一种从细菌中提取质粒DNA的方法与流程

一种从细菌中提取质粒dna的方法
技术领域
1.本发明涉及技术生物制药技术领域，尤其是一种从细菌中提取质粒dna的方法，可用于从细菌中大规模、连续地提取质粒dna。


背景技术：

2.近年来dna疫苗和以质粒dna为基础模板合成mrna疫苗，及用于基因治疗，细胞治疗等先进技术突飞猛进。在此形势下，对于质粒dna的需求大幅度上升，尤其对于即符合大规模又符合gmp规范生产的质粒dna的需求量旺盛。尽管质粒dna的提取和纯化早在1979年就有了标准的方法，主要包括从原核生物大肠杆菌中提取和纯化质粒dna的三个步骤：使菌体裂解释放质粒dna、从裂解液中粗提取质粒dna、再经过去除杂质纯化出质粒dna。在质粒的提取和纯化步骤中，最重要的部分是细菌细胞的裂解。尽管在这方面已经开发了有很多方法，其中一种最常用的方法是碱裂解法。在碱裂解法提取质粒的过程中，为了将目的质粒dna与细菌的基因组dna和菌体蛋白分离，不可避免地要进行离心。这种方法已经普遍用于了实验小规模的质粒dna纯化。
3.随着核酸疫苗和质粒dna为原料的基因重组药物的快速发展，对重组质粒dna的需求量在不断增加，常规的实验室制备及其方法已很难满足需求。大规模生产质粒dna因为工艺的难度而受到制约。例如，利用中空纤维和板框过滤、膜过滤和化学絮凝沉淀等方法大幅度提高了质粒dna的提取规模，但通过这些方法提取的质粒dna的杂质往往远多于通过离心方法提取的质粒dna，而且还潜在着由化学絮凝物带来的污染的问题。另外一个制约大规模生产的步骤是，裂解反应的时间控制，工业化工艺往往采用在螺旋管中进行特定时间的反应后，即刻与中和液进行终止反应，dna产率低。
4.虽然，也有一些为了满足大规模生产质粒dna的改良方法发表，但在关键步骤中的碱裂解控制和从裂解液中提取出高质量的质粒dna仍然不足，不仅生产的稳定性不强，而且分离效果差，产率低、还不易实现连续的大规模生产要求。从而影响了后期工作的效率，成为了限制核酸疫苗和基因药物研发和技术发展的瓶颈。并且在大规模提取质粒dna的中和混合步骤中，容易产生高剪切力，从而破坏质粒的超螺旋结构，致使提取的质粒dna的质量低下。
5.因此，发明设计一种能够大规模连续地提取质粒dna，并且反应温和、稳定，制备简单，dna产率、质量高，杂质少的方法和设备成为一种必然趋势。


技术实现要素：

6.针对上述目的，本发明的目的是提供一种用于提取细菌中质粒dna的气泡发生装置及从细菌中提取质粒dna的方法，从而能够从细菌中大规模连续地提取dna，并且分离效果好，产率高，质量好，满足了基因药物、病毒类药物、核酸药物和疫苗产品，尤其是核酸疫苗的研发和后期产品大规模生产的需要。
7.本发明提供一种用于提取细菌中质粒dna的气泡发生装置，包括箱体，所述箱体的
一端设有进料口，所述箱体的另一端设有液体收集口；所述箱体内设有至少一个第一气泡发生组件和固液相分离器，所述气泡发生组件用于充分混合混合液，并将其中的渣体和反应液分层，所述混合液为用于提取细菌中的质粒dna中和步骤的混合液；所述混合液由进料口进入箱体，沿水平方向依次流经气泡发生组件和固液相分离器，所述渣体通过固液相分离器引导排出，所述反应液由液体收集口流出。
8.在本发明的优选实施例中，所述固液相分离器包括除渣板和固体排渣口，所述除渣板用于引导所述渣体的流向，所述固体排渣口用于将所述渣体排出。
9.在本发明的具体实施方式中，所述除渣板通过角度可调连接件与所述箱体连接，通过该角度可调节连接件的作用，可根据需要调节除渣板与水平面的夹角调至合适大小，方便易操作，并且易于控制，满足分离不同固液相高度的需要。
10.在本发明的优选实施例中，所述箱体内还设有挡料组件，所述挡料组件设于所述第一气泡发生组件和固液相分离器之间，通过该挡料组件能够调节混合液在气泡发生装置中的反应时间和液面高度，并能促进固液相分离。
11.在本发明的优选实施例中，所述固液相分离器还包括缓冲板，所述缓冲板的一端与所述除渣板连接，所述缓冲板的另一端设于第一气泡发生组件上方。
12.在本发明的优选实施例中，所述缓冲板与水平面成第一夹角设置，所述第一夹角为5～15
°
，通过该设置可以更利于渣体的分离，并有效地防止渣体回流。
13.在本发明的优选实施例中，所述挡料组件与所述箱体之间还设有至少一层滤膜，从而可进一步排除反应液中的杂质。
14.在本发明的具体实施方式中，所述滤膜为3～4层，所述滤膜的孔径大小为80～400目。
