多氯联苯单克隆抗体及其应用

1.本发明涉及一种抗多氯联苯单克隆抗体及其在检测环境或食品中pcb80及其10种同系物中的应用。
技术背景
2.多氯联苯(pcbs)是一类持久性有机污染物(pops)，结构为含有不同数量氯的芳香族化合物，具有209种同系物，其中二噁英、类二噁英(12种)和环境指示类(7种)pcbs化合物被广泛关注。因其良好的化学稳定性、绝缘性、热稳定性、阻燃性和导热性，在20世纪30年代大量生产并被广泛应用于电气设备、液压设备和传热系统中。但伴随着pcbs从工业废物中释放到土壤、河流和空气中，同时由于其理化性质高度稳定，在环境中难降解，故而长期广泛存在，可通过食物链的生物富集并沿食物链累积放大。
3.pcbs在体内经过血液循环到达神经肌肉的接头处，严重损伤神经元，造成中枢神经死亡。此外，pcbs可降低人体免疫力，造成生殖毒性，导致各类疾病的爆发。相关组织对pcbs的残留限量作了严格规定，如美国环保局(epa)规定pcbs日容许摄入量为1pg teq
·
kg-1
·
day-1
；世界卫生组织(who)允许的最大每天摄入量为1-4pg teq
·
kg-1
·
day-1
；欧盟允许的最大每周摄入量为2pgteq
·
kg-1
·
week-1
；美国环境保护署(epa)规定饮用水中pcbs限量为0.5ng/ml；美国食品和药物管理局(fda)规定食品中最大残留限量为0.2-3ng/g。pcbs残留不仅影响环境和食品，而且危害人体健康，对其残留检测意义深远。
4.目前检测pcbs残留常规方法主要有气相色谱法(gc)、质谱(ms)和高分辨气相色谱(hrgc)等。张建军等利用气相色谱检测水中的pcbs,检测限为 0.1μg/l，许仁杰等建立了同时测定水产品中有机氯农药和多氯联苯残留量的双重净化-气相色谱法检测限为0.14ng/g。这些方法虽然灵敏度高，但需要专业人员操作，不适用于现场快速检测。酶联免疫法(elisa)作为一种特异性强、灵敏度高，简单快速，经济高效检测方法广被关注。特异性单克隆抗体只能识别其对应目标物，而广谱型特异性抗体能同时识别目标物以及其多种结构类似物。目前市场上能检测pcbs的快速检测技术产品稀缺，环境和食品中pcbs(包括二噁英等)以多以混合物形式存在，因此筛选能广谱性识别pcbs的单克隆抗体已成为本领域亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种可同时识别多种多氯联苯，具有广谱特异性的单克隆抗体，以实现现场快速、灵敏准确、经济实用的多氯联苯残留免疫检测方法。
6.具体而言，本技术是通过如下技术方案实现的：
7.首先，本发明提供了一种具有广谱特异性识别多氯联苯的单克隆抗体，该抗体重链可变区氨基酸序列如seq id no.6，轻链可变区氨基酸序列如seq idno.8所示；重链恒定区氨基酸序列如genbank:am745099.1所示，轻链恒定区氨基酸序列如genbank:aj555479.1所示。
8.其次，本发明提供了该单克隆抗体在特异性检测多氯联苯的免疫学方法中的应用。即将该多氯联苯的单克隆抗体作为识别抗体，应用于多氯联苯elisa检测试剂盒中。所述多氯联苯包括pcb169、pcb126、pcb189、pcb157、pcb167、 pcb156、pcb111、pcb81、pcb123、pcb77、pcb80中的至少一种。
9.第三，本发明提供了该单克隆抗体在特异性识别多氯联苯中的应用。所述多氯联苯包括pcb169、pcb126、pcb189、pcb157、pcb167、pcb156、pcb111、 pcb81、pcb123、pcb77、pcb80中的至少一种。
10.第四，本发明还提供了利用上述单克隆抗体定量检测样品中pcb80的方法，即利用该抗体结合间接竞争elisa法对样品中多氯联苯pcb80进行检测，具体步骤如下：
11.7)包被：用cbs缓冲液将包被原pcbc-bsa稀释至1μg/ml，100μl/ 孔加入到96孔酶标板中，37℃恒温孵育2h或4℃过夜。
12.8)洗涤：弃去酶标板中的包被液，以缓冲液pbst冲洗。
13.9)封闭：向酶标板中加入浓度为3％的mpbs，200μl/孔，37℃恒温孵育2h后，以缓冲液pbst冲洗。
