寻找一种新的分子识别元件。
5.适配体(aptamer)是指利用指数富集的配体进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex)从特定的寡核苷酸库中筛选出与靶分子有特异性相互作用的寡核苷酸(ssdna或rna)。适配体分子可形成多种稳定的空间结构，如茎环、发夹、假结、g
‑
四聚体等，与靶分子形成空间互补，通过静电作用、范德华力以及氢键等分子间作用力，与靶分子紧密地和特异性地结合。适配体具有靶标广泛、亲和力高、特异性好等优点，使其在基础研究、分析检测、临床诊断治疗与新药研发等方面均显示了广阔的应用前景。作为一种新型分子识别元件，适配体与抗体相似，但优于抗体。例如，适配体能够与多种基团连接，修饰方便；适配体化学性质稳定，不容易变性；适配体可以直接化学合成，成本低廉。
6.目前，已经有很多学者将适配体应用于海洋生物毒素检测领域，并与生物传感器平台(如电化学、荧光技术和表面等离子共振等)结合，研发了许多快速、新颖的检测方法。然而，还没有关于btx
‑
a适配体的相关报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供多条能够与短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)进行高亲和力特异性结合的单链dna适配体，并对这些适配体与btx
‑
a之间的亲和力进行测试，得到亲和力常数(k
d
)值最小的一条适配体a5。本发明的第二目的在于以截短的方式对该适配体a5进行优化，提供结合能力更强，而且长度更短的btx
‑
a适配体(a5a)。本发明的第三目的在于提供适配体的应用，如适配体在制备短裸甲藻毒素
‑
a检测试剂、试剂盒或传感器中的应用，在制备短裸甲藻毒素
‑
a分离富集试剂中的应用，以及在自来水样品中btx
‑
a的快速检测中的应用，并为水体或水产品中btx
‑
a的去除奠定基础。
8.为了实现上述目的，本发明的主要技术方案：通过磁珠
‑
selex技术筛选并得到一条能够与btx
‑
a以高亲和力特异性结合的单链dna适配体(a5)。根据在线工具the mfold web server对其二级结构的预测，对适配体a5进行截短优化，并得到优化后的适配体a5
‑
s3g。通过与生物传感器平台相结合，可以制备btx
‑
a适配体传感器，并将其用于btx
‑
a的快速检测。
9.本发明首先提供一组与短裸甲藻毒素
‑
a特异性结合的适配体，具有如下所示的通式(seq id no.6)：
[0010]5’‑
ataccagcttattcaatt
‑
n
60
‑
agatagtaagtgcaatct
‑3’
；
[0011]
其中，n为a、t、g、c四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，60代表随机碱基的数量。
[0012]
通过磁珠
‑
selex技术筛选，得到代表性序列a5：核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0013]
然后以截短和突变的方式对适配体a5进行优化，提供结合能力相当或者更优，但是长度更短的四条btx
‑
a适配体，分别被命名为适配体a5
‑
s1、适配体a5
‑
s2、适配体a5
‑
s3和适配体a5
‑
s3g，核苷酸序列分别如seq id no.2
‑
seq id no.5所示。这4条适配体和btx
‑
a的亲和力均有所提高，其中，适配体a5
‑
s3g与btx
‑
a之间的亲和力出现了明显提高，达到了72nm。进一步的，所述的适配体a5
‑
s3g，还可以在其3’端或5’端进行生物素、fitc和巯基等化学修饰。
[0014]
本发明的第一方面，提供一组与短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)特异性结合的适配体，其核苷酸序列分别如seq id no.1
‑
seq id no.5(表1)所示。
[0015]
表1核酸适配体序列
[0016][0017]
进一步的，所述的适配体，在其3’端或5’端进行生物素、荧光分子、同位素、电化学、酶或巯基等化学修饰。
[0018]
本发明的第二方面，提供如上所述的与短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)特异性结合的适配体在制备短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)捕获、分离、富集和纯化试剂中的应用。
[0019]
本发明的第三方面，提供如上所述的与短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)特异性结合的适配体在制备短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。
[0020]
本发明的第四方面，提供如上所述的与短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)特异性结合的适配体在水体或水产品中短裸甲藻毒素
‑
a的快速检测中的应用。防止人们主要因饮用被污染的水和误食被污染的水产品而中毒。
[0021]
本发明的第五方面，提供如上所述的与短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)特异性结合的适配体在制备水体或水产品中短裸甲藻毒素
