阳离子脂质化合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及脂质生物载体材料领域，具体涉及一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前mrna疫苗被广泛应用于疾病的预防和治疗。这是由于mrna独特的优点：1)进入细胞内后无需整合到宿主基因组可被快速翻译并表达目的蛋白；2)易于生产，不会造成二次污染；3)可应用于多种疾病模型，在体内可降解，安全风险低等。然而，mrna属于单链核酸结构，易被降解，在体内难以直接递送，这些都严重阻碍了mrna疫苗的发展。脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle，lnp)技术，通过其所包含的带正电阳离子脂质与mrna带负电的磷酸根基团结合，可用于递送mrna，大大促进了mrna疫苗的发展和临床应用。在lnp系统中，阳离子脂质化合物发挥着最重要的作用，它的结构和功能决定了整个载体的包封和递送效率，同时还影响着lnp/mrna系统的内涵体逃逸效率和器官靶向性能，从而决定mrna疫苗的预防或治疗效益。
3.不同结构的阳离子脂质具有不同的功能和性质，其与mrna的结合能力，体内的命运皆各不相同。目前，阳离子脂质分子多以柔性头部为连接基。专利cn200580022380.8和cn201110444269.5报道了以柔性的叔胺季胺盐作为阳离子头部，并通过醚键与疏水烷烃链相连的阳离子脂质分子，专利cn201180063713.7公开了以乙二胺作为阳离子头部，并以酯键与长链脂肪醇相连的阳离子脂质分子。专利cn201811304842.0和cn201510228170.x则公开了以二肽作为亲水的阳离子头部，通过酯键与长链脂肪醇相连的阳离子脂质分子。期刊(angewandet chemie，2012，124，8657-8661。)报道了一种以三级胺为头部，通过二缩醛与疏水链相连的脂质分子。期刊(naturebiotechnology，2019，37，174
–
1185。)报道了长链二级酮，c-异腈和胺类化合物通过三组分反应所得到的以咪唑为头部，长链烷烃为疏水段的脂质分子。
4.目前柔性lnp不能很好地实现内涵体逃逸，进入细胞后易被内含体降解，对于mrna的递送效率有待提升。因此，通过开发新型的脂质分子来打破内涵体逃逸瓶颈，从而提高mrna疫苗的转染效率具有重要意义。


技术实现要素：

5.基于此，本发明提供了一类新的阳离子脂质化合物，该类化合物可以作为阳离子脂质体的重要组成成分，所得到的脂质体结构稳定，不易分解。同时可以进一步制备成阳离子脂质体/mrna复合物，该复合物内涵体逃逸效率高，淋巴结和肿瘤部位靶向能力强，能够有效提高mrna的递送和转染效率。包括如下技术方案：
6.具有式(1)所示结构的阳离子脂质化合物：
[0007][0008]
其中：
[0009]
环a选自c6～c
10
芳基；
[0010]
r1、r2分别独立地选自：h，c1～c8烷基，c3～c8环烷基，或者r1、r2和与其相连的氮原子一起形成3～8元杂环基；所述3～8元杂环基可以独立任选地被一个或多个r5取代；
[0011]
r3选自：c1～c6亚烷基；
[0012]
各r4分别独立地选自：c8～c
30
烷基，c8～c
30
不饱和链烃基；所述r4中的c8～c
30
烷基和c8～c
30
不饱和链烃基可以分别独立任选地被一个或多个r6取代；
[0013]
r5选自：h，c1～c6烷基；
[0014]
r6选自：h，卤素，c1～c6烷基，c1～c6烷氧基，c3～c6环烷基，c6～c
10
芳基，5-10元杂芳基；
[0015]
x选自：-co
2-，-conh-，-nhco-，-so2nh-；
[0016]
n选自：2、3、4。
[0017]
优选地，n为2，环a选自如下结构：
[0018][0019]
优选地，所述阳离子脂质化合物具有式(ii)所示结构：
[0020][0021]
其中，z为o或者nh。
[0022]
本发明还提供了上述的具有式(ii)所示结构的阳离子脂质化合物的制备方法。包括如下技术方案：
[0023]
一种上述的具有式(ii)所示结构的阳离子脂质化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0024]
步骤1：在缩合剂和催化剂的作用下，均三苯甲酸与式(iii)所示的胺类化合物反应，得到式(iv)所示的中间体化合物；
[0025]
步骤2：在缩合剂和催化剂的作用下，式(iv)所示的中间体化合物与r4nh2或者r4oh反应，即得具有式(ii)所示结构的阳离子脂质化合物；
[0026]
其反应式如下：
[0027][0028]
其中，z为o或者nh；r1、r2、r3和r4如前所述。
[0029]
本发明还提供了一种阳离子脂质体。该阳离子脂质体结构稳定，不易分解，可以将其制备成阳离子脂质体/mrna复合物，所得复合物的内涵体逃逸效率高，淋巴结和肿瘤部位靶向能力强，能够有效提高mrna的递送和转染效率。包括如下技术方案：
[0030]
一种阳离子脂质体，由上述阳离子脂质化合物和非阳离子辅助脂质制备而成；所述非阳离子辅助脂质选自：胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)，棕榈酰油酰磷脂酰甘油(popg)，棕榈酰油酰磷脂胆碱(popc)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)，二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)，氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)，蛋黄卵磷脂(epc)，神经鞘磷脂(sph)，二棕榈酰磷脂酰胆碱((dppc))，二芥酰磷脂酰胆碱(depc)，二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)，二硬脂酰磷脂酰甘油(dspg)，蛋黄磷脂酰甘油(epg)和二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)中的一种或多种。
[0031]
本发明还提供了上述的阳离子脂质体的制备方法。包括如下技术方案：
[0032]
一种上述的阳离子脂质体的制备方法，包括如下步骤：
[0033]
将所述阳离子脂质化合物和非阳离子辅助脂质溶于有机溶剂中，除去有机溶剂后加入ph缓冲液，然后用超声波处理，再于0℃～4℃水化，即得。
[0034]
一种上述的阳离子脂质体的制备方法，包括如下步骤：将所述阳离子脂质化合物和非阳离子辅助脂质溶于有机溶剂中，除去有机溶剂后加入ph缓冲液，然后用超声波处理，再于0℃～4℃水化，然后用脂质体挤出器制备得到所述阳离子脂质体。
