一种基于深度共熔溶剂提取金线莲苷的方法

1.本发明属于植物有效成分提取领域，具体涉及一种基于深度共熔溶剂提取金线莲苷的方法。


背景技术：

2.金线莲(anoectochilusroxburghii(wall.)lindl.)为兰科开唇兰属植物，又名金线兰、花叶开唇兰。在我国，主要分布于福建、广东、广西、云南、海南等亚热带及热带地区，民间素有“北有冬虫夏草，南有金线莲”之说。金线莲作为一种传统的名贵中草药，其性平、味干，具有清热凉血、祛风利湿、解毒止痛、润肺止咳等功效，有着极高的开发利用价值。
3.金线莲苷是金线莲的一种特征性成分，化学名为3r
‑
β
‑
d
‑
吡喃葡萄糖氧基
‑
γ
‑
丁内酯，cas号:151870
‑
74
‑
5，为葡萄糖与五元内酯环的手性碳以氧苷键形式连接形成的糖苷。现代医学研究表明，金线莲苷具有修复胰岛β细胞损伤、促进骨骼肌细胞摄取葡萄糖、加速脂质代谢、保护急性酒精性肝损伤、抑制炎症反应、改善老年性黄斑变性、缓解椎间盘退变等多种药理活性。
4.从金线莲中提取金线莲苷的常用溶剂主要是水或乙醇。单纯水提取金线莲苷的提取率较低，乙醇水溶液提取金线莲苷的提取率较高，但是，溶剂用量大，需要额外回收，而且，乙醇属于类危险化学品，火灾危险性属于甲类，严格的安全要求一定程度上限制了乙醇提取法的推广应用。
5.深度共熔溶剂(deep eutectic solvent，des)是指由一定化学计量比的氢键受体(如季铵盐)和氢键供体(如酰胺、羧酸和多元醇等化合物)组合而成的两组分或三组分低共熔混合物。近年来，凭借其价格低廉、不易燃、易于制备、可生物降解及无毒性等优势被广泛应用于天然活性物质的提取中，已成功提取酚类、黄酮类、萜烯类、多糖等不同极性的化合物，提取效率高且安全方便。
6.目前，常见的金线莲苷提取方法主要包括：回流提取法、超声波辅助提取法、亚临界水/醇提取法。回流提取法有机溶剂消耗量大，能耗大，且长时间的高温提取易使金线莲苷降解；超声波辅助提取法和亚临界水/醇提取法则存在着设备和运行成本昂贵、耗能大等弊端，仅限于实验室的初步研究，难以应用于工业规模化生产。而且，这些提取方法都需要后续繁琐的固液分离操作。因此，寻找简单高效且环保经济的提取方法，提高开唇兰植物中的金线莲苷提取率具有重要的科学研究意义。
7.柱提取法是一种新型的高效节能且简单经济的植物有效成分动态提取方法。该方法将提取与固液分离相互集成，在提取分离中借鉴了柱层析的操作方法，包含目标成分溶解与洗脱两个步骤，首先用最少体积的最适提取溶剂将目标成分溶解，随后采用溶剂将目标成分从提取柱中洗脱出来。柱提取法作为一种简单高效和节能环保的植物有效成分提取方法，溶剂消耗量小，提取效率高，减少了后续的固液分离过程，工艺设备简单，全过程在室温下进行，在天然活性物质的提取分离研究中具有广阔的应用前景。
8.有鉴于此，现有的传统提取方法效率低而成本高，不能满足当前对天然活性成分
进行深入研究的需要，亟需开发一种经济、高效、绿色的从金线莲中提取金线莲苷的方法。


技术实现要素：

9.为解决现有技术缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种基于深度共熔溶剂提取金线莲苷的方法。本发明采用深度共熔溶剂作为提取溶剂，进一步结合柱提取的新型分离方法，不仅实现了金线莲苷的绿色安全提取，且操作条件温和，降低了生产和设备成本，提高了金线莲苷的提取效率，易于工业推广应用。
10.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
11.一种基于深度共熔溶剂提取金线莲苷的方法，包括如下步骤：
12.s1、原料的预处理：将干燥的金线莲原材料粉碎，过筛，得到金线莲粉末；
13.s2、深度共熔溶剂
‑
水溶液的制备：将氢键受体试剂和氢键供体试剂真空干燥，然后混合均匀，加热搅拌，直至形成澄清均一的液体，干燥，冷却至无固体析出，得到深度共熔溶剂；向制备好的深度共熔溶剂中加水，搅拌均匀，得到深度共熔溶剂
‑
水溶液；
14.s3、提取和纯化：向步骤s1所得金线莲粉末加入深度共熔溶剂
‑
水溶液，混合均匀，进行超声提取或柱提取，得到提取液；提取液分离纯化，得到金线莲苷。
15.所述的步骤s2中，氢键受体试剂为氯化胆碱、甜菜碱、左旋肉碱中的一种或多种组合，优选为氯化胆碱；氢键供体试剂为柠檬酸、乳酸、乙酸、酒石酸、苹果酸、甘油、乙二醇、1,4
‑
丁二醇、山梨醇中的一种或多种组合，优选为苹果酸；氢键受体试剂和氢键供体试剂按摩尔比1～3∶3～1混合均匀。
