靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用与流程

靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于嵌合抗原受体细胞领域，涉及一种双特异性靶向人claudin18.2(cldn18.2)和nkg2dl的双特异性嵌合抗原受体的氨基酸编码序列、及其修饰的免疫应答细胞，以及它们的制备方法和在药物制备中的应用。


背景技术：

2.随着生物技术的飞速发展，免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法。
3.癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫结合点阻断治疗等。其中，在细胞治疗领域，car-t疗法无疑已成为研究机构和制药公司争相“追捧”的明星。
4.car-t(chimeric antigen receptor t-cell，嵌合抗原受体修饰的t细胞)为代表的免疫疗法，其原理主要是通过基因工程手段对病人自身提取的t细胞进行嵌合抗原受体的修饰形成car-t细胞，该t细胞能特异性地识别肿瘤表面相关抗原(肿瘤细胞标志物)，从而靶向杀伤肿瘤。
5.近年研究表明，nkg2dl蛋白的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标，其在健康组织中很少有表达或仅短暂地表达，而通常在不同来源的各种肿瘤细胞表面有较高水平的表达。nkg2dl蛋白的受体为nkg2d，研究显示，nkg2d-nkg2dl系统在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用，nkg2d通过识别肿瘤细胞表面产生的nkg2dl来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。除此之外，研究发现自身免疫性疾病患者的血清中含有可溶性nkg2dl，nkg2d-nkg2dl系统在治疗自身免疫性疾病、抗炎、抗衰老等方面起到一定作用(参见legroux l等人，frontiers in immunology，(2019))。因此，nkg2dl的表达作为机体发生肿瘤时肿瘤细胞上的一个特异性的改变，为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，为相关新疗法和药物的开发提供了启示。
6.此外，有研究表明，紧密连接蛋白claudin是一种四次跨膜蛋白，nh2端和cooh端位于胞内，具有两个胞外环，迄今为止一共发现了27个家族成员。claudin18.2是claudin家族中在上皮紧密连接处表达的四次跨膜蛋白，是细胞紧密连接的重要分子，其构成了细胞旁屏障，控制细胞间分子流动。claudin18.2是一个高度特异性的细胞表面分子，在正常的组织中仅表达在分化的胃粘膜上皮细胞上，使得开发针对claudin18.2的治疗性抗体具有更大的抗癌潜力、更低的毒性，有更大的最佳用药剂量空间。claudin18.2蛋白在胃癌、胰腺癌、卵巢癌、胆管癌和肺腺癌等实体瘤中高表达(参见sahin等人，clinical cancer research(2008))。另外据专家披露，claudin18.2高表达的肿瘤往往不表达pd-l1，对pd-l1靶向的免疫抑制药物不敏感，因此是一个临床需求高度未被满足的领域。claudin18.2在正常组织中的独特表达谱，以及在多种肿瘤中的异常表达情况使其成为了非常有吸引力的抗癌治疗靶标。同时claudin18.2作为细胞膜表面蛋白，暴露的胞外结构允许抗体的结合，这些特点表明claudin18.2是一个理想的治疗性靶点。
7.综上所述，我们构建了基于cldn18.2-nkg2dl系统的激活性靶标claudin18.2和nkg2dl及其突变肽作为靶向肿瘤区域的双特异性嵌合抗原受体修饰的新型高特异性杀伤力的免疫应答细胞用于肿瘤的治疗。


技术实现要素：

8.鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明的目的是为了克服现有肿瘤临床技术中面临的肿瘤内环境中效应细胞杀死肿瘤细胞的特异性不强和杀伤效率不高的问题，提供靶向人claudin18.2和nkg2dl的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体、靶向人claudin18.2和nkg2dl的双特异性嵌合抗原受体或其功能性变体、及其编码核苷酸序列和其表达载体、工程化的靶向人claudin18.2和nkg2dl的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其应用。本发明的工程化的靶向人claudin18.2和nkg2dl的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞能够提高肿瘤细胞的特异性杀伤效率，避免脱靶带来的治疗毒性安全问题，可增强与肿瘤细胞的结合，从而提供了一种具有应用前景的肿瘤治疗的新手段。
9.技术方案
10.一种双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于所述的免疫细胞含有嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列为：
11.从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人claudin18.2和nkg2dl的胞外识别结构域氨基酸序列、铰链区氨基酸序列、跨膜结构域氨基酸序列、胞内信号结构域的氨基酸序列；
12.或从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人claudin18.2和nkg2dl胞外识别结构域氨基酸序列、铰链区氨基酸序列、跨膜结构域氨基酸序列、胞内信号结构域的氨基酸序列；
13.所述靶向结合人claudin18.2的胞外识别结构域氨基酸序列为：seq id no.2或seq id no.3所示的结合cldn18.2的氨基酸序列；或与所示seq id no.2或seq id no.3氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
14.所述靶向结合人nkg2dl的胞外识别结构域氨基酸序列为：seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9所示的靶向结合人nkg2dl蛋白的人nkg2d的氨基酸序列；或与所示seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
15.其中所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；
16.所述的免疫细胞，其特征在于：
