调控大豆株高的基因及其编码蛋白和应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及调控大豆株高的基因及其编码蛋白和应用。


背景技术：

2.大豆(glycine max)是一种重要的粮食作物和油料作物，其种子富含蛋白质，是世界上70％可食用蛋白质的来源，同时也是生物柴油的新兴原料。大豆起源于中国，目前为我国仅次于油菜的第二大油料作物。全球大豆油消耗量占植物油消耗量的47％，占世界用油的35％。大豆油是人类与动物营养以及食品加工业植物食用油的重要来源。大豆用途广泛，积极发展大豆生产、提升大豆生产竞争力，对满足居民对植物蛋白、油脂的需求、发展农业和畜牧业都有着极其重要的经济意义和社会意义。因此，寻找高产基因，通过分子育种提高大豆产量，成为保障大豆产业稳定发展的经济、有效的手段。
3.株型是决定作物产量的重要因素，理想株型的塑造是提高作物产量的重要途径。其中株高是大豆株型的主要要素之一。大豆是靠群体生产来提高产量的作物，不同的种植密度对株高有不同的要求，若种植密度小，植株可高大、粗壮、分枝多些；若种植密度大，植株则应相对矮些，且为主茎性。降低株高有利于提高大豆密植的产量，因此，挖掘调控株高的基因可以为大豆育种提供更多的基因资源，对推进大豆新品种选育进程，保证大豆高产稳产具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的株高，和/或，如何降低株高进而提高大豆密植的产量。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
5.为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：
6.d1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物株高中的应用；
7.d2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物株高的产品中的应用；
8.d3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育株高降低植物中的应用；
9.d4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育株高降低植物的产品中的应用；
10.d5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；
11.所述蛋白质名称为ga2ox8，可为下述任一种：
12.a1)氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质；
13.a2)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
14.a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
15.为了使a1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
16.所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。
17.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质ga2ox8的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质ga2ox8的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质ga2ox8且具有蛋白质ga2ox8功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
18.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
19.本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
20.本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
21.本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质ga2ox8。
22.上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
23.所述调控基因表达的物质具体可为b1)、b2)和b3)中任一所述的生物材料。
24.上述应用中，所述蛋白质可来源于大豆(glycine max)。
25.本发明还提供了与所述蛋白质ga2ox8相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
26.e1)与所述蛋白质ga2ox8相关的生物材料在调控植物株高中的应用；
27.e2)与所述蛋白质ga2ox8相关的生物材料在制备调控植物株高的产品中的应用；
28.e3)与所述蛋白质ga2ox8相关的生物材料在培育株高降低植物中的应用；
29.e4)与所述蛋白质ga2ox8相关的生物材料在制备培育株高降低植物的产品中的应用；
30.e5)与所述蛋白质ga2ox8相关的生物材料在植物育种中的应用；
31.所述生物材料可为下述b1)至b7)中的任一种：
32.b1)编码所述蛋白质ga2ox8的核酸分子；
33.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
34.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
35.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
36.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