15.在本发明的优选实施方式中，所述滤膜底部还设于另第二气泡发生组件，通过该设置不仅可以提高质粒dna溶液过滤效率，同时还可以避免杂质堵塞滤膜；并且此处的气泡可以进一步推动泡沫漂浮物进入到泡沫分离器中，从而提高杂质的去除效果。
16.在本发明的优选实施例中，所述挡料组件包括挡料板和与其连接的支撑板，所述挡料板与水平面成第二夹角设置，所述第二夹角的大小为30～75
°
，通过挡料板与水平面成夹角设置的方式，可使混合液在流经挡料板时起到一定的缓冲作用，混合液流更为温和，更有利于固液相的分离，使用更为方便。
17.在本发明的优选实施例中，所述第二夹角的大小为30～60
°
，在该夹角大小下的挡料板在调节反应时间和液面高度的同时，能够起到更好的缓冲作用。
18.在本发明的优选实施例中，所述箱体内还设有撇渣器，所述撇渣器设于箱体内靠近所述固体排渣口的一端，撇渣器的设置更利于除渣。
19.在本发明的具体实施方式中，所述气泡发生装置为横式气泡发生装置，横式气泡发生器的设置可使用于细菌中质粒dna提取的混合液的流速更为均匀，且规模比较容易放大。
20.优选地，所述气泡发生装置为纳米或微米气泡发生装置，能够使反应更为温和，以气泡方式带动混合，剪切力小，有效保护超螺旋结构质粒dna不因剪切力作用形成开环结构并且解决了现有技术中的在搅拌情况下，引起的基因组dna断裂，造成下游纯化困难，从而更为重要的是减少了开环质粒dna数量，增加了超螺旋质粒dna的数量，有效地混合用于将
用于细菌中质粒dna的提取的混合液，从而改善了生产效率，提高了dna产率和质量。
21.在本发明的优选实施例中，所述第一气泡发生组件为曝气板或由多个曝气片组成。
22.在本发明的具体实施方式中，所述曝气板或曝气片上均设有多个通气孔，通过多个通气孔的设置能够使其曝气效果更好，从而使用于细菌中质粒dna提取的混合液混合更为均匀。
23.在本发明的优选实施例中，所述箱体的截面的两端成弧形，箱体界面成弧形的设置，可避免死角的产生，更易清洗。
24.在本发明的优选实施例中，所述箱体外底部还设有支架，所述支架上连接有万向轮，万向轮的设置可使得气泡发生装置易于移动，使用更为方便。
25.在本发明的优选实施例中，所述气泡发生装置还包括与所述进料口相连通的进料组件，所述进料组件上还连接有发酵液进料管和中和液进料管，所述发酵液进料管上还连接有裂解液进料管。
26.在本发明的具体实施方式中，所述进料组件还包括螺旋管，所述螺旋管的一端与所述发酵液进料管和裂解液进料管连通，另一端与所述中和液进料管连通至进料口。
27.本发明的另一方面还提供一种通过上述装置从细菌中提取质粒dna的方法，包括以下步骤：
28.1)将发酵后的含有质粒dna的大肠杆菌菌液加入裂解液裂解，得到裂解后的大肠杆菌菌液；
29.2)将裂解后的大肠杆菌菌液与中和液混合得到混合液，再将所述混合液通入气泡发生装置中，在沿所述气泡发生装置的水平延伸方向流过的过程中，通过第一气泡发生组件混匀反应25～120s，并将所述混合液中的渣体和反应液分层，排渣后，得到反应液；
30.3)将所述反应液进行分离过滤、纯化，得到质粒dna溶液，即得。
31.在本发明的优选实施例中，在步骤2)中，通过第一气泡发生组件混匀反应60～120s，在该时间内反应，能够使在第一气泡发生组件产生的气泡作用下充分混合反应，反应更为充分，dna的产率更高。
32.在本发明的优选实施例中，所述气泡发生装置中还设有固液相分离器，在步骤2)中，通过固液相分离器将混合液分离成渣体和反应液，再将渣体排出。
33.在本发明的优选实施例中，所述固液相分离器包括除渣板和固体排渣口，所述渣体通过除渣板的引流，再从固体排渣口排出。
34.在本发明的优选实施例中，在步骤2)中，所述气泡发生装置中还设有挡料组件，所述混合液还通过挡料组件调节其在气泡发生装置中的反应时间，所述挡料组件设在所述第一曝气组件和固液相分离器之间；
35.优选地，所述挡料组件与所述液体收集口之间还设有至少一层滤膜，更优选地，滤膜为3层，所述滤膜的孔径大小为80-400目。
36.在本发明的优选实施例中，所述挡料组件与所述液体收集口之间还设有第二气泡发生组件。
37.在本发明的优选实施例中，所述气泡发生装置为横式气泡发生装置。在本发明的优选实施例中，在步骤2)中，所述混合液还通过挡料组件调节其在气泡发生装置中的反应
时间。
38.在本发明的优选实施例中，在步骤2)中，所述裂解后的大肠杆菌菌液或中和液的流速为2.5～7.5l/min。
39.在本发明的优选实施例中，在步骤1)中，所述大肠杆菌菌液和裂解液的流速均为1.25～3.75l/min。