17.编码所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的核酸分子，包括从5’到3’依次串联连接的编码所述引导序列的核苷酸序列、编码所述靶向结合人nkg2dl的人nkg2d蛋白受体核苷酸序列、编码靶向结合人claudin18.2的胞外识别结构域的核苷酸序列、编码铰链区的核苷酸序列，编码所述跨膜结构域的核苷酸序列、编码所述胞内信号结构域的核苷酸序列；
18.或编码所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的核酸分
子，包括从5’到3’依次串联连接的编码所述引导序列的核苷酸序列、编码靶向结合人claudin18.2的胞外识别结构域的核苷酸序列、编码靶向结合人nkg2dl的人nkg2d蛋白受体的核苷酸序列、编码铰链区的核苷酸序列，编码所述跨膜结构域的核苷酸序列、编码所述胞内信号结构域的核苷酸序列；
19.一种双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的重组载体或表达质粒，其特征在于包含所述的核酸分子。
20.所述重组载体或表达质粒，其特征在于重组载体或表达质粒含有启动子，其中所述启动子包括ef1α长启动子，或efs短启动子。
21.一种重组病毒，其特征在于包括所述的重组载体的核苷酸序列和病毒颗粒；所述病毒包括慢病毒、腺病毒、腺联病毒或逆转录病毒。
22.所述的免疫细胞在制备抗胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肠癌、肺癌、或乳腺癌药物中的应用。
23.具体说明
24.第一方面，本技术提供了一种双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体。
25.所述靶向结合人claudin18.2的氨基酸序列为：seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列；或与所示seq id no.2或seq id no.3氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
26.所述靶向结合人nkg2dl的人nkg2d蛋白受体或其功能性变体(类似物)，其包含选自下组的序列：seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9所示的氨基酸序列，或在一处或多处氨基酸修饰产生的功能性变体；其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9所示氨基酸序列具有80～99％同源性的多肽。
27.发明人经过创造性劳动，不断地进行氨基酸序列设计以及序列的排列组合和筛选，对百余条car分子的序列进行随机筛选试验和靶向性功能验证(例如构建病毒载体，以及进一步感染t细胞，获得修饰的t细胞，并检测所得修饰的t细胞的体外活性等试验)，之后根据多个随机组合的结果比对，再进行序列调整，最终筛选出效果最好的序列，获得了本发明的高效价靶向结合人nkg2dl的人nkg2d蛋白受体氨基酸序列及其功能性变体。
28.发明人经过创造性劳动，不断地进行氨基酸序列设计以及序列的排列组合和筛选，利用软件分析其生物学特性，挑选出稳定性好，结合力高的高效价cldn18.2的氨基酸序列及其功能性变体。
29.在某些非限制性实施方式中，双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体还可包含连接氨基酸序列为式(ggggs)n表示的结构，其中3≤n≤8。
30.第二方面，本技术提供了一种双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体，其包含从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人claudin18.2和靶向结合人nkg2dl的人nkg2d蛋白受体氨基酸序列、铰链区的氨基酸序列，所述跨膜结构域的氨基酸序列、所述胞内信号结构域的氨基酸序列。所述靶向结合人nkg2dl的胞外识别结构域的氨基酸序列包含本技术第一方面所述的靶向结合人nkg2dl的人nkg2d蛋白受体或其功能性变体。
31.胞外识别结构域(还称作胞外域或简单地由其含有的识别元件组成)包含特异性结合靶细胞的细胞表面上存在的分子的识别元件。
32.在一些非限制性实例中，前导序列共价连接到细胞外抗原结合结构域的5’末端。
33.在一些实施方式中，所述双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体包括铰链区。
34.在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括跨膜区。
35.在一些实施方式中，所述铰链区的人cd8多肽的氨基酸序列选自seq id no.10所示的多肽或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与seq id no.10所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
36.在一些实施例中，所述跨膜区的人cd8的氨基酸序列选自seq id no.11所示的多肽或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与seq id no.11所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
37.在一些实施例中，所述跨膜区的人cd28的氨基酸序列选自seq id no.12所示的多肽或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与seq id no.12所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
38.在一些实施方式中，所述人4-1bb胞内结构域选自：具有如seq id no.13所示氨基酸序列的多肽；或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与seq id no.13所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
39.在一些实施方式中，所述人cd28胞内结构域选自：具有如seq id no.14所示氨基酸序列的多肽；或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与seq id no.14所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
40.在一些实施方式中，所述人ox40胞内结构域选自：具有如seq id no.15所示氨基酸序列的多肽；或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与seq id no.15所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