37.b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；
38.b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。
39.上述应用中，b1)所述核酸分子可为下述任一种：
40.c1)编码序列是seq id no.2的cdna分子；
41.c2)核苷酸序列是seq id no.2的dna分子。
42.其中，核苷酸序列是seq id no.2的dna分子(调控大豆株高的基因gmga2ox8)编码氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质ga2ox8。
43.本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
44.本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、人工染色体(如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、p1人工染色体(pac)或ti质粒人工染色体(tac)等)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)，具体可为pjl12载体。
45.本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia),欧文氏菌(erwinia),根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium),产碱菌属(alcaligenes),假单胞菌属(pseudomonas),芽胞杆菌属(bacillus)等，具体可为大肠杆菌dh5α或根癌农杆菌eha105。
46.本发明还提供了一种培育株高降低植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质ga2ox8的含量和/或活性，得到株高低于所述目的植物的株高降低植物。
47.上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质ga2ox8的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质ga2ox8的编码基因的表达量实现。
48.上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质ga2ox8的编码基因的表达量通过将所述蛋白质ga2ox8的编码基因导入所述目的植物实现。
49.上述方法中，所述蛋白质的编码基因可为下述任一种：
50.f1)编码序列是seq id no.2的cdna分子；
51.f2)核苷酸序列是seq id no.2的dna分子。
52.具体地，在本发明的一个实施方案中，所述提高目的植物中所述蛋白质ga2ox8的
编码基因的表达量通过将seq id no.2所示的dna分子导入所述目的植物实现。
53.在本发明的一个实施方案中，所述培育株高降低植物的方法包括如下步骤：
54.(1)构建包含seq id no.2所示dna分子的重组载体gmga2ox8-pjl12；
55.(2)将步骤(1)构建的重组载体gmga2ox8-pjl12转入目的植物(如作物或大豆)中；
56.(3)经筛选和鉴定获得株高低于所述目的植物的株高降低植物。
57.本文中，所述植物可为下述任一种：
58.f1)单子叶植物或双子叶植物；
59.f2)豆科植物；
60.f3)大豆。
61.本文中，所述植物可为作物(农作物)。
62.本发明还提供了所述培育株高降低植物的方法在创制株高降低植物和/或植物育种中的应用。
63.本文所述植物育种可为降低株高转基因育种，可应用于大豆密植技术中提高大豆产量。
64.本文所述调控植物株高可为降低植物株高或增加植物株高。
65.本发明中，所述株高降低植物理解为不仅包含将所述gmga2ox8基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述株高降低植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
66.本发明通过将来源于大豆(glycine max)的gmga2ox8基因编码序列(seq id no.2)导入到受体植物大豆栽培品种天隆一号(tl1)中，得到了转基因大豆植株。实验证明，与未转基因受体对照野生型天隆一号(tl1)相比，在过表达gmga2ox8基因的大豆转基因株系(line1(#1)，line4(#4)，line8(#8))中，gmga2ox8基因的转录水平均显著提高，并且所有的转基因株系在不同生长时期，无论是开花前还是成熟后，大豆株高均极显著降低。其中，大豆转基因t3代株系line1(#1)开花前株高比对照(tl1)减少了83.2％，成熟后株高比对照(tl1)减少了88.6％；大豆转基因t3代株系line4(#4)开花前株高比对照(tl1)减少了64.9％，成熟后株高比对照(tl1)减少了73.6％；大豆转基因t3代株系line8(#8)开花前株高比对照(tl1)减少了83.2％，成熟后株高比对照(tl1)减少了88.6％；结果表明gmga2ox8基因对大豆株高具有极显著的调控作用，可以调控大豆的株高，通过在受体大豆中过表达gmga2ox8基因可以显著地降低大豆的株高。本发明首次将gmga2ox8基因用于降低株高转基因育种，可应用于大豆密植技术中提高大豆产量，为调控大豆株高性状的育种提供了一个良好的基因资源，在大豆育种中具有广泛的应用前景，对于保证大豆的高产稳产具有重要意义。
附图说明
67.图1为大豆转基因t3代株系line1(#1)gmga2ox8基因的转录水平。
68.图2为大豆转基因t3代株系line1(#1)开花前株高的统计图。
69.图3为大豆转基因t3代株系line1(#1)成熟后株高的统计图。