40.在本发明的优选实施例中，所述大肠杆菌菌液和裂解液反应3～7分钟，优选地，反应5分钟。
41.在本发明的优选实施例中，在步骤3)中，将所述质粒dna溶液纯化前，还包括将所述质粒dna溶液通过0.45～0.2μm的过滤膜进行深度过滤的步骤。
42.在本发明的优选实施例中，在步骤2)中，通气速度为40-100l/min，优选50-90l/min，更优选60-80l/min。
43.本发明的有益效果是，该气泡发生装置可用于细菌中的dna的大规模提取，通过裂解液与细菌的发酵液混合后，再将裂解后的发酵液与中和液同时以一定的流速通入气泡发生装置，并在所述气泡发生装置中水平流动的过程中，在第一气泡发生组件下充分混合终止裂解反应，并通过固液相分离器引导排渣，有效除渣，得到富含质粒dna的反应液，使得后续步骤能够有效纯化提取质粒dna；用于提取细菌中的质粒dna的混合液沿水平方向通过气泡发生装置，以气泡方式水平方式带动混合液，剪切力小，有效保护超螺旋结构质粒dna不因剪切力作用形成开环结构，混合液较不受重力影响上下扰动，而是由单一流动方向进行充分混合，确保连续混合过程中，混合程度较为均质；第一气泡发生组件产生的气泡与混合液(裂解后的发酵液与中和液)混合后，中和液中的气泡将裂解液中的蛋白质、脂肪和基因组dna等杂质推出液面，并由于气泡的存在使杂质的比重下降，漂浮在液体表面形成泡沫形态，有利于固液相有效分离，然后在固液相分离器的作用下，引导排出，而使质粒dna留在液体中进行更为有效的中和反应；并通过固液相分离器的作用，在提取dna的同时能够除渣，有效地减少提取的液体质粒dna中的杂质含量，减少了后续的分离步骤，并且效率更高。
44.通过本发明的方法，使混合液在水平流动通过气泡发生装置，在其中保持25～120s，在第一气泡发生组件产生的气泡作用下充分混合反应，以气泡方式带动混合，剪切力小，有效保护超螺旋结构质粒dna不因剪切力作用形成开环结构，并在挡料组件的作用下调节其在气泡发生装置中的反应时间，混合液的流速均匀，反应稳定，在裂解液和发酵液充分反应的同时，中和液中的气泡将裂解液中的蛋白质、脂肪和基因组dna等杂质推出液面，而使质粒dna留在液体中进行更为有效的中和反应，达到有效地清除蛋白质、rna和基因组dna效果；并通过固液相分离器的除渣作用，在提取dna的同时能够除渣，有效地减少提取的液体质粒dna中的杂质含量，减少了后续的分离步骤，并且效率更高；同时通过实验优化了反应时间参数，合适的反应时间25s～120s，有利于提高质粒的产量，减少开环质粒产生，并且降低杂质rna的残留，使其更有利于下游的纯化，得到浓度和纯度更高的产品，而且发现通气速度为40-100l/min(优选50-90l/min，更优选60-80l/min)，宿主dna残留更少，说明合适的气泡发生装置的通气速度有利于减少宿主dna的残留，对提高产品的纯度有很大帮助。
45.本发明克服了现有技术中存在的，存在的反应管道中存在的操作不方便，大规模提取质粒dna的中和混合步骤中，容易产生高剪切力，从而破坏质粒的超螺旋结构，致使提取的质粒dna的质量低下的技术问题；此外，利用中空纤维和板框过滤、膜过滤和化学絮凝
沉淀等方法虽大幅度提高了质粒dna的提取规模，但这些方面提取的质粒dna的杂质往往远多于离心方法提取的质粒dna，而且还潜在着由化学絮凝物带来的污染的问题，而本发明的方法能够大规模地从细菌中提取质粒dna，并且收率高，纯度及质量高，满足了基因药物、病毒类药物、核酸药物和疫苗产品，尤其是核酸疫苗研发和后期产品大规模生产的需要。
附图说明
46.构成说明书的一部分的附图描述了本发明的实施例，并且连同描述一起用于解释本发明的原理。
47.参照附图，根据下面的详细描述，可以更加清楚地理解本发明，其中：
48.图1为本发明的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的第一实施例的主视图；
49.图2为图1中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的俯视图；
50.图3为图1中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的左视图；
51.图4为图1中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的右视图；
