一种与斑点叉尾鮰生长相关的SNP标记及其应用的制作方法

一种与斑点叉尾鮰生长相关的snp标记及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种与斑点叉尾鮰生长相关的snp标记及其应用。


背景技术：

2.斑点叉尾鮰又称沟鲇，原产于北美，其肉质鲜、抗病力强、生长迅速、易起捕、适温较广，1980年代引入我国后，产业发展迅速，年产量已经突破30万吨。但是，在我国斑点叉尾鮰养殖产业快速发展的过程中，生产单位不注重亲本留种操作，甚至淘大留小，导致养殖斑点叉尾鮰遗传多样性降低、生长减慢、规格不齐、抗病能力下降。而生长性状直接影响养殖产量和效益，因此，开展生长快、经济性状好的斑点叉尾鮰选育工作十分重要。传统针对生长的鱼类选育主要方法是主要是群体选育和家系选育，根据表型的数量遗传学分析，挑选个体较大、身体健壮的鱼作为留种亲本。这种方法耗时费力、工作量大，同时表型判断斑点叉尾鮰亲本质量往往评估不准确，导致选育效果不佳。
3.随着分子生物学和遗传学的发展，已涌现出很多种遗传标记，如aflp、rapd、ssr、snp等标记，其中，snp标记因分布广泛，适宜高通量自动化分析，遗传稳定，日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记。snp标记是指基因组dna序列中由于单个核苷酸的变化而引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。基因编码区内的snp比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。
4.肌肉生长抑制素基因(myostatin，mstn)、胰岛素样生长因子
‑
1基因(insulin
‑
like growth factor i，igf
‑
1)和生肌调节因子基因(myogenin，myog)都对动物的生长调控具有重要作用。因此，这些基因已经作为生长性状的候选基因，其snp与生长性状的关联分析在畜禽和水产动物中已经有较多的报道。在斑点叉尾鮰中筛选出这些基因编码区与生长相关的snp标记，能够快速挑选生长速度快且遗传稳定的斑点叉尾鮰亲本，缩短育种周期，加快育种进程。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种与斑点叉尾鮰生长相关的snp标记及其应用，通过对斑点叉尾鮰myog基因编码区的一个与生长性状关联的snp标记进行检测，进行早期选择，快速筛选，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选育效率和准确性。
6.本发明的另一个目的在于提供一种快速生长斑点叉尾鮰亲本的筛选方法。
7.本发明采用了以下技术方案：
8.一种斑点叉尾鮰生肌调节因子myog基因在亲本筛选中的应用。
9.作为本发明的另一方面，本发明提供一种影响斑点叉尾鮰生长的snp标记，其中：所述snp标记的dna序列如seq id no：2所示，其中第391位w为碱基t或a。
10.优选的，所述snp标记，第391位基因型为tt、aa、at。
11.作为本发明的另一方面，本发明提供一种snp标记在判断斑点叉尾鮰生长快慢中的应用和/或在筛选快速生长斑点叉尾鮰中的应用。
12.作为本发明的另一方面，本发明提供一种斑点叉尾鮰myog基因型的判断方法，其中，检测斑点叉尾鮰的snp标记的第391位碱基处是否为aa基因型，所述snp标记的dna序列如seq id no：2所示；若为aa基因型，则可作为生长速度快、遗传稳定的斑点叉尾鮰后备亲本。
13.优选的，包括如下步骤，1)提取斑点叉尾鮰基因组dna；2)以提取得到的基因组dna为模板，pcr检测所述snp标记的第391位基因型。
14.优选的，在步骤2)中，所述pcr检测具体操作为，用引物f1和r1对斑点叉尾鮰基因组dna进行pcr扩增，得到pcr产物，
15.f1：5'
‑
tcttcccttccaggcttaca
‑
3'(seq id no：3)；
16.r1：5'
‑
agcagccgaggacctgtaat
‑
3'(seq id no：4)。
17.pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序分析。
18.优选的，所述初次pcr扩增的反应体系为，pcr扩增使用即用型ultrataq酶pcr试剂盒，包括2
×
ultrataq master mix 20μl，基因组dna 2μl，上下游引物2μl，ddh2o 14μl；扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。