‑
a快速检测试剂盒中的应用。
[0022]
本发明的第六方面，提供一种短裸甲藻毒素
‑
a快速检测试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒中包含如上所述的与短裸甲藻毒素
‑
a(btx
‑
a)特异性结合的适配体。
[0023]
本发明的有益效果在于：
[0024]
1、本发明提供了一种与短裸甲藻毒素
‑
a特异性结合的适配体及其应用，通过实验验证，本发明的适配体能够快速特异性地与短裸甲藻毒素
‑
a结合，其中适配体a5
‑
s3g与btx
‑
a之间的亲和力最高，达到了72nm。因此，本发明筛选得到的适配体可以制备适配体传感器或检测试剂，并将其应用于饮用水、海水体样品以及水产品中btx
‑
a的检测。另外，这些适配体还可以为水体或水产品中btx
‑
a的去除奠定基础。
[0025]
2、此外，本发明根据btx
‑
a分子的特点，设计了磁珠
‑
selex，通过正向筛选和反向筛选，获得了能够与短裸甲藻毒素
‑
a以很高的亲和力特异性结合的单链dna适配体，具有操作简便、生产成本低、纯化周期短的特点。适配体作为一种新型分子识别探针，具有成本低廉、性质稳定和方便修饰等优点，适宜在生物医药工业化生产中大规模应用。
附图说明
[0026]
图1是筛选过程中每一轮的单链dna回收率结果图；
[0027]
图2是截短后适配体a5的二级结构预测图，其中a为a5、b为a5
‑
s1、c为a5
‑
s2、d为a5
‑
s3、e为a5
‑
s3g；
[0028]
图3是优化改造后序列的亲和力与特异性分析；
[0029]
图4是适配体传感器的特异性分析。
具体实施方式
[0030]
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0031]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室指南(new york：cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0032]
实施例1：随机ssdna文库及其引物的设计
[0033]
1.ssdna文库的设计
[0034]
btx
‑
a适配体文库由96个碱基组成，两端分别为含有18个碱基的固定区域，中间则为含有60个碱基的随机区域：5
’‑
ataccagcttattcaatt
‑
n
60
‑
agatagtaagtgcaatct
‑3’
(seq id no.6，其中n为a、t、g、c四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一种，27代表随机碱基的数量)。
[0035]
2.引物的设计
[0036]
上游引物：5
’‑
ataccagcttattcaatt
‑3’
(seq id no.7)
[0037]
下游引物a：5
’‑
agattgcacttactatct
‑3’
(seq id no.8)
[0038]
下游引物b：5
’‑
poly(da20)
‑
spacer18
‑
agattgcacttactatct
‑3’
(seq id no.9)。
[0039]
其中，下游引物a主要用于筛选中ssdna的扩增，下游引物b主要用于克隆测序。
[0040]
实施例2：btx
‑
a适配体的筛选
[0041]
根据btx
‑
a分子的特点，采用适配体筛选的经典方法——磁珠法来进行筛选，筛选流程主要包括四个步骤，即孵育、分离、洗脱和扩增，具体过程如下：
[0042]
(1)孵育：取5nmol的ssdna文库，用筛选缓冲液定容至50μl后混合均匀，用封口膜封好口，95℃水浴加热10min，冰浴猝冷5min，室温放置5min后转入1.5ml的ep管中，加入5μl btx
‑
a偶联磁珠，筛选缓冲液定容至300μl，室温旋转孵育2h。
[0043]
(2)分离：旋转孵育后，利用磁力架实现溶液中的ssdna和结合在磁珠上的ssdna的分离。加入500μl筛选缓冲液重悬，冲洗4
‑
5次，至冲洗液中不再检测出ssdna，磁力架再吸附冲洗一次。
[0044]
(3)洗脱：洗涤结束后，加入100μl筛选缓冲液在95℃漩涡振荡，20min，在磁力架上吸附4
‑
5min，取上清液，约为100μl，得到文库b，定量计算回收率，
‑
20℃保存。
[0045]
(4)扩增：以文库b作为pcr模板对其进行扩增。pcr反应体系(50μl)为：模板2.5μl；hot start premix(2
×
)25μl；上游引物(10μm)2.5μl；下游引物(10μm)2.5μl；无酶水17.5μl。pcr反应条件为：95℃，5分钟；95℃，30s；56℃，30s；72℃，30s；72℃，5分钟，共22个循环。每次pcr扩增时均设置空白对照。
[0046]
为了提高筛选的效率，从第7轮开始进行反向筛选。与正向筛选的不同之处在于：在用btx
‑
a磁珠与ssdna文库进行孵育以前，先将ssdna文库与阴性磁珠在室温下旋转孵育，孵育结束以后，用磁力架分离溶液中的ssdna和结合在空白磁珠上的ssdna，回收得到的溶
液中的ssdna即为正向筛选的ssdna文库。13轮开始引入btx
‑
b进行反向筛选，增强筛选压力。
[0047]
经上述pcr扩增得到的dna是dsdna，而适配体则是ssdna。为了获得ssdna次级文库，特意设计了含有20个鸟嘌呤的下游引物b，使pcr后的两条链相差20个碱基，然后通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对两条链进行分离，再对目标链进行切胶回收。