52.图5为本发明的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的第二实施例的主视图；
53.图6为本发明的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的第三实施例的主视图；
54.图7为图6中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的俯视图；
55.图8为图6中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的右视图；
56.图9为图6中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置中的固液相分离器的结构示意图；
57.图10为本发明的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的第四实施例的主视图；
58.图11为图10中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的俯视图；
59.图12为图10中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置中的固液相分离器的结构示意图；
60.图13为本发明中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的第五实施例的主视图；
61.图14为本发明中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的第五实施例的主视图；
62.图15为本发明中的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置中的进料组件的结构示意图。
63.其中，1.箱体，101.进料口，102.液体收集口，103.第一气泡发生组件，1031.通气孔，104.固液相分离器，1041.除渣板，1042.固体排渣口，105.挡料组件，1051.挡料板，1052.支撑板，106.滤膜，107.第一气泡发生组件，108.支架，109.万向轮，2.曝气机，3.进料组件，301.发酵液进料管，302.中和液进料管，303.裂解液进料管，304.螺旋管。
具体实施方式
64.现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。
65.以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
66.对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。
67.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
68.图1-4为本发明的用于提取细菌中的质粒dna的气泡发生装置的一个实施例的具体结构示意图，该气泡发生装置包括箱体1，箱体1的一端设有进料口101，箱体1的另一端设有液体收集口102；箱体1内设有至少一个第一气泡发生组件103和固液相分离器104，第一气泡发生组件103用于充分混合混合液，并将其中的渣体和反应液分层，混合液为用于提取细菌中的质粒dna中和步骤的混合液；混合液由进料口101进入箱体1，沿水平方向依次流经第一气泡发生组件103和固液相分离器104，渣体通过固液相分离器104引导排出，反应液由液体收集口102流出。通过该设计使混合液沿水平方向依次流过第一气泡发生组件103和固液相分离器104，能够使流速均匀，达到有效地清除蛋白质、rna和基因组dna效果，克服了现有技术中存在的反应管道中存在的操作不方便，大规模提取质粒dna的中和混合步骤中，容易产生高剪切力，从而破坏质粒的超螺旋结构，致使提取的质粒dna的质量低下的技术问题；以气泡方式水平方式带动混合液，使其充分混合反应，剪切力小，有效保护超螺旋结构质粒dna不因剪切力作用形成开环结构，混合液较不受重力影响上下扰动，而是由单一流动方向进行充分混合，确保连续混合过程中，混合程度较为均质，制备的质粒dna质量和产率高，杂质少。具体实施时，第一气泡发生组件103可为曝气板，进料口101、固体排渣口1042以及液体收集口102的截面均可为圆形。第一气泡发生组件103还可由多个曝气片组成，如图5所示。具体实施中，曝气板或曝气片上可均设有多个通气孔1031，气泡发生装置外设有与曝气板或曝气片连通的曝气机2，通过多个通气孔1031的设置能够使其曝气效果更好，从而使用于细菌中质粒dna提取的混合液混合更为均匀，混合液反应更为充分；固液相分离器104包括除渣板1041和固体排渣口1042，除渣板1041用于引导渣体的流向，并通过固体排渣口1042将渣体排出。