16.进一步地，所述的步骤s1中，金线莲粉末的粒度为20～60目。
17.进一步地，所述的步骤s2中，真空干燥的条件为温度40～60℃、时间12～24h；进一步优选为温度55～60℃、时间16～24h；最优选为温度60℃、时间24h。
18.进一步地，所述的步骤s2中，加热搅拌的条件为温度70～90℃、时间2～8h；进一步优选为70～80℃、时间4～8h；最优选为80℃、时间4h。
19.进一步地，所述的步骤s2中，干燥的条件为温度50～60℃、时间12～24h；进一步优选为55～60℃、时间12～18h；最优选为60℃、时间12h。
20.进一步地，所述的步骤s2中，水的用量按所得深度共熔溶剂
‑
水溶液的含水量为20～60％(w/w)计；进一步优选为30～40％(w/w)；最优选为40％(w/w)。所用水为蒸馏水。
21.进一步地，当所述的步骤s3中提取方法为超声提取时，步骤s3的具体操作为：
22.向步骤s1所得金线莲粉末加入4～20倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，混合均匀，40～70℃超声提取30～120min，提取功率为150～400w，收集提取液；提取液分离纯化，得到金线莲苷；进一步优选为50℃超声提取60min，提取功率为280w。
23.进一步地，所述的分离纯化的具体操作为：将得到的提取液真空浓缩，将浓缩液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸洗脱液洗脱并分段收集洗脱液，将hplc
‑
elsd检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，得到金线莲苷纯品。
24.当所述的步骤s3中提取方法为柱提取时，步骤s3的具体操作为：
25.向步骤s1所得金线莲粉末加入4～8倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，混合均匀，室温下(20～25℃)静置2～6h，按照径高比1∶6～1∶12将其装入层析柱，以0.5～2.5bv/h的流速进行洗脱，收集体积为1.0～3.0bv的洗脱液为提取液；提取液分离纯化，得
到金线莲苷；进一步优选为向步骤s1所得金线莲粉末加入4～5倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，混合均匀，静置3h，按照径高比1∶10～1∶12将其装入层析柱，以1bv/h的流速进行洗脱，收集体积为1.5～2.0bv的洗脱液为提取液。
26.所述的纯化的具体操作为：将得到的提取液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸洗脱液洗脱并分段收集洗脱液，将hplc
‑
elsd检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，得到金线莲苷纯品。
27.所述的乙酸乙酯/乙醇/乙酸洗脱液中乙酸乙酯、乙醇、乙酸的配比为体积比25～45：5～25：1；进一步优选为35～40：10～15：1；最优选为40：10：1。
28.所述的用乙酸乙酯/乙醇/乙酸洗脱液洗脱的流速为0.5～3bv/h；进一步优选为1～3bv/h；最优选为1bv/h。
29.与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
30.1、本发明采用深度共熔溶剂提取金线莲苷，有效规避了乙醇提取可能的安全隐患。相较于传统提取溶剂，深度共熔溶剂不易挥发、热稳定性高、生物相容性良好、容易得到且制备简单，是一种安全环保的绿色溶剂。
31.2、本发明采用的制备深度共熔溶剂的原料中，氯化胆碱为食品营养强化剂，苹果酸为食品酸味剂，原料来源广泛、成本低廉、无毒无害。
32.3、本发明采用深度共熔溶剂
‑
水溶液作为金线莲苷的提取溶剂，将其配置成深度共熔溶剂
‑
水溶液后，不仅降低了溶液粘度，且增强了氢键稳定性，由此显著提高了金线莲苷的提取率。
33.4、本发明采用柱提取法作为金线莲苷的提取方法，原料利用率高，提取溶剂用量少，提取效率高，提取与固液分离一次完成，提取过程中无需加热，操作条件温和，避免了高温高压对活性物质的破坏，且设备工艺简单。
附图说明
34.图1为本发明方法提取的金线莲苷的薄层色谱(tlc)分析结果图；其中，条带1为金线莲苷标准品，条带2为本发明方法获得的金线莲苷纯品。
35.图2为本发明方法提取的金线莲苷的hplc
‑
elsd分析结果图。