[0035]
本发明还提供了上述的阳离子脂质化合物以及阳离子脂质体的应用。包括如下技
术方案：
[0036]
上述的阳离子脂质化合物在制备用于递送mrna的载体中的应用。
[0037]
上述的阳离子脂质体作为载体在递送mrna中的应用。
[0038]
本发明还提供了一种mrna疫苗，该mrna疫苗的内涵体逃逸效率高，淋巴结和肿瘤部位靶向能力强，能够有效提高mrna的递送和转染效率。包括如下技术方案：
[0039]
一种mrna疫苗，由mrna和用于递送所述mrna的载体制备而成，所述用于递送所述mrna的载体包括上述的阳离子脂质体。
[0040]
本发明还提供了一种阳离子脂质体/mrna复合物。该复合物的内涵体逃逸效率高，淋巴结和肿瘤部位靶向能力强，能够有效提高mrna的递送和转染效率。包括如下技术方案：
[0041]
一种阳离子脂质体/mrna复合物，由上述的阳离子脂质体和mrna制备而成。
[0042]
本发明还提供了一种上述的阳离子脂质体/mrna复合物的制备方法。包括如下技术方案：
[0043]
一种上述的阳离子脂质体/mrna复合物的制备方法，包括如下步骤：将所述阳离子脂质体与所述mrna混合，孵育20～30分钟，即得。
[0044]
一种上述的阳离子脂质体/mrna复合物的制备方法，包括如下步骤：将所述阳离子脂质体与所述mrna混合，孵育20～30分钟，然后用脂质体挤出器制备得到所述阳离子脂质体/mrna复合物。
[0045]
本发明的阳离子脂质化合物以可电离成带正电的胺基基团作为亲水头部，刚性芳环基团作为连接子，由疏水的饱和或者不饱和长链烃基作为疏水尾部，各基团相互配合，使所得阳离子脂质化合物具有良好的组装性能，可用于构筑结构稳定的阳离子脂质体，并且进一步形成阳离子脂质体/mrna复合物。该阳离子脂质体/mrna复合物可以高效地促进未做任何化学修饰的或者保护的mrna实现内涵体逃逸，细胞转染，淋巴结富集，从而最终实现mrna在目标细胞的高效翻译。
[0046]
均苯三甲酸是一种刚性分子，具有很好的水溶性和可修饰性，本技术优选均苯三甲酸作为母核构建本技术的阳离子脂质化合物。发明人在研究过程中发现，如果以均苯三甲酸作为母核，构建三个完全相同的阳离子脂质基团，所得脂质分子具有高度对称性，不利于脂质体形成锥形结构，会限制脂质体的组装性能。因而，本发明优选地阳离子脂质化合物以均苯三甲酸作为刚性分子，修饰了可电离成带正电的胺基基团作为亲水头部，由两条疏水的饱和或者不饱和长链烃基作为疏水尾部，该含有刚性头部的阳离子脂质分子有利于形成一个较小的阳离子头部和一个较大的二条疏水链尾部，插入内涵体膜后可以形成一个锥形结构，从而促进膜向六方晶相转变，从而实现内涵体逃逸，使阳离子脂质体/mrna复合物的内涵体逃逸效率高，淋巴结和肿瘤部位靶向能力强，能够有效提高mrna的递送和转染效率，递送和转染效率高，解决了mrna内涵体逃逸效率低下，淋巴结靶向能力弱点等难题。
[0047]
另外，本发明的阳离子脂质化合物具有细胞和体内毒性低，生物兼容性高，适合多次给药等优点，在mrna疫苗方面的具有重要应用前景。
附图说明
[0048]
图1是阳离子脂质体的粒径；
[0049]
图2是阳离子脂质体的表面电势；
[0050]
图3是阳离子脂质体的分布情况；
[0051]
图4是本发明的不同n/p比的阳离子脂质体/mrna复合物对mcf-7细胞存活率的影响；
[0052]
图5是凝胶电泳阻滞实验，检测阳离子脂质体作为载体与mrna结合的情况；
[0053]
图6是本发明的不同n/p比的阳离子脂质体的体外(细胞)mrna的转染情况；
[0054]
图7是通过皮下注射阳离子脂质体/mrna二元复合物后，小鼠原位淋巴结的荧光素的生物发光情况；
[0055]
图8是不同刚柔性的脂质体药物囊泡发生内涵体逃逸的概率和内涵体逃逸释放的量；
[0056]
图9是通过静脉注射阳离子脂质体/mrna二元复合物后，小鼠不同脏器和肿瘤的荧光强度分布情况。
具体实施方式
[0057]
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
[0058]
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
[0059]
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
[0060]
本发明提供了一种具有式(1)所示结构的阳离子脂质化合物：
[0061][0062]
其中：
[0063]
环a选自c6～c
10
芳基；
[0064]
r1、r2分别独立地选自：h，c1～c8烷基，c3～c8环烷基，或者r1、r2和与其相连的氮原子一起形成3～8元杂环基；所述3～8元杂环基可以独立任选地被一个或多个r5取代；
[0065]
r3选自：c1～c6亚烷基；
[0066]
各r4分别独立地选自：c8～c
30
烷基，c8～c
30
不饱和链烃基；所述r4中的c8～c
30
烷基和c8～c
30
不饱和链烃基可以分别独立任选地被一个或多个r6取代；
[0067]
r5选自：h，c1～c6烷基；
[0068]
r6选自：h，卤素，c1～c6烷基，c1～c6烷氧基，c3～c6环烷基，c6～c
10
芳基，5-10元杂
芳基；
[0069]
x选自：-co
2-，-conh-，-nhco-，-so2nh-；
[0070]
n选自：2、3、4。
[0071]
本发明所述化合物中，当任何变量(例如r4、r5等)在任何组分中出现超过一次，则其每次出现的定义独立于其它每次出现的定义。同样，允许取代基及变量的组合，只要这种组合使化合物稳定。自取代基划入环系统的线表示所指的键可连接到任何能取代的环原子上。如果环系统为多环，其意味着这种键仅连接到邻近环的任何适当的碳原子上。要理解本领域普通技术人员可选择本发明化合物的取代基及取代型式而提供化学上稳定的并可通过本领域技术和下列提出的方法自可容易获得的原料容易的合成的化合物。如果取代基自身被超过一个基团取代，应理解这些基团可在相同碳原子上或不同碳原子上，只要使结构稳定。
[0072]
术语“烷基”意指包括具有特定碳原子数目的支链的和直链的饱和脂肪烃基。例如：“c
1-c6烷基”中“c
1-c
6”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。例如：“c
1-c6烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基。
[0073]
术语“亚烷基”是指在“烷基”基础上少一个氢的基团，例如，-ch
2-、-ch2ch
2-、-ch2ch2ch
2-、-ch2ch2ch2ch
2-等。
[0074]