41.在一些实施方式中，所述cd3ζ胞内结构域选自：具有如seq id no.16所示氨基酸序列的多肽；或经过氨基酸修饰的功能性变体。其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与seq id no.16所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
42.在一些非限制性实施方式中，所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；
43.在一些非限制性实施方式中，双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体是重组表达或由载体表达。
44.在某些非限制性的实施方式中，本技术的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区，其包含至少一个可提供最佳淋巴细胞活化的共刺激配体分子。
45.在某些非限制性实施方式中，双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体还可包含将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔区(spacer)。间隔区可以是足够柔性的，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，以利于抗原识别。间隔区可以是来自igg1的铰链区、或免疫球蛋白的ch2ch3区和cd3的部分。
46.在某些非限制性实施方式中，双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原
受体的细胞内结构域可包含可激活或刺激细胞(例如，淋巴谱系的t细胞)的人cd3ζ多肽。
47.在某些非限制性的实施方式中，双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体(car)的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区，其包含至少一个可提供最佳淋巴细胞活化的共刺激分子。本文使用的“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。至少一个共刺激信号传导区可包含cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)，或其组合。
48.在一些实施方式中，car的细胞内结构域的共刺激信号传导区包含两种共刺激分子：cd28和4-1bb、4-1bb和ox40或cd28和ox40。
49.第三方面，本技术提供了一种编码第二方面所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的核酸分子，所述核酸分子包含从5’到3’依次串联连接的编码引导序列的核苷酸序列、编码靶向结合人claudin18.2的scfv和靶向结合人nkg2dl的人nkg2d蛋白的核苷酸序列、编码跨膜结构域的核苷酸序列、编码胞内信号结构域的核苷酸序列。
50.在一些实施方式中，所述核酸分子还包含编码铰链区的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；
51.编码靶向结合人nkg2dl的细胞外识别结构域的多核苷酸可以通过密码子优化进行修饰。密码子优化可以改变天然存在的和重组的基因序列，以在任何给定的表达系统中实现最高可能水平的生产力。
52.第四方面，本技术提供了一种包含本技术第二方面的嵌合抗原受体或本技术第三方面的核酸的重组载体或表达质粒。
53.免疫应答细胞(例如，t细胞、ctl细胞、nk细胞)的基因修饰可以通过用重组dna或rna构建体转导基本上同源的细胞组合物来实现。在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体(例如，γ逆转录病毒或慢病毒)，其可将dna或rna构建体导入宿主细胞基因组。例如双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的多核苷酸可以克隆到逆转录病毒载体中，并且可以从其内源启动子、逆转录病毒长末端重复序列或从替代的内部启动子驱动表达。
54.也可使用非病毒载体或rna。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如使用核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶(talen)、锌指核酸酶(zfn)和/或规律成簇间隔短回文重复(crispr)或转基因表达(例如使用天然或化学修饰的rna))。
55.在一些实施方式中，所述载体选自γ-逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺联病毒载体。
56.在一示例性实施方式中，所述载体是γ-逆转录病毒载体。
57.第五方面，本技术提供了一种重组病毒，其是能够表达本发明第二方面所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体、且能够侵染免疫应答细胞的病毒。
58.在一些实施方式中，所述免疫应答细胞为细胞毒性t淋巴细胞、nk细胞、nkt细胞、辅助性t细胞或巨噬细胞。
59.在示例性实施方式中，所述免疫应答细胞为细胞毒性t淋巴细胞。
60.在一些实施方式中，所述病毒为慢病毒、腺病毒、腺联病毒或逆转录病毒等。
61.在一示例性实施方式中，所述病毒为慢病毒。
62.在一示例性实施方式中，所述病毒为逆转录病毒。
63.第六方面，本技术提供了一种分离的修饰的免疫应答细胞，其包含本技术第二方面所述的嵌合抗原受体，其由本技术第三方面所述的重组载体或表达质粒转化所得。
64.对于细胞的初始基因修饰以提供所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞，通常使用逆转录病毒载体进行转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于细胞的后续基因修饰以提供包含含有至少两种共刺激配体的抗原递呈复合物的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样证明是有效的。逆转录病毒载体和合适的组装线的联合也是合适的，其中衣壳蛋白对于感染人细胞是有功能的。
65.在一些实施方式中，所述免疫应答细胞还包含至少一种外源的共刺激配体。
66.可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞的直接共培养。转导病毒载体可用于在免疫应答细胞中表达共刺激配体(例如4-1bbl)。优选地，选择的载体表现出高的感染效率和稳定的整合和表达。
67.在一些实施方式中，优选地，所述至少一种共刺激配体选自4-1bbl、cd80、cd86、cd70、ox40l、cd48、tnfrsf14及其组合，或更优选地，所述共刺激配体是4-1bbl。