36.图3为本发明方法提取的金线莲苷的高分辨质谱分析结果图。
具体实施方式
37.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
38.除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
39.实施例1
40.本实施例提供了一种用于提取金线莲苷的深度共熔溶剂，所述深度共熔溶剂的制备方法按如下步骤进行：将氯化胆碱和苹果酸置于真空干燥箱40℃干燥24h，按照3∶1摩尔比称取氯化胆碱和苹果酸，混合均匀，90℃加热搅拌4h后得到澄清均一的液体，将其置于60
℃真空干燥箱中干燥12h，冷却至室温，无固体析出，即得到深度共熔溶剂。
41.本实施例还提供了一种基于深度共熔溶剂的柱提取法提取金线莲苷的方法，采用上述深度共熔溶剂作为提取溶剂，包括以下步骤：
42.1、原料的预处理：将干燥的金线莲材料粉碎，过筛，取20目筛下、60目筛上金线莲干燥粉末，4℃保存备用；
43.2、深度共熔溶剂
‑
水溶液的制备：向制备好的深度共熔溶剂中加入适量蒸馏水，搅拌均匀，调整含水量为20％(w/w)；
44.3、成分溶解：准确称取一定质量的金线莲粉末于烧杯中，加入4倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，混合均匀，室温下静置4h；
45.4、洗脱：按照径高比1∶6将其装入层析柱，以0.5bv/h的流速进行洗脱，收集3.0bv洗脱液。
46.5、纯化：步骤4得到的洗脱液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸(8:2:0.2)洗脱并分段收集洗脱液，洗脱流速为1bv/h，将高效液相色谱
‑
蒸发光散射(hplc
‑
elsd)检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，经半制备hplc
‑
elsd后最终得到金线莲苷纯品。
47.在此条件下，金线莲苷的提取率为83.87
±
1.43％。
48.实施例2
49.本实施例提供了一种用于提取金线莲苷的深度共熔溶剂，所述深度共熔溶剂的制备方法按如下步骤进行：将氯化胆碱和苹果酸置于真空干燥箱50℃干燥20h，按照1∶2摩尔比称取氯化胆碱和苹果酸，混合均匀，80℃加热搅拌6h后得到澄清均一的液体，将其置于50℃真空干燥箱中干燥24h，冷却至室温，无固体析出，即得到深度共熔溶剂。
50.本实施例还提供了一种基于深度共熔溶剂的柱提取法提取金线莲苷的方法，采用上述深度共熔溶剂作为提取溶剂，包括以下步骤：
51.1、原料的预处理：将干燥的金线莲材料粉碎，过筛，取20目筛下、60目筛上金线莲干燥粉末，4℃保存备用；
52.2、深度共熔溶剂
‑
水溶液的制备：向制备好的深度共熔溶剂中加入适量蒸馏水，搅拌均匀，调整含水量为60％(w/w)；
53.3、成分溶解：准确称取一定质量的金线莲粉末于烧杯中，加入8倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，混合均匀，室温下静置3h；
54.4、洗脱：按照径高比1∶8将其装入层析柱，以2.0bv/h的流速进行洗脱，收集2.0bv洗脱液。
55.5、纯化：步骤4得到的洗脱液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸(5:5:0.2)洗脱并分段收集洗脱液，洗脱流速为2bv/h，将hplc
‑
elsd检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，经半制备hplc
‑
elsd后最终得到金线莲苷纯品。
56.在此条件下，金线莲苷的提取率为87.59
±
1.30％。
57.实施例3
58.本实施例提供了一种用于提取金线莲苷的深度共熔溶剂，所述深度共熔溶剂的制备方法按如下步骤进行：将氯化胆碱和苹果酸置于真空干燥箱55℃干燥16h，按照1∶1摩尔比称取氯化胆碱和苹果酸，混合均匀，70℃加热搅拌8h后得到澄清均一的液体，将其置于55
℃真空干燥箱中干燥18h，冷却至室温，无固体析出，即得到深度共熔溶剂。
59.本实施例还提供了一种基于深度共熔溶剂的柱提取法提取金线莲苷的方法，采用上述深度共熔溶剂作为提取溶剂，包括以下步骤：
60.1、原料的预处理：将干燥的金线莲材料粉碎，过筛，取20目筛下、60目筛上金线莲干燥粉末，4℃保存备用；
61.2、深度共熔溶剂
‑
水溶液的制备：向制备好的深度共熔溶剂中加入适量蒸馏水，搅拌均匀，调整含水量为30％(w/w)；