69.在本发明的上述实施例中，除渣板1041通过角度可调连接件与箱体1连接，通过该角度可调节连接件的作用，可根据需要调节除渣板1041与水平面的夹角调至合适大小，并且易于控制，方便易操作，满足分离不同固液相高度的需要。
70.在本发明的气泡发生装置的又一个实施例中，如图6-9所示，固液相分离器104还包括缓冲板1043，缓冲板1043的一端与除渣板1041连接，缓冲板1043的另一端设于第一气泡发生组件103上方。
71.在本发明的优选实施例中，缓冲板1043与水平面成第一夹角设置，第一夹角为5～15
°
，除渣板1041可处于水平面，通过该设置可以更利于渣体的分离，并有效地防止渣体回流。具体实施时，除渣板1041可与固体排渣口1042成一体设置，如图10-12所示，或固体排渣口1042套装在除渣板1041上，且固体排渣口1042整体成圆锥形，其的截面呈梯形，且该梯形的下底套装在除渣板1041上，固体排渣口1042可设在箱体1的一端或一侧。
72.在本发明的上述实施例中，箱体1内还设有挡料组件105，挡料组件105设于第一气泡发生组件103和固液相分离器104之间，通过挡料组件105能够调节混合液在气泡发生装置中的反应时间和液面高度，并能促进固液相分离。具体实施时，除渣板1041的一端可通过转轴或可固定合页与箱体1上靠近液体收集口102的一端成角度可调节连接，除渣板1041的另一端设于靠近挡料组件105的一端。
73.在本发明的上述实施例中，挡料组件105包括挡料板1051和与其连接的支撑板1052，挡料板1051与水平面成第二夹角设置，第二夹角的大小为30～75
°
，挡料板1051与水平面成夹角设置的方式，可使混合液在流经挡料板1051时起到一定的缓冲作用，混合液流更为温和，更有利于固液相的分离，不同夹角大小满足不同流速的混合液，使用更为方便。
74.在本发明的上述实施例中，第二夹角的大小可为30～60
°
，在该夹角大小下的挡料板1051在调节反应时间和液面高度的同时，能够起到更好的缓冲作用。
75.在本发明的气泡发生装置的又一个实施例中，如图13所示，挡料组件105与箱体1之间还设有至少一层滤膜106，可进一步排除反应液中的杂质。具体实施时，滤膜106可为3～4层，滤膜106的孔径大小为80～400目，并且滤膜可与成平面成第三夹角设置，第三夹角可为5～15
°
倾斜角度方向引导截流渣体，并使其从固体排渣口1042排出，通过该设计，方便渣体收集。滤膜的孔径,及大小孔径滤膜不同排序也决定了分离的效果和效率。具体实施时，3-4层滤膜，孔径大滤膜放在最上层(第一级滤膜)，孔径小的放在最下层(第三级滤膜)，中间孔径的放在中间为第二级滤膜。这种分布即可保证泡沫漂浮物和大尺寸颗粒杂质截留在上层，让小尺寸杂质流入到中层和下层被有效截留，提高了滤膜的使用效率，同时也使质粒dna溶液顺利通过上下层滤膜进入到收集罐中，达到高效分离的效果。
76.在上述实施例中，滤膜106的底部还设有第二气泡发生组件107，通过该设置不仅可以提高质粒dna溶液过滤效率，同时还可以避免杂质堵塞滤膜；并且此处的气泡可以进一步推动泡沫漂浮物进入到泡沫分离器中提高杂质去除的效果。
77.在本发明的气泡发生装置的在一个实施例中，如图14所示，箱体1的截面的两端成弧形，箱体界面成弧形的设置，可避免死角的产生，更易清洗。具体实施时，箱体1外底部还设有支架108，支架上连接有万向轮109，万向轮109的设置可使得气泡发生装置易于移动，使用更为方便。具体实施时，箱体1可为方形，水平放置的圆柱形，水平放置的菱柱，以及不规则形状等等。
78.在本发明的上述实施例中，箱体1内还设有撇渣器，撇渣器设于箱体内靠近固体排渣口1042的一端，撇渣器的设置更利于除渣。具体实施时，撇渣器为连续运转的刮板装置，能主动式将固态残渣导向固液相分离装置。
79.在本发明的具体实施方式中，气泡发生装置为横式气泡发生装置，横式气泡发生器的设置可使用于细菌中质粒dna提取的混合液的流速更为均匀，且规模比较容易放大。具体实施时，气泡发生装置为纳米或微米气泡发生装置，能够使反应更为温和，以气泡方式带动混合，剪切力小，有效保护超螺旋结构质粒dna不因剪切力作用形成开环结构，并且解决了现有技术中的在搅拌情况下，引起的基因组dna断裂，造成下游纯化困难，从而更为重要的是减少了开环质粒dna数量，增加了超螺旋质粒dna的数量，有效地混合用于将用于细菌中质粒dna的提取的混合液，从而改善了生产效率，提高了dna产率。