70.图4为大豆转基因t3代株系line4(#4)gmga2ox8基因的转录水平。
71.图5为大豆转基因t3代株系line4(#4)开花前株高的统计图。
72.图6为大豆转基因t3代株系line4(#4)成熟后株高的统计图。
73.图7为大豆转基因t3代株系line8(#8)gmga2ox8基因的转录水平。
74.图8为大豆转基因t3代株系line8(#8)开花前株高的统计图。
75.图9为大豆转基因t3代株系line8(#8)成熟后株高的统计图。
具体实施方式
76.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
77.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
78.下述实施例中的载体pjl12(klaus,petersen,jin-long,qiu,juri,l
ü
tje,bert he katrine,fiil,sidsel,hansen,john,mundy,morten,petersen.arabidopsis mk s1 is involved in basal immunity and requires an intact n-terminal doma in for proper function.[j].plos one,2010,5(12):e14364.)公众可以从中国农业科学院油料作物研究所获得，以重复本技术实验。
[0079]
实施例1基因gmga2ox8及其编码蛋白ga2ox8在调控大豆株高中的应用
[0080]
基因gmga2ox8的编码序列(cds)的核苷酸序列如seq id no.2所示(由1101个核苷酸组成)，来源于大豆(glycine max)；
[0081]
基因gmga2ox8编码氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质ga2ox8，seq id no.1由366个氨基酸残基组成。
[0082]
1、过表达载体构建
[0083]
以大豆天隆一号叶片cdna为模板，设计基因gmga2ox8克隆引物(cds-fw与cds-rw)，用primer star max(takara,japan)试剂盒进行扩增，如表1所示体系配制反应液(total 50ul)：
[0084]
表1 pcr反应体系
[0085][0086]
pcr扩增反应程序为：98℃10sec变性，58℃退火15sec，72℃延伸1min，共计35个循环，用bio-rad ptc-100pcr仪扩增。
[0087]
gmga2ox8基因扩增引物(cds-fw与cds-rw)如下所示：
[0088]
cds-fw：5
‑’
cagtcgatctgatcaagagacaggatccatgcccactaacaaattaaatatggagcactc-3’；
[0089]
cds-rw：5
‑’
gctccaccgcggtggcggccgctctagattaggttcccgtagaggttggaaaattg-3’。
[0090]
pcr反应结束后，得到的pcr产物(约1.1kb)用琼脂糖凝胶电泳进行检测，切胶回收1.1kb左右目标片段，回收步骤依据fastpure gel dna extraction mini kit(vazyme,china)对目的条带进行回收，得到gmga2ox8基因扩增片段(cds扩增片段)，该gmga2ox8基因扩增片段(cds扩增片段)含有核苷酸序列是seq id no.2的基因gmga2ox8的编码序列(cds)。
[0091]
使用clonexpress ii one step cloning kit(vazyme,china)将上述gmga2ox8基因扩增片段克隆入用ahdi酶切回收的pjl12载体中，得到重组载体gmga2ox8-pjl12。
[0092]
连接反应如表2所示体系配制反应液(total 20ul)：
[0093]
表2连接反应体系
[0094][0095]
连接反应条件为：37℃30min，于冰上冷却，获得重组载体gmga2ox8-pjl12。
[0096]
2、载体转化大肠杆菌
[0097]
取10μl连接产物(重组载体gmga2ox8-pjl12)加入100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞后，用化学法转化：即将上述大肠杆菌dh5α感受态细胞与连接产物的混合样(混合感受态细胞)于冰上放置30min，置于42℃水中温浴90sec，再立即放入冰上3min，加1ml lb培养基后于37℃230rpm摇菌1hr，3000rpm离心4min去上清后，用剩余培养基重悬菌液，涂布含卡那霉素(50μg/ml)抗性的lb培养基圆皿，37℃培养24hr，长出菌斑经过扩大培养并测序，测序正确的为阳性克隆。
[0098]
3、载体转化农杆菌
[0099]
阳性克隆在5ml卡那霉素(50μg/ml)抗性的lb培养基中于37℃培养过夜，用快速质粒小提试剂盒(tiangen,china)提取质粒。用化学法转化eha105根癌农杆菌。将感受态根癌农杆菌eha105(100μl)置于冰上，加入1μg质粒dna(gmga2ox8-pjl12)，混匀后于冰上放置30min，再置于液氮中速冻5min后迅速转移到37℃水浴5min，再置于冰上5min。随后加入1ml lb培养基，于28℃230rpm培养4hr。随后用3000rpm离心2min收集菌体，去上清后用剩余培养基重悬菌体，涂布含卡那霉素(30μg/ml)的lb培养基平板，于28℃培养48hr。将长出克隆用克隆pcr鉴定，阳性克隆(含有核苷酸序列是seq id no.2的gmga2ox8基因的编码序列)命名为重组根癌农杆菌eha105/gmga2ox8-pjl12，用于大豆稳定转化。
[0100]
二、大豆稳定转化及基因表达水平分析
[0101]
1、大豆稳定转化
[0102]