术语“不饱和链烃基”指具有特定碳原子数目的支链的和直链的不饱和脂肪烃基，即非环状的链状烃基，并且碳链中含有1个或者多个碳碳双键，或者含有碳碳三键，如：
[0075]-(ch2)8(ch＝ch)(ch2)5ch3，-(ch2)8(ch＝ch)(ch2)7ch3，-(ch2)8(ch＝ch)(ch2)9ch3，
[0076]-(ch2)8(ch＝ch)ch2(ch＝ch)(ch2)2ch3，-(ch2)8(ch＝ch)ch2(ch＝ch)(ch2)4ch3，
[0077]-(ch2)8(ch＝ch)ch2(ch＝ch)(ch2)6ch3等。
[0078]
术语“环烷基”指具有特定碳原子数目的单环饱和脂肪烃基。例如“c3～c8环烷基”包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基。
[0079]
术语“烷氧基”指烷基与氧直接连接的基团，即具有-o-烷基结构的基团，如-och3、-och2ch3、-och2ch2ch3、-och2ch(ch3)2、-och2ch2ch2ch3、-o-ch(ch3)2等。
[0080]
术语“杂环基”是指含有1个或多个选自o、n和s的杂原子的非芳香性杂环基团，例如：哌啶基，四氢吡咯基、吗啉基、哌嗪基等。杂环取代基的连接可以通过碳原子或通过杂原子实现。
[0081]
术语“杂芳基”指含有1个或多个选自o、n或s的杂原子的芳香环，本发明范围内的杂芳基包括但不限于：喹啉基、吡唑基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三氮唑基、咪唑基、恶唑基、异恶唑基、哒嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并恶唑、吲哚基等；“杂芳基”也理解为包括任何含有氮的杂芳基的n-氧化物衍生物。
[0082]
术语“取代的”是指用指定取代基的基团置换特定结构中的氢基。
[0083]
正如本领域技术人员所理解的，本文中所用“卤素”(“halo”)或“卤”意指氯、氟、溴和碘。
[0084]
在其中一些实施例中，本发明式(i)化合物中的n优选为2，环a进一步优选自如下结构：
[0085][0086]
在其中一些实施例中，本发明所述阳离子脂质化合物具有式(ii)所示结构：
[0087][0088]
其中，z为o或者nh。
[0089]
在其中一些实施例中，r1、r2分别独立选自：c1～c6烷基，或者r1、r2和与其相连的氮原子一起形成3～6元杂环基或者c1～c6烷基取代的3～6元杂环基。
[0090]
在其中一些实施例中，r1、r2分别独立选自：c1～c4烷基，或者r1、r2和与其相连的氮原子一起形成5～6元杂环基或者c1～c4烷基取代的5～6元杂环基。
[0091]
在其中一些实施例中，r1、r2分别独立选自：c1～c3烷基，或者r1、r2和与其相连的氮原子一起形成5～6元杂环基或者c1～c3烷基取代的5～6元杂环基。
[0092]
在其中一些实施例中，r1和r2分别独立选自：甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，异丁基，环丁基，戊基，环戊基，己基，环己基；或者r1、r2和与其相连的氮原子一起形成如下基团：哌啶基，四氢吡咯基、吗啉基、哌嗪基、4-甲基哌嗪基。
[0093]
在其中一些实施例中，r3选自：c1～c5亚烷基。
[0094]
在其中一些实施例中，r3选自：c1～c4亚烷基。
[0095]
在其中一些实施例中，r3选自：亚甲基，亚乙基，亚丙基，亚丁基。
[0096]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：c
10
～c
30
烷基，c
10
～c
30
不饱和链烃基。
[0097]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：c
10
～c
28
烷基，c
10
～c
28
不饱和链烃基。
[0098]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：c
10
～c
26
烷基，c
10
～c
26
不饱和链烃基。
[0099]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：c
10
～c
24
烷基，c
10
～c
24
不饱和链烃基。
[0100]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：c
10
～c
22
烷基，c
10
～c
22
不饱和链烃基。
[0101]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：c
10
～c
20
烷基，c
10
～c
20
不饱和链烃基。
[0102]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：c
12
～c
20
烷基，c
12
～c
20
不饱和链烃基。
[0103]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：c
14
～c
20
烷基，c
14
～c
20
不饱和链烃基。
[0104]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：c
14
～c
20
烷基，含有一个或两个碳碳双
键的c
14
～c
20
不饱和链烃基。
[0105]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：辛烷基，壬烷基，葵烷基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基，十五烷基，十六烷基，十七烷基，十八烷基，十九烷基，二十烷基，十一碳烯基，十二碳烯基，十三碳烯基，十四碳烯基，十五碳烯基，十六碳烯基，十七碳烯基，十八碳烯基，十九碳烯基，二十碳烯基，十一碳二烯基，十二碳二烯基，十三碳二烯基，十四碳二烯基，十五碳二烯基，十六碳二烯基，十七碳二烯基，十八碳二烯基，十九碳二烯基，二十碳二烯基。
[0106]
在其中一些实施例中，各r4分别独立地选自：-(ch2)7ch3，-(ch2)9ch3，-(ch2)
11
ch3，-(ch2)
13
ch3，-(ch2)
15
ch3，-(ch2)
17
ch3，-(ch2)
19
ch3，-(ch2)4(ch＝ch)(ch2)7ch3，-(ch2)8(ch＝ch)(ch2)5ch3，-(ch2)8(ch＝ch)(ch2)7ch3，-(ch2)8(ch＝ch)(ch2)9ch3，-(ch2)8(ch＝ch)ch2(ch＝ch)(ch2)2ch3，-(ch2)8(ch＝ch)ch2(ch＝ch)(ch2)4ch3，-(ch2)8(ch＝ch)ch2(ch＝ch)(ch2)6ch3。