68.在一些实施方式中，所述免疫应答细胞选自t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞，优选t细胞和自然杀伤(nk)细胞，更优选为t细胞。
69.可以利用用于car表达的载体转导从患者分离的多个t细胞亚群。
70.在一示例性实施例中，其中所述修饰的免疫应答细胞为car-t细胞。
71.可以利用所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体制备遗传修饰的中央记忆t细胞，然后冷藏保存。
72.第七方面本技术提供了本技术的第六方面的分离的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞的制备方法，包括以下步骤：
73.首先，将第三方面所述的核酸分子，通过分子克隆的方式连接到表达载体中，获得所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的表达载体；
74.然后，将获得的所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体表达载体转染293t细胞，获得病毒液；
75.最后用所述病毒液感染免疫应答细胞，从感染后的细胞中获得表达所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞。
76.在一些非限制性实施方式中，本发明修饰的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。所述淋巴谱系的细胞选自b、t和自然杀伤(nk)细胞，提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物质的检测、对宿主外源细胞的检测等功能。淋巴谱系的细胞的非限制性实例包括t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、巨噬细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可分化成淋巴样细胞的多能干细胞)。
77.在一些实施方式中，所述免疫应答细胞选自t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞，优选t细胞或自然杀伤(nk)细胞。
78.在一些实例性实施方式中，t细胞是在胸腺中成熟的淋巴细胞，并且主要负责细胞介导的免疫。t细胞参与获得性免疫系统。
79.在一些非限制性实施方式中，t细胞包括但不限于t辅助细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞(包括中心记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞(或干样记忆t细胞)和两种类型的效应记忆t细胞(例如，tem细胞和temra细胞)、调节性t细胞(也称为抑制性t细胞)、自然杀伤t细胞、粘膜相关恒定t细胞、和γδt细胞。在一些实施方式中，表达car的t细胞表达foxp3以实现和维持t调节表型。
80.在一些实施方式中，至少一种共刺激配体选自4-1bbl、cd80、cd86、cd70、ox40l，及其组合。在一个实施方式中，共刺激性配体是4-1bbl。
81.在一优选实施例中，所述分离的修饰的免疫应答细胞为t细胞。
82.在一优选实施例中，所述分离的修饰的免疫应答细胞为自然杀伤(nk)细胞。
83.在一些非限制性实施方式中，所述分离的修饰的免疫应答细胞(例如t细胞)可以是自体的、非自体的(例如同种异体的)、或在体外衍生自工程化的祖细胞或干细胞。
84.第八方面，本技术提供了一种药物组合物，其包含有效量如本发明第六方面所述分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。
85.本发申请公开的药物组合物，其包含表达所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的载体。
86.所述药物组合物的施用可以是自体的或非自体的。例如，表达所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的免疫应答细胞和包含它的组合物可以从一个受试者获得，并施用于相同受试者或不同的相容受试者。可以通过包括导管给药、静脉内注射或胃肠外给药来施用本发明公开主题的外周血来源的t细胞或其子代(例如，体内、离体或体外衍生的)。当施用本发明公开主题的药物组合物(例如包含所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浊液、乳浊液)。
87.本技术的组合物可以是制剂。本技术公开的表达所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体(car)的免疫应答细胞和包含其的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浊液、乳浊液、分散液或粘性组合物，其可以缓冲至选定的ph。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是包含例如水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)和合适的其混合物的溶剂或分散介质。
88.可以加入增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。
89.根据本技术，使用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与表达本发明公开主题的所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体(car)的免疫应答细胞相容。
90.如果需要，组合物的粘度可以使用药学上可接受的增稠剂保持在选定的水平。合适的载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液、悬浊液、凝胶或另一液体形式，比如时间释放形式或液体填充形式)。
91.第九方面，本技术提供了一种用于治疗或预防疾病的试剂盒，其包含本发明第六
方面所述的免疫应答细胞或本发明第三方面所述的核酸。
92.第十方面，本技术提供了本发明第一方面所述的靶向结合人claudin18.2以及靶向结合人nkg2dl的人nkg2d蛋白受体或其功能性变体、第二方面所述的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体、第四方面所述重组载体或表达质粒，第六方面所述重组病毒、第七方面所述的分离的修饰的免疫应答细胞，第九方面所述的试剂盒在治疗，或预防疾病、不适或健康失调的产品中的应用。
93.在一些实施方式中，所述治疗或预防的疾病包括抗肿瘤、抗衰老、自身免疫疾病、抗菌等疾病。
94.作用原理