[0048]
将回收的凝胶离心破碎后，加入相同体积的煮胶缓冲液，并在50℃水浴锅中孵育20分钟(重复2次)。孵育结束后，对样品进行离心(12000rpm，5分钟)，收集上清。采用凝胶提取试剂盒对回收得到的ssdna进行纯化。纯化完成后，用核酸定量荧光计2.0对ssdna进行定量分析，至此，次级文库制备完毕。
[0049]
如图1所示，当筛选到第18轮的时候，ssdna的回收率不再上升，预示达到了筛选终点。于是，利用上游引物和下游引物a对第12轮洗脱下来的ssdna进行pcr扩增，并用核酸回收试剂盒对经聚丙烯酰胺凝胶电泳回收的dsdna进行纯化以后，委托上海生工生物工程股份有限公司进行克隆测序，总共测得了60条序列。在用clustal x 2.1软件对所有序列进行比对分析以后，从中挑选了具有代表性的序列进行亲和力测定及优化。
[0050]
实施例3：适配体a5的优化
[0051]
在选取的适配体中，适配体a5与btx
‑
a之间亲和力常数(k
d
)值最小，为2.56μm。为了得到适配体a5的核心结构，对该适配体进行了截短及突变优化。图2显示了在线工具the mfold web server对适配体a5截短及突变产物的二级结构预测图。
[0052]
当适配体a5两端的固定区域被去除以后(a5
‑
s1)，适配体依然能够与btx
‑
a结合，而且亲和力有一定上升。因此，可以推断：适配体a5两端的引物结合区域不仅不参与其与btx
‑
a之间的相互作用，而且有可能对核心结构与btx
‑
a的结合产生阻碍。然后对其5’端茎环进行了截短，并获得了适配体a5
‑
s2，进一步截短获得适配体a5
‑
s3，适配体亲和力进一步上升。对a5
‑
s3进行了部分位点碱基突变，其中29位t突变为g后，亲和力显著提升。推测a5
‑
s3g有可能形成g四联体结构，进一步增强了相互作用的稳定性。
[0053]
本实施例中，a5及其优化后的序列信息和亲和力信息值如表2所示：
[0054]
表2a5及其优化后的序列信息和亲和力值
[0055][0056]
实施例4：适配体传感器的制备和应用
[0057]
生物膜干涉技术是一种免标记的技术，可以提供实时、高通量的生物分子相互作用信息。生物膜干涉技术的基本原理是仪器发射白光到传感器表面，同时收集光学膜层两
个表面的反射光。因为不同频率的反射光受到光学膜层厚度和质量密度的影响有差异，一些频率的反射光形成了相长干涉(蓝色)，另一些则形成了相消干涉(红色)。光谱仪检测到这些干涉光以后形成了一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相位位移强度(δλ)显示。因此，当结合到传感器表面的分子有数量上发生变化的时候，这种干涉光谱的位移就会被光谱仪检测到。而这种位移能够直接的反映出传感器表面生物膜厚度和质量密度的变化，从而对待测分子间的相互作用过程进行精确的定量测定。作为一种新型的免标记技术，生物膜干涉技术已经在生物分子间的相互作用研究中占据着重要地位。
[0058]
将核酸适配体的5’端用生物素进行修饰，通过生物素和链霉亲合素相互作用将适配体固定在超级链霉亲和素(ssa)传感器表面。固定前，首先要对适配体进行变复性处理(95℃水浴10分钟，冰浴骤冷5分钟，室温放置10分钟)，以帮助适配体重新折叠成稳定的空间结构。在用生物膜干涉仪octetred96进行检测前，依次将缓冲液、生物素标记的适配体溶液、缓冲液以及btx
‑
a溶液加入96孔板的不同列中，加样体积为200μl。octet red 96系统的程序设定为：(1)传感器平衡(1分钟)；(2)偶联(3分钟)；(3)传感器再平衡(1分钟)；(4)btx
‑
a结合(4分钟)；(5)btx
‑
a解离(4分钟)。所有的步骤都是在室温下完成的。检测完成后，利用octet数据分析软件cfr part 11version 6.x将实验组传感器的响应值中扣除对照组传感器的响应值，得到校正后的实际响应值。另外，采用1:1的结合模式对响应数据进行拟合，得到适配体与btx
‑
a的结合
‑
解离曲线以及各种动力学参数，包括结合速率常数k
on
、解离速率常数k
dis
和亲和常数k
d
值。
[0059]
首先对适配体传感器的性能参数进行测定。分别测定了适配体传感器与不同浓度的btx
‑
a(100～4000ng/ml)相互作用的响应值，结果表明，随着btx
‑
a浓度的增大，bli适配体传感器的响应值而持续升高，在250s时传感器的响应值达到平台，记录此时的响应值，通过拟合得到相应的曲线，sigmoidal logistic五参数等式为：
[0060]
y＝(1.137
–
0.0203)/[(1+(x/1134)^0.00055)]^0.933+0.0203
[0061]
相关系数r2为0.995。此外，在btx
‑
a浓度为100～2000nm范围内，适配体传感器显示出好的线性检测关系(图3)，适配体传感器的检测限(lod)为4.5nm(4ng/ml)。
[0062]
利用上述方法，对btx
‑
a、btx
‑
a、oa、ptx、stx、gtx等毒素与适配体传感器的交叉反应性进行测试，结果如图4所示，btx
‑
a引起的传感器的响应值为0.39，显著高于其他毒素产生的响应值。
[0063]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。
[0064]
[0065]
[0066]