[0107]
在其中一些实施例中，本发明所述阳离子脂质化合物具体优选自如下化合物：
[0108][0109]
本发明提供的上述阳离子脂质化合物可以通过本领域常规的制备方法制备得到。除在文献中已知的或在实验程序中例证的标准方法外，可采用如下合成方案中的方法制备本发明化合物。结合下述的合成方案，能够对本发明中所述的化合物以及合成方法进行更好的理解。所述的合成方案描述了可以用于制备本发明中所述的化合物的方法，所述的方法仅仅是为说明目的的说明性方案描述，并不构成对本发明所具有的范围的限制。
[0110]
在其中一个实施方案中，本发明提供了一种具有式(ii)所示结构的阳离子脂质化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0111]
步骤1：在缩合剂和催化剂的作用下，均三苯甲酸与式(iii)所示的胺类化合物反应，得到式(iv)所示的中间体化合物；
[0112]
步骤2：在缩合剂和催化剂的作用下，式(iv)所示的中间体化合物与r4nh2或者r4oh
反应，即得所述具有式(ii)所示结构的阳离子脂质化合物；
[0113]
其反应式如下：
[0114][0115]
其中，z为o或者nh；
[0116]
r1、r2分别独立地选自：h，c1～c8烷基，c3～c8环烷基，或者r1、r2和与其相连的氮原子一起形成3～8元杂环基；所述3～8元杂环基可以独立任选地被一个或多个r5取代；
[0117]
r3选自：c1～c6亚烷基；
[0118]
各r4分别独立地选自：c8～c
30
烷基，c8～c
30
不饱和链烃基；所述r4中的c8～c
30
烷基和c8～c
30
不饱和链烃基可以分别独立任选地被一个或多个r6取代；
[0119]
r5选自：h，c1～c6烷基；
[0120]
r6选自：h，卤素，c1～c6烷基，c1～c6烷氧基，c3～c6环烷基，c6～c
10
芳基，5-10元杂芳基。
[0121]
在其中一些实施例中，所述缩合剂选自：二异丙基碳二亚胺(dic)，二环己基碳二亚胺(dcc)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)中的一种或多种。缩合剂进一步优选为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，以edc为缩合剂可以获得更好的反应效果和收率。
[0122]
在其中一些实施例中，所述催化剂选自：三乙胺，吡啶和n，n-二甲基吡啶(dmap)中的一种或多种。催化剂进一步优选为n，n-二甲基吡啶，在dmap的催化下，反应收率更高。
[0123]
在其中一些实施例中，所述反应的溶剂选自：n，n-二甲基甲酰胺，n，n-二甲基乙酰胺，二甲基亚砜和n-甲基吡咯烷酮中的一种或多种。反应溶剂进一步优选为n，n-二甲基甲酰胺。
[0124]
在其中一些实施例中，步骤1中所述均三苯甲酸、式(iii)所示的胺类化合物、缩合剂和催化剂的摩尔比为1：(0.75～1.2)：(1～3)：(0.08～0.25)，更优选为1：1：1.5：0.1。
[0125]
在其中一些实施例中，步骤1中所述反应的时间为6h～24h，所述反应的温度为20℃～120℃；反应时间更优选为10h～14h，反应温度更优选为45℃-55℃；反应时间更优选为12h，反应温度更优选为50℃。
[0126]
在其中一些实施例中，步骤2中所述式(iv)所示的中间体化合物、r4nh2或者r4oh、缩合剂和催化剂的摩尔比为1：1.5～4：2～6：0.1～0.25，优选为1：2：3：0.2。
[0127]
在其中一些实施例中，步骤2中所述反应的时间为6h～24h，所述反应的温度为60℃～120℃；反应时间优选为10h-14h，反应温度优选为75℃-85℃；反应时间优选为12h，反应温度优选为80℃。
[0128]
在本发明的一个实施方案中，还提供了一种阳离子脂质体，由本发明的阳离子脂质化合物和非阳离子辅助脂质制备而成；所述非阳离子辅助脂质选自：胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)，二油酰磷脂酰胆碱(dopc)，棕榈酰油酰磷脂酰甘油(popg)，棕榈酰油酰磷脂胆碱(popc)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)，二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)，氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)，蛋黄卵磷脂(epc)，神经鞘磷脂(sph)，二棕榈酰磷脂酰胆碱((dppc))，二芥酰磷脂酰胆碱(depc)，二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)，二硬脂酰磷脂酰甘油(dspg)，蛋黄磷脂酰甘油(epg)和二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)中的一种或多种。
[0129]
在其中一些实施例中，所述阳离子脂质化合物和非阳离子辅助脂质的摩尔比优选为0.5～3:1，进一步优选为0.8～1.5:1，进一步优选为1:1。非阳离子辅助脂质的添加有利于提高该阳离子脂质体的稳定性，但是能够同rna结合的是阳离子脂质化合物，非离子脂质的比例过高会降低该阳离子脂质体与rna的结合效果。本发明经过反复实验发现当所述阳离子脂质化合物和非阳离子辅助脂质的摩尔比优选为0.5～3:1范围时，既能获得很好的稳定性，同时与rna有很好的结合效果，并且得出了阳离子脂质化合物和非阳离子辅助脂质的最佳摩尔比为1：1。
[0130]
在其中一些实施例中，所述阳离子脂质体由上述阳离子脂质化合物、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)制备而成；或者所述阳离子脂质体由上述阳离子脂质化合物、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)制备而成。优选地，所述阳离子脂质化合物、胆固醇，二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)的摩尔比为45～60：37.5～39.5：0～15:0.5～2.5，进一步优选为48～55：38.5～39.5：8～12:0.8～1.5，进一步优选为50：39：10:1。以该优选配比的阳离子脂质化合物、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)制备而成的阳离子脂质体具有较好的稳定性，并且与mrna有很好的结合效果。
[0131]