19.1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，凝胶成像仪观察电泳结果。所有扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司，直接使用abi 3730xl测序仪(abi,美国)测序。使用chromas软件观察测序峰图，结合clustalx软件进行dna序列比对来判断snp位点的碱基类型。第391位的基因型为aa的个体体重和体长显著高于at和tt型的个体(p<0.05)。
20.本发明的有益效果是：
21.本发明大大提高了斑点叉尾鮰亲本筛选的准确性，可以提前快速挑选出生长速度快、遗传稳定的斑点叉尾鮰后备亲本，定向培育，减少成本。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。
具体实施方式
22.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本技术作进一步说明。
23.实施例1：与斑点叉尾鮰生长性状相关的snp标记的获得
24.1、实验动物
25.本实验所用斑点叉尾鮰样本均来自于江苏省淡水水产研究所国家斑点叉尾鮰遗传育种中心扬中试验基地。2019年6月构建斑点叉尾鮰核心育种群体g3代家系，为了减小环境对斑点叉尾鮰生长的影响，苗种培育按照同一标准进行，即均一的换水速率、投喂量、养殖密度、充氧量以及水温。待到家系平均日龄为170d时，测量个体的体重和体长数据，随机挑选6个家系300尾鱼采集每尾鱼的尾鳍组织，95％酒精浸泡，
‑
20℃保存。
26.2、引物设计
27.根据genbank数据库公布的斑点叉尾鮰myog基因(ay534329.1)、mstn基因(af396747.1)和igf
‑
1基因(ah015082.2)，使用primerpremier 5软件各设计一对引物f1/
r1、f2/r2和f3/r3，扩增产物大小分别为464bp、550bp和1776bp。
28.f1:5'
‑
tgttggattggtctggagtgg
‑
3'(seq id no:3)
29.r1:5'
‑
cgtctactctccacctgcttc
‑
3'(seq id no:4)
30.f2:5'
‑
acggtgttcctgttactgc
‑
3'(seq id no:5)
31.r2:5'
‑
caccagatgttgctatgc
‑
3'(seq id no:6)
32.f3:5'
‑
aagacgcacgagccaggattatt
‑
3'(seq id no:7)
33.r3:5'
‑
tgaggagcacattagcacttctgg
‑
3'(seq id no:8)
34.3、pcr扩增
35.pcr扩增使用即用型ultrataq酶pcr试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，反应体系为：2
×
ultrataq master mix 20μl，基因组dna 2μl，上下游引物2μl，ddh2o 14μl。
36.myog基因扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。mstn基因扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。igf
‑
1基因扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。
37.1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，凝胶成像仪观察电泳结果。
38.4、测序
39.电泳合格样品，送至上海生工生物工程股份有限公司，直接使用abi 3730xl测序仪(abi,美国)测序。使用chromas软件观察测序峰图，结合clustalx软件进行dna序列比对来判断snp位点的碱基类型。
40.5、snp分型
41.myog基因共发现两个编码区snp，分别为g.391t>a和g.489a>g。其中，g.489a>g是同义突变，突变后编码氨基酸为改变，依然为gln；g.391t>a为错义突变，编码氨基酸发生了改变，从ser突变为thr。
42.mstn基因共发现两个编码区snp，分别为g.1859c>g和g.1907c>g/t，都是同义突变，突变后编码氨基酸未改变，依然为leu。
43.igf
‑
1基因共发现五个编码区snp，分别为g.1695g>t、g.1744g>c、g.1747g>a、g.1750g>a和g.1826c>g。其中，g.1744g>c、g.1747g>a和g.1750g>a三个突变为同义突变，突变后编码氨基酸未改变，依然分比为leu、thr和pro；g.1695g>t和g.1826c>g为错义突变，编码氨基酸发生了改变，分别从arg突变为leu和gly。
44.6、snp位点的频率统计分析