95.本发明的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞，该工程细胞通过识别肿瘤细胞表面抗原claudin18.2和nkg2dl来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用(如图1所示)；靶向claudin18.2和nkg2dl的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞能够提高对肿瘤细胞的特异性杀伤效率，避免脱靶带来的治疗毒性安全问题，可增强与肿瘤细胞的结合，从而提供了一种具有应用前景的肿瘤治疗的新手段。
96.有益效果
97.本发明利用嵌合抗原受体修饰t细胞技术来制备双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体修饰的工程免疫细胞，该制备方法步骤简单，获得的新型工程免疫细胞能特异识别肿瘤细胞，能更有效地靶向攻击肿瘤细胞，对肿瘤的杀伤率高，并且可以用于制备抗肿瘤的产品，尤其是用于制备治疗cldn18a2和nkg2dl阳性的肿瘤；本发明的特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl嵌合抗原受体修饰的工程免疫细胞增强与肿瘤细胞的结合，从而明显提高工程化免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。本发明可有望用于制备抗肿瘤的产品，尤其是用于制备抗胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肠癌、肺癌、或乳腺癌药物，具有良好的产业应用前景。
附图说明
98.图1显示了本发明kd-496工程细胞的car的工作模式示意图，其中a为cldn18.2-nkg2d-car，b为nkg2d-cldn18.2-car。
99.图2为实施例1中的嵌合抗原受体各部分的连接顺序的示意图，a为kd-182，b为kd-025，c为kd-496。
100.图3显示了本发明的嵌合抗原受体中靶向结合人nkg2dl的蛋白受体人nkg2d蛋白二级结构图，所示的a-f分别为发明人根据人nkg2d的氨基酸序列的胞外区，利用软件分析其特性，即以nkg2d与其配体nkg2dl组成复合物的晶体结构为基础，通过丙氨酸扫描，首先获取到影响亲和力的关键位点的氨基酸，然后进行单点突变的饱和突变，根据这个饱和突变的结果，进行多点突变的计算挑选出的稳定性好，配体结合力高的6条序列的二级结构图。
101.图4为实施例3中t细胞纯度流式细胞检测结果。
102.图5为实施例4中kd-496car-t细胞体外表达检测实验结果。
103.图6为实施例5中kd-496病毒感染293t细胞后的表达检测实验结果。其中，a为
nkg2d的表达，b为cldn18.2抗体scfv的表达。
104.图7为实施例6中kd-496-1 car-t细胞体外杀伤实验结果，其中a为kd-496-1 car-t细胞对nugc4细胞的杀伤，b为kd-496-1 car-t细胞对ags-18.2细胞的杀伤，c为kd-496-1 car-t细胞对mkn28-18.2细胞的杀伤。
105.图8为实施例7中kd-496-1 car-t细胞体外细胞因子ifn-γ释放实验结果，其中a为elisa检测标准曲线，b为细胞因子ifn-γ释放柱形图。
106.图9为实施例8中kd-496-1 car-t细胞治疗人源肿瘤小鼠移植模型(pdx)实验结果，其中a为pdx模型人源肿瘤组织抗原表达，b为kd-496car-t细胞小鼠体内药效实验。
107.图10为实施例9中kd-496-1 car-t在小鼠体内的安全性实验，其中a为小鼠脏器he染色图片，b为小鼠生存率。
具体实施方式
108.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术员通常理解的含义。
109.术语“功能性变体”，是母体结构经过修饰得到的术语“功能性变体”是指与母体具有相同或相近的生物学功能和性质如与母体具有相同靶向结合功能的结构的变体。作为非限制性的实例，“功能性变体”可以通过在母体中进行一处或多处保守型取代获得。本技术中功能性变体是，在人nkg2dl的受体(人nkg2d氨基酸序列)的基础上修饰产生的与人nkg2dl靶标结合的结构，以及在claudin18.2氨基酸序列的基础上修饰产生的与人claudin18.2靶标结合的结构。
110.术语“类似物”是指结构相关的多肽，其具有参照多肽分子的功能。在本技术中，指与人nkg2d氨基酸序列结构相关的，并具有与人nkg2dl靶向结合的多聚氨基酸结构；以及与claudin18.2氨基酸序列结构相关的，并具有与人claudin18.2靶向结合的多聚氨基酸结构。
111.术语“氨基酸修饰”是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的本公开的car(例如，细胞外识别结构域)的结合特征的保守氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。
112.术语“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被相同组内的氨基酸替代的取代。
113.术语“同源性”：指目标氨基序列或目标核苷酸序列与参考序列比较显示的氨基酸或核苷酸的高比例匹配性。本文中的同源性可使用标准软件如blast或fasta确定。
114.术语“嵌合抗原受体(car)”：嵌合抗原受体包括引导肽部分、细胞外靶标识别结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
115.car可以既结合抗原又转导t细胞激活的功能，其不依赖于mhc限制。因此，car是“通用”免疫抗原受体，其可以治疗具有抗原阳性肿瘤的患者群体，不论其hla基因型如何。使用表达肿瘤特异性car的t淋巴细胞的过继性免疫疗法可以是用于治疗癌症的强大治疗策略。
116.术语“识别”是指选择性结合靶标。本文使用的术语“特异性结合”或“特异性结合到”或“特异性靶向”是指多肽或其片段识别并结合目的生物分子(例如多肽)，但其基本上不识别结合样品中的其他分子，例如天然地包括本发明多肽的生物样品中的其他分子。
117.术语“特异性结合”是指两个分子(例如配体和受体)之间的结合，其特征是甚至在存在许多其他不同分子时，一种分子(配体)与另一种特异分子(受体)结合的能力，即在分子的异质混合物中显示一种分子对另一分子的优先结合的能力。配体与受体的特异性结合也如下被证明：存在过量未标记的配体时，经可检测标记的配体与受体的结合降低(即结合竞争实验)。
118.术语“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。
119.术语“载体”是指任何遗传元件，比如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等，其当关联有适当的控制元件时能够复制，并且其可以将基因序列转移到细胞中。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体和质粒载体。