在本发明的一个实施方案中，还提供了本发明的阳离子脂质体的制备方法，包括如下步骤：
[0132]
将所述阳离子脂质化合物和非阳离子辅助脂质溶于有机溶剂中，除去有机溶剂后加入ph缓冲液，然后用超声波处理，再于0℃～4℃水化，即得。
[0133]
在本发明的另一实施方案中，提供的阳离子脂质体的制备方法包括如下步骤：将所述阳离子脂质化合物和非阳离子辅助脂质溶于有机溶剂中，除去有机溶剂后加入ph缓冲液，然后用超声波处理，再于0℃～4℃水化，然后用脂质体挤出器制备得到所述阳离子脂质体。
[0134]
在其中一些实施例中，所述有机溶剂优选为易挥发性有机溶剂，所述易挥发性有机溶剂优选为氯仿，乙醇和二氯甲烷中的一种或多种。
[0135]
在其中一些实施例中，所述ph缓冲液为pbs或者hepes缓冲液。
[0136]
在其中一些实施例中，所述用超声波处理的条件包括：超声频率为15khz～35khz，
超声时间为1min～5min。
[0137]
在其中一些实施例中，所述水化的时间为8h～18h。
[0138]
在其中一些实施例中，所述脂质体挤出器为avanti mini-extruder脂质体挤出器，其工艺条件包括：采用0.2μm膜(whatman pc m8 19mm 0.2μm)挤出m次，7≤m≤13，并且m为奇数；更优选为m为11。
[0139]
在本发明的一个实施方案中，还提供了本发明所述的阳离子脂质化合物在制备用于递送mrna的载体中的应用。本发明的阳离子脂质化合物可以与非阳离子辅助脂质制备成阳离子脂质体，该阳离子脂质体可以作为载体用于递送mrna。其中，所述mrna可以为与病毒感染或存活相关的mrna，与代谢疾病(例如：肝疾病)相关的mrna，与肿瘤发生或细胞转化相关的mrna，免疫调节mrna，与炎症或自身免疫相关的mrna等。
[0140]
在本发明的一个实施方案中，还提供了一种mrna疫苗，由mrna和用于递送所述mrna的载体制备而成，所述用于递送所述mrna的载体包括本发明所述的阳离子脂质体。本发明的阳离子脂质体可以单独作为载体，或者与其它能够递送mrna的载体、或其它疫苗中可接受的辅料联合，与mrna制备成能够用于预防某些疾病(例如：病毒感染、代谢疾病、肿瘤、炎症或自身免疫疾病等)的mrna疫苗。其中，所述mrna可以为与病毒感染或存活相关的mrna，与代谢疾病(例如：肝疾病)相关的mrna，与肿瘤发生或细胞转化相关的mrna，免疫调节mrna，与炎症或自身免疫相关的mrna等。
[0141]
在本发明的一个实施方案中，还提供了一种阳离子脂质体/mrna复合物，由本发明的阳离子脂质体和mrna制备而成。该复合物可以单独作为一种预防某些疾病(例如：病毒感染、代谢疾病、肿瘤、炎症或自身免疫疾病等)的mrna疫苗；或者该复合物与其它疫苗中可接受的辅料一起制备成一种预防某些疾病(例如：病毒感染、代谢疾病、肿瘤、炎症或自身免疫疾病等)的mrna疫苗。其中，所述mrna可以为与病毒感染或存活相关的mrna，与代谢疾病(例如：肝疾病)相关的mrna，与肿瘤发生或细胞转化相关的mrna，免疫调节mrna，与炎症或自身免疫相关的mrna等。
[0142]
优选地，所述阳离子脂质体和mrna的n/p比为1：1～7:1，优选为3：1～6：1，更优选为5：1。所述mrna可以为与病毒感染或存活相关的mrna，与代谢疾病相关的mrna，与肿瘤发生或细胞转化相关的mrna，免疫调节mrna，与炎症或自身免疫相关的mrna等。阳离子脂质体和mrna的配比为5：1时，阳离子脂质体对mrna的负载效率更高，更有利于提高该阳离子脂质体/mrna复合物的内涵体逃逸，提高其体内转染效率。
[0143]
术语“n/p比”为含氮阳离子脂质化合物中的三级胺基团与核酸分子中的磷酸根单元的摩尔比。
[0144]
在本发明的一个实施方案中，还提供了一种上述的阳离子脂质体/mrna复合物的制备方法，包括如下步骤：将所述阳离子脂质体与所述mrna混合，孵育20～30分钟，即得。
[0145]
在本发明的另一个实施方案中，提供的上述的阳离子脂质体/mrna复合物的制备方法包括如下步骤：将所述阳离子脂质体与所述mrna混合，孵育20～30分钟，然后用脂质体挤出器制备得到所述阳离子脂质体/mrna复合物。优选地，所述脂质体挤出器为avanti mini-extruder脂质体挤出器，其工艺条件包括：采用0.2μm膜(whatmanpcm819mm0.2μm)挤出m次，7≤m≤13，并且m为奇数；更优选为m为11。
[0146]
若无特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用技术
手段为本领域技术人员所熟识的常规手段。
[0147]
除非另有说明，上下文中百分比为重量百分比，所有温度的单位“度”为摄氏度。
[0148]
以下为具体实施例。
[0149]
实施例1阳离子脂质化合物dm-bta-8的合成
[0150][0151]
第一步：将均苯三甲酸(2.10g，10mmol)，n，n-二甲基乙二胺(0.88g，10mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(2.88g，15mmol)，n，n-二甲胺基吡啶(0.12g，1mmol)溶于20ml的n，n-二甲基甲酰胺中，在50度下搅拌12小时。反应结束后除去有机溶剂，随后将反应物重新溶于二氯甲烷中，用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1，v/v)纯化，得到胺基取代的均苯三甲酸2.12g，产率76％。
[0152]
第二步：将第一步所得产物胺基取代的均苯三甲酸(1.40g，5mmol)，正辛醇(1.86g，10mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(2.88g，15mmol)，n，n-二甲胺基吡啶(0.12g，1mmol)溶于20ml的n，n-二甲基甲酰胺中，在80度下搅拌12小时。反应结束后除去有机溶剂，随后将反应物重新溶于二氯甲烷中，用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1，v/v)纯化，得到目标产物(dm-bta-8)1.62g，产率52％，两步总收率40％。
[0153]
产物表征数据：1h nmr(400mhz，chloroform-d)δ9.56(s，1h)，8.66(s，1h)，8.26(s，2h)，4.26(t，j＝6.7hz，4h)，3.75(t，j＝6.0hz，2h)，3.20(m，2h)，2.30(m，2h)，2.17(s，6h)，1.83
–
1.76(m，2h)，1.69(m，j＝6.7hz，4h)，1.43(m，j＝12.1，4.6hz，4h)，1.18(m，16h)，0.80(t，j＝6.6hz，6h)。ms(m/z)：504.3563(m