以大豆栽培品种天隆一号为受体材料，用子叶节法(paz,m.m.,martinez,j.c.,kalvig,a.b.,fonger,t.m.,&wang,k.(2006).improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient agrobacterium-mediated soybean transformation.plant cell reports,25(3),206-213.)进行稳定转化重组根癌农杆菌eha105/gmga2ox8-pjl12。获得植株用1:1000稀释的basta(bayer cropscience,germany)喷施筛选。阳性苗于温室加代，温室为25℃，16hr光照/8hr黑暗条件。t2代稳定转化植株所收种子(t3代转基因株系)用于株高测定。
[0103]
2、基因表达水平分析
[0104]
用实时荧光定量pcr的方法进行t3代转基因株系中gmga2ox8基因的表达水平分析。用trizol(thermo fisher scientific,usa)提取t3代转基因株系line1(#1)，line4(#4)，line8(#8)和天隆一号(tl1)复叶中总rna，使用m-mlv reverse transcriptase反转录试剂盒(promega,usa)对提取的总rna样品反转为cdna，再使用takara sybr premix ex taq(takara,japan)构建反应体系，并在abi q3或q5仪器上进行实时荧光定量pcr(applied biosystems,usa)。每个样本有3个生物学重复，并用于统计分析。gmskip16作为内参基因，以天隆一号(tl1)的表达水平为1，用
‑△△
c(t)法进行分析。
[0105]
内参基因的引物如下所示：
[0106]
qskip16-fw:5
’‑
atcttgactgagcgtggttattcc-3’，
[0107]
qskip16-rw:5
’‑
gctggtcctggctgtctcc-3’，
[0108]
gmga2ox8基因的引物如下所示：
[0109]
qga2ox8-fw:5
’‑
gacaacaagttcgagaggatgttcac-3’，
[0110]
qga2ox8-rw:5
’‑
ctcgtgatacatattcatgcacactatcttg-3’。
[0111]
荧光定量pcr扩增程序为：95℃15min；95℃10sec,60℃退火15sec，72℃延伸20sec，共计40个循环。
[0112]
三、转基因大豆株高性状考察
[0113]
株高测量：
[0114]
分别考察t3代转基因株系line1(#1)，line4(#4)，line8(#8)和天隆一号(tl1)开花前株高和成熟后株高性状，测量的大豆为t3代，种植于温室。于开花前期和收获时统计株高(即开花前株高和成熟后株高)。株高是指从子叶痕到主茎顶端生长点的距离，单位为厘米。每个株系测量6个单株用于株高统计。显著性差异统计均用student’t-test计算(p)，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜0.01(**)表示具有极显著性差异。
[0115]
四、结果分析
[0116]
1、大豆转基因t3代株系line1(#1)
[0117]
在大豆转基因株系line1(#1)中：
[0118]
gmga2ox8基因的转录水平如图1所示，转基因株系#1中的gmga2ox8基因的转录水平极显著高于未转基因受体对照天隆一号(tl1)(p《0.01)。
[0119]
转基因株系line1(#1)的开花前株高如图2所示，天隆一号(tl1)为受体对照，株高为14.42厘米；转基因株系line1(#1)的株高为2.42厘米，株高显著降低，比对照减少了83.2％。
[0120]
转基因株系line1(#1)的成熟后株高如图3所示，天隆一号(tl1)为受体对照，株高为35.92厘米；转基因株系line1(#1)的株高为4.08厘米，株高显著降低，比对照减少了88.6％。
[0121]
2、大豆转基因t3代株系line4(#4)
[0122]
在大豆转基因株系line4(#4)中：
[0123]
gmga2ox8基因的转录水平如图4所示，转基因株系#4中的gmga2ox8基因的转录水平极显著高于未转基因受体对照天隆一号(tl1)(p《0.01)。
[0124]
转基因株系line4(#4)的开花前株高如图5所示，天隆一号(tl1)为受体对照，株高为14.42厘米；转基因株系line4(#4)的株高为5.08厘米，株高显著降低，比对照减少了64.9％。
[0125]
转基因株系line4(#4)的成熟后株高如图6所示，天隆一号(tl1)为受体对照，株高为35.92厘米；转基因株系line4(#4)的株高为9.5厘米，株高显著降低，比对照减少了73.6％。
[0126]
3、大豆转基因t3代株系line8(#8)
[0127]
在大豆转基因株系line8(#8)中：
[0128]
gmga2ox8基因的转录水平如图7所示，转基因株系#8中的gmga2ox8基因的转录水平极显著高于未转基因受体对照天隆一号(tl1)(p《0.01)。
[0129]
转基因株系line8(#8)的开花前株高如图8所示，天隆一号(tl1)为受体对照，株高为14.42厘米；转基因株系line8(#8)的株高为2.42厘米，株高显著降低，比对照减少了83.2％。
[0130]
转基因株系line8(#8)的成熟后株高如图9所示，天隆一号(tl1)为受体对照，株高为35.92厘米；转基因株系line8(#8)的株高为4.08厘米，株高显著降低，比对照减少了88.6％。
[0131]
结果表明，不同生长时期，无论是开花前还是成熟后，gmga2ox8基因对大豆株高具有极明显的调控作用，可以调控大豆的株高，在受体大豆中过表达gmga2ox8基因可以极显著地降低大豆的株高。
[0132]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。