80.如图15所示，在本发明的上述实施例中，气泡发生装置还包括与进料口102相连通
的进料组件3，进料组件3上还连接有发酵液进料管301和中和液进料管302，发酵液进料管301上还连接有裂解液进料管303。具体实施时，进料组件3还包括螺旋管304，该螺旋管304的一端连接有发酵液进料管301和裂解液进料管303，另一端与中和液进料管302连通至进料口102。
81.上述实施例中的气泡发生装置均可用于以下实施例，具体从细菌中提取质粒dna的方法如下：
82.实施例1
83.1)将发酵后的含有质粒dna的大肠杆菌菌液(可为dh5α)与缓冲液(溶液i)混合，混合过程可使用机械搅拌器或者磁力搅拌器使其菌体充分与溶液混合，得到混合后的发酵液，再将混合后的发酵液以1.25l/min的流速加入相同流速的裂解液(溶液ii)通过螺旋管裂解5分钟后，得到裂解后的大肠杆菌菌液；
84.2)将裂解后的大肠杆菌菌液以2.5l/min的流速与同样流速的中和液(溶液iii)混合(得到混合液)，通入气泡发生装置中，并在沿所述气泡发生装置的水平延伸方向流过的过程中，通过第一气泡发生组件103混匀反应60s，一旦中和液与混合液混合后，该气泡发生装置中的微纳米级气泡将裂解液中的蛋白质、脂肪和基因组dna等杂质推出液面，而使质粒dna留在液体中进行更为有效的中和反应。浮于液面的泡沫杂质(渣体)在固液分离器中被分离并遗弃，有效地降低了质粒dna中杂质的含量；在此微纳米气液分离池中，质粒dna溶液再经过3层过滤膜80-400目后，溶液中的可见异物和杂质进一步被膜阻挡分开，质粒dna溶液(反应液)流入到收集罐中暂存；
85.3)将反应液进行分离过滤，并进一步将富含质粒dna的反应液通过0.2～0.45μm的过滤膜进行深度过滤，再纯化，得到质粒dna溶液，即得。
86.通过hplc试验以及药典方法检测上述方法制得的质粒dna，结果表明：通过此方法大规模制备的质粒dna纯度》95-99％超螺旋构像，《0.5～2％开环构像，宿主残留rna《0.1％，宿主残留dna《0.1％，宿主残留蛋白《0.02％。质粒dna产量可以高达1.5g/l发酵液，产量高。
87.注：溶液i为25mm tris和10mm的edta-2na，溶液ii为0.2m naoh和1％sds，溶液iii为1m乙酸钾和7m乙酸铵
88.实施例2
89.1)将发酵后的含有质粒dna的大肠杆菌菌液与缓冲液(溶液i)混合，混合过程可使用机械搅拌器或者磁力搅拌器使其菌体充分与溶液混合，得到混合后的发酵液，再将混合后的发酵液以2.5l/min的流速加入相同流速的裂解液(溶液ii)裂解7分钟后，得到裂解后的大肠杆菌菌液；
90.2)将裂解后的大肠杆菌菌液以5.0l/min的流速与同样流速的中和液(溶液iii)混合(得到混合液)，通入气泡发生装置中，并在沿所述气泡发生装置的水平延伸方向流过的过程中，通过第一气泡发生组件103混匀反应25s，一旦中和液与混合液混合后，该气泡发生装置中的微纳米级气泡将裂解液中的蛋白质、脂肪和基因组dna等杂质推出液面，而使质粒dna留在液体中进行更为有效的中和反应。浮于液面的泡沫杂质(渣体)在固液分离器中被分离并遗弃，有效地降低了质粒dna中杂质的含量；在此微纳米气液分离池中，质粒dna溶液再经过3层过滤膜60-400目后，溶液中的可见异物和杂质进一步被膜阻挡分开，质粒dna溶
液(反应液)流入到收集罐中暂存；
91.3)将反应液进行分离过滤，并进一步质粒dna溶液通过0.45～0.45μm的过滤膜进行深度过滤，再纯化，得到质粒dna溶液，即得。
92.通过hplc试验以及药典方法检测上述方法制得的质粒dna，结果表明：通过此方法大规模制备的质粒dna纯度》95～99％超螺旋构像，《0.5～2％开环构像，rna《0.1％，宿主残留dna《0.1％，宿主残留蛋白《0.02％。质粒dna产量可以高达1.5g/l发酵液，产量高。
93.实施例3
94.1)将发酵后的含有质粒dna的大肠杆菌菌液与缓冲液(溶液i)混合，混合过程可使用机械搅拌器或者磁力搅拌器使其菌体充分与溶液混合，得到混合后的发酵液，再将混合后的发酵液以3.75l/min的流速加入相同流速的裂解液(溶液ii)裂解7分钟后，得到裂解后的大肠杆菌菌液；