+
)。
[0154]
实施例2阳离子脂质化合物dm-bta-12的合成
[0155][0156]
参考实施例1的实验方法，制备得到阳离子脂质化合物dm-bta-12，两步总收率38％。
[0157]
产物表征数据：1h nmr(400mhz，chloroform-d)δ9.57(s，1h)，8.66(s，1h)，8.25(s，2h)，4.26(t，j＝6.7hz，4h)，3.74(t，2h)，3.21(m，2h)，2.30(m，2h)，2.17(s，6h)，1.83
–
1.76(m，2h)，1.69(m，j＝6.7hz，4h))，1.43(m，j＝12.1，4.6hz，4h)，1.18(m，32h)，0.80(t，j＝6.6hz，6h)。ms(m/z)：616.4815(m
+
)。
[0158]
实施例3阳离子脂质化合物dm-bta-14的合成
[0159][0160]
参考实施例1的实验方法，制备得到阳离子脂质化合物dm-bta-14，两步总收率35％。
[0161]
产物表征数据：1h nmr(400mhz，chloroform-d))δ9.55(s，1h)，8.63(s，1h)，8.27(s，2h)，4.25(t，4h)，3.73(t，j＝6.0hz，2h)，3.21(m，2h)，2.29(m，2h)，2.18(s，6h)，1.83
–
1.76(m，2h)，1.69(m，j＝6.7hz，4h))，1.43(m，j＝12.1，4.6hz，4h)，1.18(m，40h)，0.81(t，j＝6.7hz，6h)。ms(m/z)：672.5412(m
+
)
[0162]
实施例4阳离子脂质化合物dm3-bta-14的合成
[0163][0164]
参考实施例1的实验方法，制备得到阳离子脂质化合物dm3-bta-14，两步总收率32％。
[0165]
产物表征数据：1h nmr(400mhz，chloroform-d)δ9.55(s，1h)，8.63(s，1h)，8.27(s，2h)，4.25(t，j＝6.7hz，4h)，3.73(t，j＝6.0hz，2h)，3.21(m，2h)，2.29(m，2h)，2.18(s，6h)，1.83
–
1.76(m，6h)，1.69(m，j＝6.7hz，4h)，1.43(m，j＝12.1，4.6hz，4h)，1.18(m，40h)，0.81(t，j＝6.7hz，6h)。ms(m/z)：686.5600(m
+
)。
[0166]
实施例5阳离子脂质化合物de-bta-14的合成
[0167][0168]
参考实施例1的实验方法，制备得到阳离子脂质化合物de-bta-14，两步总收率41％。
[0169]
产物表征数据：1h nmr(400mhz，chloroform-d)δ9.55(s，1h)，8.63(s，1h)，8.27(s，2h)，4.25(t，j＝6.7hz，4h)，3.73(t，j＝6.0hz，2h)，3.21(m，2h)，2.53(m，4h)，1.83
–
1.76(m，4h)，1.69(m，j＝6.7hz，4h))，1.43(m，j＝12.1，4.6hz，4h)，1.18(m，40h)，0.91(m，12h)。ms(m/z)：700.5754(m
+
)。
[0170]
实施例6阳离子脂质化合物cpen-bta-14的合成
[0171][0172]
参考实施例1的实验方法，制备得到阳离子脂质化合物cpen-bta-14，两步总收率29％。
[0173]
产物表征数据：1h nmr(400mhz，chloroform-d)δ9.55(s，1h)，8.63(s，1h)，8.27(s，2h)，4.25(t，j＝6.7hz，4h)，3.73(t，j＝6.0hz，2h)，3.21(m，2h)，2.48(m，4h)，1.83
–
1.76(m，4h)，1.68(m，8h))，1.43(m，j＝12.1，4.6hz，4h)，1.18(m，40h)，0.91(m，6h)。ms(m/z)：670.5821(m
+
)。
[0174]
实施例7阳离子脂质化合物chex-bta-14的合成
[0175][0176]
参考实施例1的实验方法，制备得到阳离子脂质化合物chex-bta-14，两步总收率23％。
[0177]
产物表征数据：1h nmr(400mhz，chloroform-d)δ9.55(s，1h)，8.63(s，1h)，8.27(s，2h)，4.25(t，j＝6.7hz，4h)，3.73(t，j＝6.0hz，2h)，3.21(m，2h)，2.43(m，8h)，1.83
–
1.76(m，4h)，1.69(m，j＝6.7hz，4h)，1.43(m，8h)，1.18(m，40h)，0.91(m，6h)。ms(m/z)：714.5754(m
+
)。
[0178]
实施例8阳离子脂质化合物dm-bta-14ene的合成
[0179][0180]
参考实施例1的实验方法，制备得到阳离子脂质化合物dm-bta-14ene，两步总收率38％。
[0181]
产物表征数据：1h nmr(400mhz，chloroform-d)δ9.55(s，1h)，8.63(s，1h)，8.27(s，2h)，5.34(m,4h),4.26(t，j＝6.7hz，4h)，3.74(t，j＝6.0hz，2h)，3.21(m，2h)，2.30(m，2h)，2.17(s，6h)，1.83
–
1.76(m，2h)，1.69(m，j＝6.7hz，4h)，1.43(m，4h)，1.18(m，32h)，0.80(t，j＝6.6hz，6h)。ms(m/z)：638.5024(m
+
)。
[0182]
实施例9阳离子脂质体的制备
[0183]
分别将上述实施例1-8制备得到的阳离子脂质化合物(dm-bta-8、dm-bta-12，dm-bta-14、dm3-bta-14、de-bta-14、chex-bta-14、cpen-bta-14和dm-bta-14ene)，以及胆固醇(chol)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg
2000
)均配制
成10mg/ml的乙醇储备溶液。随后按照表1所示分别量取相应体积的储备溶液加入1ml乙醇中，得到阳离子脂质：chol：dspc：dspe-peg
2000
＝50：39：10:1(摩尔比)的溶液，随后通过旋转蒸发除去有机溶剂，随后加入表1所示相应体积的pbs缓冲液，超声波(频率为20khz)处理2分钟后，于4℃水化12h，后用avantimini-extruder脂质体挤出器(即采用0.2μm膜(whatman pc m8 19mm 0.2μm)挤出11次)制备得到阳离子脂质化合物的浓度为0.5mg/ml的相应阳离子脂质体，在4℃冰箱内保存。
[0184]
表1