45.利用上述的3个错义突变snp检测方法对随机挑选6个家系300尾斑点叉尾鮰分别判定基因型，统计snp位点的频率。
46.基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率：
47.p
yy
＝n
yy
/n
48.其中，p
yy
表示某一位点的yy基因型频率，n
yy
表示群体中具有yy基因型的个体数；n为检测的个体总数量。
49.基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率：
50.p
y
＝(2n
yy
+n
yy1
+n
yy2
+
…
+n
yyi
…
+n
yyn
)/2n
51.其中，p
y
表示等位基因y频率，n
yy
表示群体中具有yy基因型的个体数量，n
yyi
表示群
体中具有yyi基因型个体数量，y1
‑
yn为等位基因y的n个不同的复等位基因。统计结果见表1。
52.表1斑点叉尾鮰种群中3个错义突变snp位点的基因型和等位基因频率
[0053][0054]
7、基因效应的关联分析
[0055]
对性状记录比较全面的斑点叉尾鮰的不同基因型个体与其生长性状的相关性进行了显著性检验(见表2)。
[0056]
1)测定的体尺数据主要包括：体重(170日龄)和体长两个性状。
[0057]
2)关联分析一般线性的模型：调用spss 20.0软件一般线性模型glm(general linear models procedure)对各基因型对生长性状的影响进行显著性检验。统计模型如下：
[0058]
y
ijk
＝μ+g
i
+t
j
+β
1p
+e
ijk
[0059]
其中：y
ijk
：个体表型记录；μ：总体均数；g
i
：基因型固定效应；tj：养殖时间的固定效应；β
1p
：初始体重的线性协变量，eijk：随机误差。
[0060]
从表2可以看出myog基因g.391snp位点的基因型为aa的个体在体重和体长上显著高于基因型为tt和at的个体(p<0.05)。而igf
‑
1基因g.1695和g.1826snp位点不同基因型斑点叉尾鮰间体重和体长无显著差异(p>0.05)。因此，斑点叉尾鮰myog基因单核苷酸多态位点(参考序列ay534329.1，基因的第391位)中aa为优势基因型，可以作为dna标记。由此，在育种工作中，应当选择斑点叉尾鮰myog基因为aa基因型的个体作为选育生长性状的斑点叉尾鮰亲本。
[0061]
表2斑点叉尾鮰snp位点不同基因型与生长性状之间的关联分析
[0062]
[0063]
注：表中数值为平均值
±
标准误；在同一列中标有a、b为差异显著水平p＜0.05。
[0064]
为了验证挖掘的1个snp分子标记的可靠性，对上市规格的斑点叉尾鮰选育群体进行了增重测定和基于sanger测序的snp分型，进一步证实了上述snp位点的多态性与斑点叉尾鮰生长性状极显著关联(p<0.05)，因此可以使用该snp标记对斑点叉尾鮰生长性状进行选择。
[0065]
实施例2：与斑点叉尾鮰生长性状相关的snp分子标记的验证
[0066]
1.养殖实验与样本采集
[0067]
斑点叉尾鮰核心育种群体g3代家系第一次测量完体重和体长等生长性状后，腹腔注射pit电子芯片，放入同一口6亩池塘中混合养殖18个月，达到上市规格。2020年11月起网捕捞，随机挑选500尾，测量体重和体长，并采集尾鳍组织。
[0068]
2.基因组dna的提取与snp分型
[0069]
从试验鱼的尾鳍中提取基因组dna。pcr扩增使用即用型ultrataq酶pcr试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，反应体系为：2
×
ultrataq master mix 20μl，基因组dna 2μl，上下游引物2μl，ddh2o 14μl。扩增引物为f1/r1(seq id no:3和seq id no:4)。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，凝胶成像仪观察电泳结果。合格的pcr扩增产物使用abi3730测序仪进行sanger测序，测序所用引物与pcr扩增引物相同。使用chromas软件读取测序峰图，记录每个样本在snp位点(g.391t>a)的基因型。
[0070]
3.生长性状与snp关联分析
[0071]
每个样本snp位点(g.391t>a)成功分型后，将体重、体长性状与各样本基因型进行关联分析。结果如表3所示，表明aa型个体的体重和体长极显著性高于基因型为tt和at型个体(p<0.05)。
[0072]
表3斑点叉尾鮰生长性状与snp基因型关联分析结果
[0073][0074]
注：表中数值为平均值
±
标准误；在同一列中标有a、b为差异显著水平p＜0.05。
[0075]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。