95.2)将裂解后的大肠杆菌菌液以5.0l/min的流速与同样流速的中和液(溶液iii)混合(得到混合液)，通入气泡发生装置中，并在沿所述气泡发生装置的水平延伸方向流过的过程中，通过第一气泡发生组件103混匀反应120s，一旦中和液与混合液混合后，该气泡发生装置中的微纳米级气泡将裂解液中的蛋白质、脂肪和基因组dna等杂质推出液面，而使质粒dna留在液体中进行更为有效的中和反应。浮于液面的泡沫杂质(渣体)在固液分离器中分离并遗弃，有效地降低了质粒dna中杂质的含量；在此微纳米气液分离池中，质粒dna溶液再经过3层过滤膜80-400目后，溶液中的可见异物和杂质进一步被膜阻挡分开，质粒dna溶液(反应液)流入到收集罐中暂存；
96.3)将反应液进行分离过滤，并进一步质粒dna溶液通过0.2～0.45μm的过滤膜进行深度过滤，再纯化，得到质粒dna溶液，即得。
97.通过hplc试验以及药典方法检测上述方法制得的质粒dna，结果表明：通过此方法大规模制备的质粒dna纯度》95-99％超螺旋构像，《0.5～2％开环构像，rna《0.1％，宿主残留dna《0.1％，宿主残留蛋白《0.02％。质粒dna产量可以高达2.0g/l发酵液，产量高。
98.实施例4
99.1)将发酵后的含有质粒dna的大肠杆菌菌液与缓冲液(溶液i)混合，混合过程使用机械搅拌器使其菌体充分与溶液混合，得到混合后的发酵液，再将混合后的发酵液以一定的流速加入相同流速的裂解液(溶液ii)裂解5分钟后，得到裂解后的大肠杆菌菌液；
100.2)将裂解后的大肠杆菌菌液以一定的流速与同样流速的中和液(溶液iii)混合(得到混合液)，通入气泡发生装置中，并在沿所述气泡发生装置的水平延伸方向流过的过程中，通过控制裂解后的大肠杆菌菌液和中和液的速度，使裂解后的大肠杆菌菌液和中和液通过气泡发生组件103混匀反应时间分别为23s，100s，200s，调节气泡发生装置的通气速度为77l/min，中和液与混合液混合后，该气泡发生装置中的微纳米级气泡将裂解液中的蛋白质、脂肪和基因组dna等杂质推出液面，而使质粒dna留在液体中进行更为有效的中和反应。从气泡发生装置反应后流出的液体，依次用80目、200目的筛网过滤，将溶液中的可见异物和杂质进一步被膜阻挡分开，得到含有质粒的清液。
101.3)将通过上述步骤得到的清液(未进行纯化)，用hplc试验方法检测超螺旋质粒浓度以及rna残留，得到不同反应时间的检测结果，如下表1所示：
102.表1不同反应时间检测结果
[0103][0104]
实验结果表明，反应时间在100s条件下结果最优，其超螺旋质粒浓度大于反应时间23s和200s的质粒浓度，rna残留小于反应时间23s和200s的结果，能进一步减少后续纯化工艺中杂质的去除的时间，使操作过程更为快速，提高纯化效率。
[0105]
实施例5
[0106]
1)将发酵后的含有质粒dna的大肠杆菌菌液与缓冲液(溶液i)混合，混合过程使用机械搅拌器使其菌体充分与溶液混合，得到混合后的发酵液，再将混合后的发酵液以一定的流速加入相同流速的裂解液(溶液ii)裂解5分钟后，得到裂解后的大肠杆菌菌液；
[0107]
2)将裂解后的大肠杆菌菌液以一定的流速与同样流速的中和液(溶液iii)混合(得到混合液)，通入气泡发生装置中，并在沿所述气泡发生装置的水平延伸方向流过的过程中，通过控制裂解后的大肠杆菌菌液和中和液的速度，使裂解后的大肠杆菌菌液和中和液通过气泡发生组件103混匀反应时间为100s，调节气泡发生装置的通气速度为128l/min，中和液与混合液混合后，该气泡发生装置中的微纳米级气泡将裂解液中的蛋白质、脂肪和基因组dna等杂质推出液面，而使质粒dna留在液体中进行更为有效的中和反应。从气泡发生装置反应后流出的液体，依次用80目、200目的筛网过滤，将溶液中的可见异物和杂质进一步被膜阻挡分开，得到含有质粒的清液。
[0108]
3)将通过上述步骤得到的清液，与实施例4中反应时间100s条件下得到的清液同时检测宿主dna残留、超螺旋质粒浓度以及rna残留，对比通气速度调快后对实验的影响。检测结果如下表2所示：
[0109]
表2不同通气速度检测结果
[0110][0111]
结果表明，通气速度为77l/min，宿主dna残留更少，超螺旋质粒浓度更高，rna残留更低，说明合适的通气速度有利于降低裂解中和后清夜中宿主dna的产生，通气速度过快，会导致宿主dna的产生，可能的原因是较快的通气速度会导致反应剧烈，从而打断宿主dna，使其变成可溶的状态在反应液的上清中，导致产品中宿主dna残留较高，影响后续纯化工艺中杂质的去除。