[0185][0186]
实施例10阳离子脂质体的相关表征
[0187]
对实施例9制备得到的基于dm-bta-8，dm-bta-12，dm-bta-14，dm3-bta-14，de-bta-14，chex-bta-14，cpen-bta-14和dm-bta-14ene的阳离子脂质体进行下述几个方面的检测：
[0188]
一、利用动态光散射粒度仪检测，检测条件为高分子材料，检测介质为水相，检测温度为25℃，检测阳离子脂质体的粒径大小、多分散系数(pdi)，表面电势(zeta电势)情况，检测结果显示阳离子脂质体载体的粒径在100nm到150nm之间(图1)，多分散系数(pdi)为0.1～0.3，表明阳离子脂质体颗粒尺寸均一，分散性良好(图2)，同时zeta电势为7mv～15mv，表明所得脂质体均带正电荷(图3)。
[0189]
二、细胞存活率检测：
[0190]
将mcf-7细胞在含有10％的胎牛血清的培养液中，在37℃，5％co2条件下培养24小时，然后按每孔1.0
×
104细胞密度接种于96孔培养板，在5％co2、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养到细胞密度达到70％左右；更换含有10％胎牛血清的新鲜培养液(100μl/孔)；分别取阳离子脂质体(由实施例9所得)0.2～5.0μl加入到细胞上面，继续培养48小时后，采用mtt方法，测定细胞存活率，其计算公式为[细胞存活率(％)＝(a
sample
/a
control
)
×
100％]，其中，a
sample
是被阳离子脂质体处理的细胞孔的吸收值，a
control
是没有经过阳离子脂质体处理的细胞孔的吸收值，每组实验重复6次，结果如图4所示。随着阳离子脂质体的添加，对细胞有一定毒性，但是整体存活率大于80％，
[0191]
三、采用琼脂糖凝胶电泳阻滞实验检测所得阳离子脂质体作为载体与egfp-mrna(购自合肥阿法纳生物科技有限公司)的结合能力，实验步骤如下：
[0192]
1、配制1％(质量比)的琼脂糖胶板：称取1.20g琼脂糖，加入120ml1xtae溶液
(2.4ml50xtae、117.6ml水；50x tae配方：tris:24.2g；edta：1.46g；冰醋酸：5.71ml；定容至100ml)；然后在微波炉中加热4min至琼脂糖溶解，再加入12μl核酸染色试剂(gelred)；室温冷却至温热，倒入槽中制备胶板。
[0193]
2、样品制备：取1μl浓度为1mg/ml的egfp-mrna质粒溶液与表2所示体积的阳离子脂质化合物的浓度为0.5mg/ml的阳离子脂质体混合(n/p比为5：1，按照公式一，计算各种阳离子脂质化合物的质量，并根据公式二计算各种阳离子脂质体溶液的体积)，对照组以20μl水代替阳离子脂质体溶液，随后将各组定容至36.8μl，孵育25min后加入2.2μl上样缓冲液，得到总体积为39μlμl的相应的跑胶的样品溶液；在制备好的琼脂糖胶板上，按照第一组加入rnamaker、第二组为对照组不加入阳离子脂质体，随后各组加入基于dm-bta-8，dm-bta-12，dm-bta-14，dm3-bta-14，de-bta-14，chex-bta-14，cpen-bta-14和dm-bta-14ene制备的阳离子脂质体(制备方法同实施例9)，将样品溶液上样至凝胶泳道中，每组分别加入39μl。
[0194]
公式一：
[0195][0196]
公式中：
[0197]
m(阳离子脂质化合物)：阳离子脂质化合物的质量
[0198]
m(mrna):mrna的质量
[0199]
嘌呤核苷酸平均分子量：330g/mol
[0200]
氮膦比：n/p比值(为5)
[0201]
公式二：
[0202][0203]
公式中：
[0204]
v(阳离子脂质体)：阳离子脂质体的体积
[0205]
m(阳离子脂质化合物)：阳离子脂质化合物的质量
[0206]
m(阳离子脂质化合物)：阳离子脂质体溶液中阳离子脂质化合物的质量浓度
[0207]
表2
[0208]
[0209]
3、向槽中倒入300ml1xtae溶液，100v电泳跑胶20-30min。
[0210]
4、显影观察。
[0211]
结果显示，当n/p等于5时，载体能够有效的阻滞mrna的电泳，说明本发明的阳离子脂质体的负载能力强(图5)。综合上述实验结果可知：当n/p为5时，阳离子脂质体负载mrna的能力强，转染效率高，细胞毒性是在可以接受的范围内，因此优选n/p为5。
[0212]
实施例11阳离子脂质体的体外(细胞)mrna转染或者递送效率的测定
[0213]
hek293t细胞、dc2.4细胞的培养：在含有10％的胎牛血清的培养液中，在37℃，5％co2条件下培养24小时。转染前一天，按每孔5-10
×
104细胞密度接种于24孔培养板，在5％co2、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养到细胞密度达到70～80％，将培养液更换为无血清无双抗的新鲜培养液(0.45ml/孔)。
[0214]
用实施例9制备阳离子脂质体的方法制备得到相应的阳离子脂质化合物的浓度为5mg/ml的阳离子脂质体，随后将相应的阳离子脂质体与egfp-mrna按照表3所示，以n/p为5：1，分别量取2μl浓度为10mg/ml的egfp-mrna和相应体积的浓度为5mg/ml的阳离子脂质体，并用无血清无双抗的培养基补齐至每孔50μl，涡旋混合后，室温孵育20～30分钟，完成阳离子脂质体对egfp-mrna的包载，得到每孔50μl相应的阳离子脂质体/mrna复合物。
[0215]
表3
[0216][0217]
在上述的每孔50μl的阳离子脂质体/mrna复合物中加入450μl无血清无双抗的opti-mem培养液，得到500μl混合液(其中，mrna的浓度为2μg/ml)，在室温放置30分钟后，加入到上述细胞上面(每孔加入20μl)，继续培养24小时。
[0218]
用流式细胞术检测成功表达egfp(增强绿色荧光蛋白)的细胞比例。结果显示，在两种不同的细胞系hek293t细胞、dc2.4细胞中，本发明的阳离子脂质体与mrna的复合物能够高效地将mrna传送到细胞内，实现mrna的成功表达，如图6所示。
[0219]
实施例12阳离子脂质体递送mrna输送效果验证
[0220]
实验动物：c57/bl6小鼠，雄性，6周龄，体重约20g。
[0221]
所采用的mrna：mluc mrna(购自合肥阿法纳生物科技有限公司)。
[0222]
空白对照组1：4只小鼠，背部皮下注射pbs缓冲液。
[0223]
阴性对照组2：4只小鼠，背部皮下注射mlucmrna。
[0224]
实验组：8组，每组4只小鼠，各组分别在背部皮下注射各阳离子脂质体+mlucmrna，
即阳离子脂质体/mrna复合物。
[0225]