120.术语“表达载体”是指一种重组核酸序列，即重组dna分子，其含有期望编码序列和在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的适当的核酸序列。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选的)和核糖体结合位点，通常伴随其它序列。已知真核细胞利用启动子、增强子和终止子及聚腺苷酸化信号。
121.本文使用的术语“免疫应答细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞、或其祖细胞、或其子代细胞。
122.术语“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的免疫细胞。
123.本文使用的术语“调节”是指正或负地改变。
124.本文使用的术语“外源的”是指并非内源性存在于细胞中或不以足以达到过表达时获得的功能性效果的水平存在的核酸分子或多肽。因此，术语“外源的”将包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。
125.本文使用的术语“外源核酸分子或多肽”是指并非正常存在于细胞中或由细胞获得的样品中的核酸分子(例如，cdna、dna或rna分子)或多肽。该核酸可以来自另一生物体，或者其可以是例如细胞或样品中并非正常表达的mrna分子。
126.以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
127.实施例1双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的表达质粒
128.总体设计如下：
129.1、双特异性靶向claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的氨基酸序列的确定
130.首先，从美国国立医学图书馆(ncbi)的genbank数据库中搜索到人nkg2d的全长氨基酸序列(np_031386.2)，claudin18.2的全人氨基酸序列号为：np_001002026.1。将人claudin18.2蛋白免疫小鼠后纯化得到其抗体片段并进行人源化，获得人源化抗人claudin18.2的单链抗体(scfv)；单链抗体由重链和轻链组成，重链与轻链之间的连接片段是(g4s)3，最终经过效果筛选获得了与靶抗原claudin18.2亲和力高的4条scfv抗体片段，其中2条氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示。
131.其次，构建双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体，即确定嵌合抗原受体分子的氨基酸序列：
132.自氨基端到羧基端，由引导肽的氨基酸序列(如seq id no.1所示)、靶向人claudin18.2的抗体scfv氨基酸序列(如seq id no.2或seq id no.3)、人nkg2d氨基酸序列
(如seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9所示)、人cd8铰链区的氨基酸序列(如seq id no.10所示)、人cd8跨膜区的氨基酸序列(如seq id no.11所示)或人cd28跨膜区的氨基酸序列(如seq id no.12所示)、人4-1bb胞内结构域的氨基酸序列(如seq id no.13所示)或人cd28胞内结构域的氨基酸序列(如seq id no.14所示)或人ox40胞内结构域的氨基酸序列(如seq id no.15所示)或两者组合、人cd3ζ结构域的氨基酸序列(如seq id no.16所示)依次串联而成(如图2)；
133.图3所示的a-f分别为发明人根据人nkg2d的氨基酸序列的胞外区，利用软件分析其特性，即以nkg2d与其配体nkg2dl组成复合物的晶体结构(pdb号码：4s0u)为基础，通过丙氨酸扫描，首先获取到影响亲和力的关键位点的氨基酸，然后进行单点突变的饱和突变，根据这个饱和突变的结果，进行多点突变的计算挑选出的稳定性好，配体结合力高的6条序列的二级结构图；
134.密码子优化的序列包括：编码引导序列的核苷酸序列、编码claudin18.2的核苷酸序列、编码人nkg2d序列的核苷酸序列、编码人cd8铰链区的核苷酸序列、编码人cd8或cd28跨膜区的核苷酸序列、编码人4-1bb或cd28或ox40胞内结构域的核苷酸序列、编码cd3ζ结构域的核苷酸序列。
135.表1为不同的靶向人claudin18.2的氨基酸序列和nkg2d的氨基酸序列(seq id no.5，参照专利cn112142854b中效果最好的一条nkg2d序列)组合时，按照下述的方法所构建的载体、获得的病毒和获得相应的car-t细胞，并按照下述方法检测的car表达；结果表明：人claudin18.2抗体scfv氨基酸序列(如seq id no.2或seq id no.3所示)和nkg2d(如seq id no.5所示)组合时，car表达最佳，可作为后续的活性验证实验。
136.表1为不同序列组合car的表达
[0137][0138][0139]
2、表达双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体分子质粒的构建
[0140]
本发明选用步骤1中的一条car序列，其命名为kd-496-1(氨基酸序列如seq id no.17所示，核苷酸如seq id no.19所示)和kd-496-2(氨基酸序列如seq id no.18所示，核苷酸如seq id no.20所示)完成后续实施例的药效验证试验，其具体序列如下：
[0141]
由引导肽的氨基酸序列(如seq id no.1所示)、claudin18.2的抗体scfv氨基酸序列(如seq id no.2或seq id no.3所示)、人nkg2d氨基酸序列(如seq id no.5所示)、人cd8铰链区的氨基酸序列(如seq id no.10所示)、人cd8跨膜区的氨基酸序列(如seq id no.11
所示)、人4-1bb胞内结构域的氨基酸序列(如seq id no.13所示)、人cd3ζ结构域的氨基酸序列(如seq id no.16所示)依次串联而成；
[0142]
或
[0143]
由引导肽的氨基酸序列(如seq id no.1所示)、人nkg2d氨基酸序列(如seq id no.5所示)、claudin18.2的抗体scfv氨基酸序列(如seq id no.2或seq id no.3所示)、人cd8铰链区的氨基酸序列(如seq id no.10所示)、人cd8跨膜区的氨基酸序列(如seq id no.11所示)、人4-1bb胞内结构域的氨基酸序列(如seq id no.13所示)、人cd3ζ结构域的氨基酸序列(如seq id no.16所示)依次串联而成；
[0144]
全基因合成双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体分子的核苷酸序列(南京一道生物合成)见seq id no.19或seq id no.20，通过分子克隆的方式连接到慢病毒载体lentiguide-puro(addgene，美国)，构建单一编码框的全长car序列表达框，利用ef1alpha启动子或efs启动子进行表达。