62.3、成分溶解：准确称取一定质量的金线莲粉末于烧杯中，加入5倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，混合均匀，室温下静置3h；
63.4、洗脱：按照径高比1∶12将其装入层析柱，以1.0bv/h的流速进行洗脱，收集2.0bv洗脱液。
64.5、纯化：步骤4得到的洗脱液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸(7:3:0.2)洗脱并分段收集洗脱液，洗脱流速为3.0bv/h，将hplc
‑
elsd检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，经半制备hplc
‑
elsd后最终得到金线莲苷纯品。
65.在此条件下，金线莲苷的提取率为90.99
±
2.66％。
66.实施例4
67.本实施例提供了一种用于提取金线莲苷的深度共熔溶剂，所述深度共熔溶剂的制备方法按如下步骤进行：将氯化胆碱和苹果酸置于真空干燥箱60℃干燥24h，按照1∶1摩尔比称取氯化胆碱和苹果酸，混合均匀，80℃加热搅拌4后得到澄清均一的液体，将其置于60℃真空干燥箱中干燥12h，冷却至室温，无固体析出，即得到深度共熔溶剂。
68.本实施例还提供了一种基于深度共熔溶剂的柱提取法提取金线莲苷的方法，采用上述深度共熔溶剂作为提取溶剂，包括以下步骤：
69.1、原料的预处理：将干燥的金线莲材料粉碎，过筛，取20目筛下、60目筛上金线莲干燥粉末，4℃保存备用；
70.2、深度共熔溶剂
‑
水溶液的制备：向制备好的深度共熔溶剂中加入适量蒸馏水，搅拌均匀，调整含水量为40％(w/w)；
71.3、成分溶解：准确称取一定质量的金线莲粉末于烧杯中，加入4倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，混合均匀，室温下静置3h；
72.4、洗脱：按照径高比1∶10将其装入层析柱，以1.0bv/h的流速进行洗脱，收集1.5bv洗脱液。
73.5、纯化：步骤4得到的洗脱液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸(8:2:0.2)洗脱并分段收集洗脱液，洗脱流速为1.0bv/h，将hplc
‑
elsd检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，经半制备hplc
‑
elsd后最终得到金线莲苷纯品。
74.图1为金线莲苷的tlc分析结果图；其中，条带1为金线莲苷标准品，条带2为本发明方法获得的金线莲苷纯品。
75.图2为本发明方法获得的金线莲苷的hplc
‑
elsd分析结果图。
76.图3为本发明方法获得的金线莲苷的高分辨质谱分析结果图。
77.在此条件下，金线莲苷的提取率为98.06
±
1.36％。
78.实施例5
79.本实施例提供了一种基于深度共熔溶剂的超声提取法提取金线莲苷的方法，采用实施例4制备的深度共熔溶剂作为提取溶剂，包括以下步骤：
80.1、原料的预处理：将干燥的金线莲材料粉碎，过筛，取20目筛下、60目筛上金线莲干燥粉末，4℃保存备用；
81.2、深度共熔溶剂
‑
水溶液的制备：向制备好的深度共熔溶剂中加入适量蒸馏水，搅拌均匀，调整含水量为40％(w/w)；
82.3、成分溶解：准确称取一定质量的金线莲粉末于烧杯中，加入6倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，50℃超声提取60min，提取功率为280w；
83.4、纯化：步骤3得到的洗脱液真空浓缩，将浓缩液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸(8:2:0.2)洗脱并分段收集洗脱液，洗脱流速为1.0bv/h，将hplc
‑
elsd检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，经半制备hplc
‑
elsd后最终得到金线莲苷纯品。
84.在此条件下，金线莲苷的提取率为86.42
±
2.08％。
85.实施例6
86.本实施例提供了一种基于深度共熔溶剂的超声提取法提取金线莲苷的方法，采用实施例4制备的深度共熔溶剂作为提取溶剂，包括以下步骤：
87.1、原料的预处理：将干燥的金线莲材料粉碎，过筛，取20目筛下、60目筛上金线莲干燥粉末，4℃保存备用；
88.2、深度共熔溶剂
‑