阳离子脂质体/mrna复合物的制备方法如下：
[0226]
将各阳离子脂质化合物、dspc、胆固醇(chol)和dspe-peg
2000
分别溶于乙醇中，浓度分别为10mg/ml；
[0227]
分别取各阳离子脂质化合物、dspc、胆固醇(chol)和dspe-peg
2000
分别溶于乙醇中的乙醇溶液，按照阳离子脂质化合物：dspc：胆固醇：dspe-peg
2000
＝50％：10％：39％：1％(摩尔比)的配比混合(各溶液体积如下表所示)，用氮气吹干，每种混合溶液中加入10ml1
×
pbs，超声(频率为20khz)2min，4℃水化12小时,制备得到对应的阳离子脂质体溶液。
[0228]
表4
[0229][0230]
按照n/p比例为5：1分别在每种阳离子脂质体溶液中加入6.6μl浓度为1mg/ml的mluc mrna共孵育25min,用avanti mini-extruder脂质体挤出器(即采用0.2μm膜(whatman pc m8 19mm 0.2μm)挤出11次)制备得到对应的阳离子脂质体/mrna复合物，在4℃冰箱内保存。
[0231]
将上述制备的阳离子脂质体/mrna复合物按mrna的注射剂量为每只小鼠5μg从小鼠的背部皮下注射，24小时后，取淋巴结，通过小动物成像拍摄注射原位淋巴结的荧光素的生物发光，以此检测mrna表达的效率(如图7所示)。从图中结果可知，通过皮下注射带有荧光素的阳离子脂质体/mrna复合物，在淋巴结部位都有较强的荧光信号，说明本发明的阳离子脂质体/mrna复合物对于淋巴结具有较强的靶向能力和转染效率，同时以阳离子脂质dm3-bta-14制备的阳离子脂质体/mrna复合物具有最好的淋巴结富集效果。
[0232]
实施例13阳离子脂质体的内涵体逃逸效率测定
[0233]
纳米药物的内涵体逃逸可以避免纳米药物进入溶酶体被降解，是决定纳米药物治疗效果的关键一步。gal8蛋白是内涵体逃逸的标志物，本实施例将gal8-gfp细胞系(hela细胞，购于atcc)用于研究不同性质的脂质体对纳米药物内涵体逃逸的影响及其机制。
[0234]
本实施例将阳离子脂质化合物dm3-bta-14与柔性脂质分子dotap以及对照化合物tt3和ftt5参照实施例9的方法制备得到5mg/ml的阳离子脂质体溶液(其浓度分别以阳离子脂质化合物dm3-bta-14、柔性脂质分子dotap、对照化合物tt3和ftt5的质量计算)。随后将1μl浓度为1mg/ml的罗丹明标记的egfpmrna(fitc egfp mrna购自合肥阿法纳生物科技有限公司)按照n/p比例为5，分别与2.1μl的dm3-bta-14脂质体溶液、2.3μl的柔性脂质分子dotap脂质体溶液、4.1μl的对照化合物tt3的脂质体溶液和5.6μl的对照化合物ftt5的脂质
体溶液共孵育25分钟后得到相应的阳离子脂质体/mrna复合物。
[0235]
其中，化合物tt3和化合物ftt5的结构式分别如下：
[0236][0237][0238]
将gal8-gfp-hela细胞在含有10％的胎牛血清的培养液中，在37℃，5％co2条件下培养24小时，然后按每孔1.0
×
104细胞密度接种于96孔培养板，在5％co2、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养到细胞密度达到70％左右；更换含有10％胎牛血清的新鲜培养液(100μl/孔)；分别取阳离子脂质体/mrna复合物溶液3.1μl(dm3-bta-14/fitc egfp mrna)，3.3μl(dotap/fitc egfp mrna，5.1μl(tt3/fitc egfp mrna)，6.6μl(ftt5//fitc gfp mrna)加入到细胞上面，继续培养48小时后，利用转盘共聚焦显微镜，每隔10s高速三维成像，观察细胞内内涵体逃逸的过程。结果见图8所示，可见无论从逃逸概率还是逃逸量来看，本发明的阳离子脂质体都要高于对照组，说明以本发明的阳离子脂质化合物制备的mrna载体以及阳离子脂质体/mrna复合物具有更好的内涵体逃逸能力。
[0239]
进一步，对单个含有纳米脂质体的内涵体囊泡进行追踪，发现不同性质脂质体负
载的fitc egfp mrna内涵体逃逸都集中在早期内涵体向晚期内涵体转化的5-15分钟的时间窗口内，由刚性脂质体(以dm3-bta-14制备的阳离子脂质体)负载的fitc egfp mrna更早发生内涵体逃逸。
[0240]
实施例14阳离子脂质体对于荷瘤小鼠的体内输送mrna效果验证
[0241]
实验动物：c57/bl6荷瘤(b16-f10)小鼠，雄性，6周龄，体重约20g。
[0242]
所采用的mrna为mluc mrna。
[0243]
空白对照组1：3只小鼠，尾静脉注射pbs缓冲液。
[0244]
阴性对照组2：3只小鼠，尾静脉注射mluc mrna。
[0245]
实验组：10组，每组3只小鼠，尾静脉分别注射8种阳离子脂质体+mluc mrna、化合物tt3+mluc mrna、化合物ftt5+mluc mrna。
[0246]
按照实施例9所示方法分别将dm-bta-8，dm-bta-12，dm-bta-14，dm3-bta-14，de-bta-14，chex-bta-14，cpen-bta-14，dm-bta-14ene，化合物tt3和化合物ftt5制备得到浓度分别为3.8mg/ml，4.7mg/ml，5.1mg/ml，5.2mg/ml，5.3mg/ml，5.4mg/ml，5.3mg/ml，5.4mg/ml，9.98mg/ml，14.0mg/ml的阳离子脂质体溶液。
[0247]
再将阳离子脂质体溶液与mrna混合制备阳离子脂质体/mrna复合物，方法如下：取7.14μl的mrna(14mg/ml)，加入到0.2ml经过灭菌处理的蔗糖溶液(278mm)中，混匀，得mrna溶液；取0.2ml阳离子脂质体溶液加入到0.2mlmrna溶液里，混匀，室温孵育30分钟，即得n/p为5:1的阳离子脂质体/mrna复合物。
[0248]
将该阳离子脂质体/mrna复合物经尾静脉注射c57/bl6小鼠(mrna剂量为5mg/kg)，24小时后检测不同脏器的荧光强度(预先通过腹腔注射d-luciferin)，评估mrna的表达量(如图9所示)。
[0249]
从图中结果可知，荧光素主要富集在肝脏，脾脏和肿瘤，说明本发明的阳离子脂质体/mrna复合物具有很强的递送mrna的能力和转染效率以及肿瘤靶向能力。并且由本发明的dm3-bta-14等化合物与mrna制备的复合物，其富集能力明显高于阳性对照化合物tt3和ftt5。
[0250]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0251]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。