[0145]
具体操作步骤如下：
[0146]
全基因合成双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体分子的核苷酸序列，pcr扩增人工合成car分子序列，经axygen胶回收试剂盒(杭州泽衡)回收，与经过限制性内切酶smai和mlui消化的载体lentiguide-puro(addgene，美国)，进行同源重组连接，形成kd-496-1和kd-496-2表达载体。
[0147]
具体重组连接反应的体系和条件如下：
[0148]
重组连接体系：
[0149]
胶回收的pcr产物5μl，胶回收的smai和mlui酶切lentiguide-puro质粒(addgene，美国)3μl；4x 1402 quickcloning kit(南京基诺美)5μl；去离子水7μl；连接反应体系体积20μl；
[0150]
重组连接条件：将上述反应体系置于50℃水浴中，反应15min后置冰上1min。
[0151]
取10ul重组连接产物经感受态stbl3转化，具体转化操作步骤如下。
[0152]
将5μl连接产物加入到50μl的感受态细胞(stbl3，购买自美国invitrogen公司)中，冰浴30min，42℃45s，冰浴2min，然后加入500μl无抗lb液体培养基后，37℃，200rpm震荡培养40min，涂布氨苄抗性的lb固体平板，在37℃培养箱中过夜。等待单菌落出现后，挑取5个大小适中的菌落，提取质粒，并送往商业测序公司测序，将测序结果与拟合成的核苷酸(即双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的核苷酸)比对证实序列完全正确，证明获得了双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的质粒(kd-496-1和kd-496-2表达质粒)。
[0153]
双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体表达质粒的提取和纯化。
[0154]
将含有kd-496表达质粒的stbl3菌株在lb培养基中大量培养，采用qiagen plasmid midi kit(德国qiagen公司)进行高纯度无内毒素抽提，以备感染。(具体的检测操作过程参见qiagen质粒抽提试剂盒说明书)。
[0155]
实施例2：慢病毒载体的病毒液的制备
[0156]
将实施例1获得的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的重组质粒(kd-496表达质粒)和包装载体pol/gag、rev和vsvg，按照12：10：5：6的比例，用lipofectamine
tm 6000转染试剂(购买自碧云天公司，产品型号为c0526)共转染293t细胞
(具体的转染操作过程参见转染说明书)，转染后6小时更换为完全培养基(购买自hyclone公司，产品型号为sh30243.01)，培养48小时和72小时后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒，获得携带双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的慢病毒载体的病毒液(下面简称kd-496-1和kd-496-2病毒液)。
[0157]
实施例3：t细胞的分离培养
[0158]
取健康供者的新鲜外周血，通过密度梯度离心分离新鲜的外周血单核细胞；再利用偶联了抗-cd3抗体和抗-cd28抗体的顺磁磁珠(购买自美国invitrogen公司，产品信息为human t-activator cd3/cd28)来富集cd3+t细胞，具体来说，将外周血单核细胞稀释至浓度为(10～30)
×
106个单个细胞/ml，再将磁珠与细胞以3:1的比例在培养皿中混合，室温下共孵育2-3小时，利用磁微粒收集器(magnetic particles concentrator，简称mpc，购买自美国invitrogen公司)富集cd3+t细胞。最后将富集的cd3+t细胞重悬于培养基(购买自美国life technologies公司，产品信息为optmizer
tm t-cell expansion sfm)中，调至细胞浓度为1
×
106个/ml，最后在37℃、5％co2培养箱中培养2天，检测结果见图4。
[0159]
实施例4：双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体t细胞(kd-496-1和kd-496-2car-t)的制备
[0160]
首先，取实施例3获得的cd3+t细胞，接种到24孔板，接种浓度为1～10
×
105个细胞/ml，在37℃、5％co2环境培养约24小时(培养时间依据具体实践而定，一般来说，保证在病毒液感染时细胞汇合率介于50-70％之间)。之后，取实施例2收集的kd-496病毒液，按照moi＝10-40的值，一同加入细胞培养瓶后，封好口，放入平角离心机后，低速(500g-1000g/min)离心1小时，然后放入培养箱中37℃培养。感染后48小时后获得双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体t细胞(kd-496car-t)，可以进行下一步的功能实验，如图1所示的是该工程细胞工作示意图，即该工程细胞通过识别肿瘤细胞表面产生的claudin18.2和nkg2dl来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。
[0161]
利用流式细胞术分析检测car蛋白的表达：
[0162]
离心细胞，用pbs清洗两次后重悬于facs液中(含0.1％叠氮化钠和0.4％bsa的pbs)；将anti-cd314抗体(apc-anti-human cd314(nkg2d)，biolegend，320808)加入细胞悬液中，4℃孵育1h，并设置同型对照组(apc mouse igg1，κisotype ctrl antibody，biolegend，400120)；清洗细胞两次后，加入200μl的facs液重悬细胞；bd facscanto ii用于获取染色细胞，flowjo用于分析结果。如图5所示，对照组为感染空载体病毒液的t细胞，几乎检测不到car分子的表达；实验组为感染kd-496-1和kd-496-2病毒液的t细胞，kd-496-1和kd-496-2的claudin18.2抗体scfv的表达率分别为87.6％和70.4％，nkg2d的表达率分别为60.8％和33.7％。
[0163]
实施例5：kd-496与mica、ulbp2/5/6和cldn18.2蛋白结合检测
[0164]
具体操作步骤如下：
[0165]
首先，取293t细胞(atcc，美国)，接种到24孔板，接种浓度为1～10
×
105个细胞/ml，在37℃、5％co2环境培养约24小时(培养时间依据具体实践而定，一般来说，保证在病毒液感染时细胞汇合率介于50-70％之间)。之后，取实施例2收集的kd-496病毒液，按照moi＝10-40的值，感染293t细胞。
[0166]