水溶液的制备：向制备好的深度共熔溶剂中加入适量蒸馏水，搅拌均匀，调整含水量为30％(w/w)；
89.3、成分溶解：准确称取一定质量的金线莲粉末于烧杯中，加入10倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，40℃超声提取120min，提取功率为320w；
90.4、纯化：步骤3得到的洗脱液真空浓缩，将浓缩液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸(7:3:0.2)洗脱并分段收集洗脱液，洗脱流速为3.0bv/h，将hplc
‑
elsd检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，经半制备hplc
‑
elsd后最终得到金线莲苷纯品。
91.在此条件下，金线莲苷的提取率为85.59
±
1.88％。
92.实施例7
93.本实施例提供了一种基于深度共熔溶剂的超声提取法提取金线莲苷的方法，采用实施例4制备的深度共熔溶剂作为提取溶剂，包括以下步骤：
94.1、原料的预处理：将干燥的金线莲材料粉碎，过筛，取20目筛下、60目筛上金线莲干燥粉末，4℃保存备用；
95.2、深度共熔溶剂
‑
水溶液的制备：向制备好的深度共熔溶剂中加入适量蒸馏水，搅拌均匀，调整含水量为60％(w/w)；
96.3、成分溶解：准确称取一定质量的金线莲粉末于烧杯中，加入16倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，60℃超声提取40min，提取功率为200w；
97.4、纯化：步骤3得到的洗脱液真空浓缩，将浓缩液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸(5:5:0.2)洗脱并分段收集洗脱液，洗脱流速为2.0bv/h，将hplc
‑
elsd检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，经半制备hplc
‑
elsd后最终得到金
线莲苷纯品。
98.在此条件下，金线莲苷的提取率为83.36
±
1.56％。
99.实施例8
100.本实施例提供了一种基于深度共熔溶剂的超声提取法提取金线莲苷的方法，采用实施例4制备的深度共熔溶剂作为提取溶剂，包括以下步骤：
101.1、原料的预处理：将干燥的金线莲材料粉碎，过筛，取20目筛下、60目筛上金线莲干燥粉末，4℃保存备用；
102.2、深度共熔溶剂
‑
水溶液的制备：向制备好的深度共熔溶剂中加入适量蒸馏水，搅拌均匀，调整含水量为20％(w/w)；
103.3、成分溶解：准确称取一定质量的金线莲粉末于烧杯中，加入12倍体积(g/ml)的深度共熔溶剂
‑
水溶液，70℃超声提取30min，提取功率为240w；
104.4、纯化：步骤3得到的洗脱液真空浓缩，将浓缩液干法上样于硅胶柱，用乙酸乙酯/乙醇/乙酸(8:2:0.2)洗脱并分段收集洗脱液，洗脱流速为1.0bv/h，将hplc
‑
elsd检测金线莲苷含量大于80％的洗脱液合并再进行真空冷冻干燥，经半制备hplc
‑
elsd后最终得到金线莲苷纯品。
105.在此条件下，金线莲苷的提取率为80.92
±
3.34％。
106.对比例
107.下面结合对比例与实施例进一步说明本发明的实用价值。
108.原料预处理方法与实施例中相同，向等量的金线莲粉末中加入等体积的提取溶剂，对比例1
‑
4采用超声提取法对金线莲苷进行提取，其中，对比例3的提取溶剂深度共熔溶剂与实施例4中所制备的深度共熔溶剂相同，对比例4的提取溶剂深度共熔溶剂
‑
水溶液(des
‑
水溶液)与实施例4中的相同。对比例5
‑
6采用柱提取法对金线莲苷进行提取，其提取步骤与实施4相同，不同之处在于提取溶剂分别为水和80％乙醇，不同的提取方法及条件具体如表1所示：
109.表1不同提取方法及条件
[0110][0111]
对比例1
‑
5和本发明实施例1
‑
8中所述提取方法和条件下的金线莲苷提取率如表2所示：
[0112]
表2不同提取方法及条件下的金线莲苷提取率
[0113][0114][0115]
综上所述，根据本发明所述方法制备的深度共熔溶剂相较于传统提取溶剂安全无毒，对金线莲苷具有高效的提取效果，可适用于金线莲中金线莲苷的提取，且采用的柱提取法与超声提取法相比，提取效率高，操作条件温和，是一种优异的提取方法。
[0116]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。