14.10)加样：将上述单克隆抗体(1mg/ml)用pbs缓冲液稀释1200倍后，加入酶标板中，50μl/孔；再向酶标板中加入50μl pcb80待测样品，37℃恒温孵育1h后，以缓冲液pbst冲洗。
15.11)加酶标二抗：将酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg)与浓度3％mpbs混合后获得混合液，再加入到酶标板中，100μl/孔，37℃恒温孵育1h后，以缓冲液pbst冲洗；
16.混合液中，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg与mpbs的体积比为 1:5000。
17.12)显色：将tmb显色液以100μl/孔加入酶标板中，37℃恒温孵育15 mim。
18.7)终止显色：向酶标板中加入2m h2so4，50μl/孔，终止显色，在酶标仪上读取od
450
值，即为y值；将y值带入标准曲线 y＝0.1509+0.76886/(1+(37.29x))
1.31879
；即获得多氯联苯pcb80含量值x。
19.在上述步骤4)中，待测样品是由样品经过提取方法预处理后获得的，如取样品(如鸡肉)于高速食品搅拌机中均质，加入4ml去离子水和0.5ml 1mol/l 的hcl，混合后超声0.5h，37℃水浴中孵育12h；再将ph值调节至7.0，添加 6.0ml的乙酸乙酯，然后将混合物旋转振荡10min，并以5000rpm离心10min，取上清于氮气中干燥，取残留物溶于1ml dmso中，即获得待测样品。在具体实施中，也可以采用其他类似方法预处理样品。
20.本发明获得并测序了一种具有广谱特异性识别多氯联苯的单克隆抗体，利用该抗体结合酶联免疫法可对环境、食品中的多氯联苯现场快速检测，检测准确率高。
附图说明
21.图1为pcb半抗原合成步骤示意图。
22.图2为pcb半抗原结构式。
23.图3为免疫原、包被原合成示意图。
24.图4为免疫原、包被原紫外表征图。
25.图5为单克隆抗体的纯度及分子量鉴定结果电泳图。
26.图6为抗体亚型鉴定结果。
27.图7为pcb80标准曲线。
28.图8为抗体重链可变区氨基酸序列结构示意图。
29.图9为抗体轻链可变区氨基酸序列结构示意图。
具体实施方式
30.下面结合具体实际操作步骤详细阐述本发明思想。
31.除非特别说明，以下实施例中涉及的原料、试剂均为市场购买获得。
32.实施例中涉及的多氯联苯半抗原pcbc(化合物6)、化合物1-5均交由上海美迪西生物医药有限公司(shanghai medicilon inc.)合成。
33.实施例1:半抗原的合成
34.本实施例采用的合成路线如附图1所示，引入偶联臂和活性-cooh基团取代多氯联苯苯环上的cl，合成pcb半抗原。
35.具体步骤如下(相关化合物1-5见图1)：
36.1.1)向dmf(25ml)中的化合物1(5.0g，20.7mmol)和化合物2(4.0g， 20.7mmol)中添加k2co3(5.7g，41.3mmol)。反应混合物在室温下搅拌5小时。然后将混合物倒入水中(50ml)并用etoac(2
×
100ml)萃取。用盐水洗涤合并的有机溶液并在na2so4上干燥。真空浓缩得到无色油状化合物3(6.1g，收率82.8％)。
37.1.2)将化合物3(2.0g，5.6mmol)、化合物4(1.6g，8.4mmol)、k2co
3 (2.0g，14.5mmol)和pd(dppf)cl2(411mg，0.56mmol)在二氧六环/h2o (25ml/5ml)中的混合物在80℃下在n2下搅拌2小时。然后将混合物倒入水中(50ml)，并用ea(2
×
50ml)萃取。用盐水洗涤合并的有机相，并在na2so4上干燥。残渣经硅胶柱(pe/ea＝10/1)纯化，得无色油状纯化合物5(2.2g，收率92.8％。
38.1.3)向化合物5(1.0g，2.4mmol)在meoh/h2o(10ml/2ml)中的溶液中添加naoh(384mg，9.6mmol)。反应混合物在60℃搅拌2小时。然后将混合物倒入水中(20ml)，用1mol/l hcl酸化至ph＝3，过滤。用水洗涤湿滤饼并在真空中干燥，得到白色固体形式的纯化合物6(600mg，产率：64.2％)，即为多氯联苯半抗原，其结构式如图2所示。
39.实施例2免疫原、包被原的制备