培养48h后收集细胞，4℃300g离心5min；用pbs清洗两次后重悬于facs液中(含
0.1％叠氮化钠和0.4％bsa的pbs)；将anti-cd314抗体(apc-anti-human cd314(nkg2d)，biolegend，320808)加入细胞悬液中，4℃孵育1h，并设置同型对照组(apc mouse igg1，κisotype ctrl antibody，biolegend，400120)。将一抗mica(mammalian,c-6his，c489)，recombinant human nkg2dl2(c-6his，c508),claudin 18.2 his(cr53)分别加入细胞悬液中，4℃孵育4h，并设置对照组；清洗细胞两次后，加入200μl的facs液重悬细胞；将二抗anti-his-pe加入细胞悬液中，4℃孵育1h；清洗细胞两次后，加入200μl的facs液重悬细胞；bd facscanto ii用于获取染色细胞，flowjo用于分析结果。如图6a所示kd-496-1和kd-496-2病毒液的293t细胞，nkg2d阳性率为98.8％和98.6％，cldn18.2抗体scfv阳性率为94.3％和89.5％；如图6b所示对照组为未感染病毒液的293t细胞，几乎不与mica、ulbp2/5/6、cldn18.2结合；实验组为感染kd-496-1和kd-496-2病毒液的293t细胞，与mica的结合率为95％和93.9％，与ulbp2/5/6的结合率为64％和58％，与cldn18.2的结合率为48.1％和40.4％。
[0167]
实施例6：kd-496-1 car-t细胞体外杀伤实验
[0168]
每一种靶细胞系对应地设置一个实验组和3个对照组，其中，实验组添加的是实施例4所得的特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的car-t细胞的细胞悬液；空白对照组添加的是没有感染病毒的t细胞(即实施例3获得的cd3+t细胞)；kd-019对照组添加的是靶向cd19的car-t细胞(制备方法参照cn109803983b)；kd-025对照组添加靶向人nkg2dl的car-t细胞(制备方法参照cn109803983b)；kd-182对照组添加靶向人claudin18.2的car-t细胞(制备方法参照cn)。
[0169]
首先，按照实施例4方法感染制备kd-019 car-t、kd-025 car-t、kd-182 car-t、kd-496-1 car-t细胞，感染后继续培养72小时后进行杀伤接种，每一种靶细胞系经过cfse荧光染色后，在荧光显微镜下对靶细胞进行计数，调整细胞密度约为2
×
106cells/ml，20μl/孔，接种靶细胞于96孔培养板中；按照效靶比为0.25:1、1:1、4:1加入效应细胞t、kd-019 car-t、kd-025 car-t、kd-182car-t、kd-496-1 car-t细胞；然后将细胞置于37℃温箱培养24h；最后利用7-aad/cfse细胞毒性测试试剂盒(购买自biovision公司，货号：k315-100)，并按照该试剂盒的操作说明书来评估kd-496-1 car-t细胞对上述靶细胞系的杀伤情况。如图7所示，图7a和7b分别是nugc4和ags-18.2细胞的杀伤结果，图7c是mkn28-18.2细胞的杀伤结果，kd-025 car-t和kd-182car-t对肿瘤细胞有一定的杀伤作用；kd-496-1 car-t对nugc4、ags-18.2、mkn28-18.2细胞的杀伤比kd-025 car-t高，与kd-182car-t杀伤相当，后续进行体内药效进一步验证。
[0170]
实施例7：kd-496-1 car-t细胞体外细胞因子释放实验
[0171]
实验设置一个实验组和2个对照组，其中，实验组添加的是实施例4所得的特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的car-t细胞的细胞悬液；空白对照组添加的是没有感染病毒的t细胞(即实施例3获得的cd3+t细胞)；kd-019对照组添加的是靶向cd19的无关car-t细胞。
[0172]
首先，按照实施例4方法感染制备kd-019 car-t、kd-496-1 car-t细胞，感染后继续培养72小时后进行杀伤接种，靶细胞系调整细胞密度约为1.5
×
106cells/ml，20μl/孔，接种靶细胞于96孔培养板中；按照效靶比为5：1加入效应细胞t、kd-019 car-t、kd-496-1 car-t细胞；然后将细胞置于37℃温箱培养24h；最后利用human ifn-γelisa kit ii试剂
盒(购买自bd公司，货号：550612)，并按照该试剂盒的操作说明书来评估kd-496-1 car-t细胞对上述靶细胞系的杀伤细胞因子释放情况。如图8所示，kd-496-1car-t细胞与肿瘤细胞nugc4，以及kd-496-1 car-t细胞与肿瘤细胞共培养后，与对照组相比，inf-γ显著增加，说明kd-496-1 car-t具有很好的抗肿瘤效果。
[0173]
实施例8：kd-496-1 car-t小鼠体内药效实验
[0174]
从手术中取下的人胃癌组织放入15ml离心管，离心管内有10ml组织保存液(l15培养基+1％双抗)，用保温桶加冰袋将样本带回实验室。(组织离体后24h内进行pdx接种)；样本到实验室后，在生物安全柜中进行组织处理，步骤如下：取出离心管内的组织到小皿中(提前在皿内加入l15)，拍照；将样本放到体视显微镜下进行组织边缘修整：(去除肿瘤组织边缘的脂肪，结缔组织等；皿底外部放入2
×
2mm2的黑色卡片，再将处理后的肿瘤组织剪切成均一块状，大小为：2
×2×
2mm3，置于新的含l15培养基的小皿中，并放在冰盒上；在免疫缺陷小鼠(b-ndg)体内接种组织样品，接种组织块大小为：2
×2×
2mm3/块，左位点接种2块；接种方式：皮下接种。如图9a所示，免疫组化ihc结果显示胃癌组织claudin18.2和nkg2dl(mica和ulbp2/5/6)抗原高表达。当肿瘤长到100mm3左右，进行随机分组，每组n＝5，按照实施例4方法感染制备car-t细胞，尾静脉注射car-t细胞，1
×
107cells/100μl，2次/周测量小鼠肿瘤大小，结果如图9b所示，可以看出相比对照组，kd-025、kd-182、kd-496-1对肿瘤具有明显抑制效果。
[0175]
实施例9：kd-496-1 car-t在小鼠体内的安全性实验
[0176]
首先，按照实施例4方法感染制备kd-496-1 car-t细胞，如图10所示为kd-496-1 car-t细胞对小鼠主要脏器和生存周期的影响。从图10可以看出，kd-496-1 car-t细胞不会引起小鼠心、肝、肺、肾等主要脏器发生炎症、水肿和坏死(图10a)，并且对小鼠的生存周期没有任何负面影响(图10b)。
[0177]
总之，本发明所构建的双特异性靶向人claudin18.2和nkg2dl的嵌合抗原受体的病毒载体，以及经其修饰的工程免疫细胞可以应用于治疗多种肿瘤，包括胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肠癌、肺癌、或乳腺癌。