[0112]
在上述实施例1-3中，其中3层滤膜，这些滤膜主要目的是用于质粒dna溶液与泡沫漂浮物和颗粒物杂质分开。滤膜的孔径及大小孔径滤膜不同分布也决定了分离的效果和效
率。根据以往的经验，孔径大滤膜放在最上层(第一级滤膜)，孔径小的放在最下层(第三级滤膜)，中间孔径的放在中间为第二级滤膜。这种分布即可保证泡沫漂浮物和大尺寸颗粒杂质截留在上层，让小尺寸杂质流入到中层和下层被有效截留，提高了滤膜的使用效率，同时也使质粒dna溶液顺利通过上下层滤膜进入到收集罐中，达到高效分离的效果。为了进一步提升这些滤膜在过滤和截留方面效率，本发明对滤膜摆放角度进行了改进，首先第一级滤膜主要功能是截留泡沫漂浮物和大颗粒杂质，同时也是引导截留物的走向。基于这个目的，将一级滤膜设置5～15％倾斜角度，倾斜角度方向引导截留物从排出口排出。第二级和第三级滤膜的功能主要是分级截留不同大小杂质，同时快速让质粒dna溶液通过。为达到这个目的，还将第二级和第三级滤膜也设置了5～15％倾斜角度，倾斜角度方向为引导质粒dna溶液更快流入收集罐方向；
[0113]
上述实验结果表明，通过本发明的方法，使混合液在水平流动通过气泡发生装置，在其中保持25～120s，在第一气泡发生组件产生的气泡作用下充分混合反应，以气泡方式带动混合，剪切力小，有效保护超螺旋结构质粒dna不因剪切力作用形成开环结构，并在挡料组件的作用下调节其在气泡发生装置中的反应时间，混合液的流速均匀，反应稳定，在裂解液和发酵液充分反应的同时，中和液中的气泡将裂解液中的蛋白质、脂肪和基因组dna等杂质推出液面，而使质粒dna留在液体中进行更为有效的中和反应，达到有效地清除蛋白质、rna和基因组dna效果；并通过固液相分离器的除渣作用，在提取dna的同时能够除渣，有效地减少提取的液体质粒dna中的杂质含量，减少了后续的分离步骤，并且效率更高；同时通过实验优化了反应时间参数，合适的反应时间25s～120s，有利于提高质粒的产量，减少开环质粒产生，并且降低杂质rna的残留，使其更有利于下游的纯化，得到浓度和纯度更高的产品，而且发现通气速度为40-100l/min(优选50-90l/min，更优选60-80l/min)，宿主dna残留更少，说明合适的气泡发生装置的通气速度有利于减少宿主dna的残留，对提高产品的纯度有很大帮助。本发明克服了现有技术中存在的，反应管道中存在的操作不方便，大规模提取质粒dna的中和混合步骤中，容易产生高剪切力，从而破坏质粒的超螺旋结构，致使提取的质粒dna的质量低下的技术问题；此外，利用中空纤维和板框过滤、膜过滤和化学絮凝沉淀等方法虽大幅度提高了质粒dna的提取规模，但这些方面提取的质粒dna的杂质往往远多于离心方法提取的质粒dna，而且还潜在着由化学絮凝物带来的污染的问题，而本发明的方法能够大规模地从细菌中提取质粒dna，并且收率高，纯度及质量高，满足了基因药物、病毒类药物、核酸药物和疫苗产品，尤其是核酸疫苗研发和后期产品大规模生产的需要。
[0114]
该气泡发生装置可用于细菌中的dna的大规模提取，通过裂解液与细菌的发酵液混合后，再将裂解后的发酵液与中和液同时以一定的流速通入气泡发生装置，并在所述气泡发生装置中水平流动的过程中，在第一气泡发生组件下充分混合终止裂解反应，并通过固液相分离器引导排渣，有效除渣，得到富含质粒dna的反应液，使得后续步骤能够有效纯化提取质粒dna；用于提取细菌中的质粒dna的中和步骤的混合液沿水平方向通过气泡发生装置，以气泡方式水平方式带动混合液，剪切力小，有效保护超螺旋结构质粒dna不因剪切力作用形成开环结构，混合液较不受重力影响上下扰动，而是由单一流动方向进行充分混合，确保连续混合过程中，混合程度较为均质；第一气泡发生组件产生的气泡与混合液(裂解后的发酵液与中和液)混合后，该中和液中的气泡将裂解液中的蛋白质、脂肪和基因组dna等杂质推出液面，并由于气泡的存在使杂质的比重下降，漂浮在液体表面形成泡沫形
态，有利于固液相有效分离，然后在固液相分离器的作用下，引导排出，而使质粒dna留在液体中进行更为有效的中和反应；并通过固液相分离器的作用，在提取dna的同时能够除渣，有效地减少提取的液体质粒dna中的杂质含量，减少了后续的分离步骤，并且效率更高。
[0115]
本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。