40.本实施例免疫原、包被原合成途径如附图3所示。多氯联苯半抗原与klh 和bsa的偶联，采用活泼酯法(参见文献：严婷婷,李培武,张奇,等.黄曲霉毒素抗原分子中半抗原偶联比对免疫分析灵敏度的影响[j].中国油料作物学报, 2018,040(003):426-431.)，其具体制备方法如下：
[0041]
2.1)1ml dmf溶解0.01mmol(4mg)的多氯联苯半抗原，将0.01mmol(1.15 mg)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和0.02mmol(4.12mg)的二环己基碳二亚胺 (dcc)依次加入，室温避光搅拌12h。然后10000g离心15min，取上清液，备用；
[0042]
2.2)取5ml的碳酸盐缓冲溶液(0.1m，ph 9.6)溶解0.125μmol(8.25mg) 的bsa，再逐滴加入步骤2.1)中获得的上清液，室温搅拌反应4h；
[0043]
2.3)用14000d(dalton)的透析袋透析，4h换一次超纯水透析，共3次。再用pbs(0.01m，ph 7.4)透析9次，每天3次，最终透析产物为多氯联苯免疫原(pcbc-klh)，包被原(pcbc-bsa)，分装，-20℃保存备用。
[0044]
2.4)包被原的合成同步骤2.1-2.3，透析后，-20℃保存备用。
[0045]
采用紫外分光光度法在波长为200～400nm扫描pcbc半抗原，载体蛋白klh、bsa及偶联物免疫原(pcbc-klh)和包被原(pcbc-bsa)，其紫外吸收图谱如附图4所示。图4中，a为pcbc-klh紫外表征图谱，b为pcbc-bsa紫外表征图谱。可见，与半抗原最大吸收波长271nm和载体蛋白klh、bsa最大吸收波长277nm相比，免疫原(pcbc-klh)最大吸收波长258nm和包被原(pcbc-bsa)最大吸收波长263nm都发生明显偏移，表明偶联成功。
[0046]
实施例3动物免疫
[0047]
从扬州大学比较医学中心购买5-6周龄雌性balb/c小鼠、根据下表1免疫方案进行小鼠免疫，每次免疫间隔2周。
[0048]
表1小鼠免疫方案
[0049][0050][0051]
制备小鼠血清：将采取的小鼠血浆室温静置2h，4℃，10000g离心10min取上清，-20℃保存，备用。
[0052]
实施例4细胞融合与亚克隆
[0053]
选择效价和抑制率合适的小鼠取其脾脏进行融合(liy,jingz,wangy,etal.immunitytheory-basedhigh-specificmonoclonalantibodypreparationandapplicationoffumonisinb1[j].foodanalyticalmethods,2017,10(13):1-7.)。操作步骤如下：
[0054]
4.1在50ml离心管中，将处理过的脾细胞液与sp2/0细胞各自1000g离心10min。
[0055]
4.2将脾细胞和sp2/0细胞以1:6混合，用1640不完全培养基定容到30ml，3000g，离心10min。
[0056]
4.3离心弃上清，分散混匀底部细胞，放入40℃水浴的玻璃烧杯中，取1mlpeg1450溶剂60s内加入到混合细胞中，先慢后快，边加边摇，加完后静置1min。
[0057]
4.4再加入15ml 1640不完全培养基，先慢后快5min内加完，终止peg反应，静置于培养箱中10min，然后800rpm离心8min。
[0058]
4.5离心弃上清，6ml hat培养基重悬融合细胞并定容到60ml，吹打均匀，以100μl/孔分装于含有制备好的饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃培养箱中培养。
[0059]
4.6一周后，利用elisa测定阳性孔。选择具有抑制率的阳性孔，根据孔内细胞数的多少取吹打混匀后的0.5-2μl的细胞液(大约100个细胞)并用培养基稀释分散到新的一块96孔板中。
[0060]
4.7)采用有限稀释方法扩大培养，后续亚克隆步骤同4.6，获得pcbs单克隆杂交瘤细胞株。
[0061]
实施例5腹水制备、纯化与鉴定
[0062]
采用小鼠体内诱生法生产腹水，提前3天在经产小鼠腹部注射0.5ml的弗式不完全佐剂致敏，利用细胞计数仪计数扩大培后的pcbs单克隆杂交瘤细胞株并注射(106个/只)到小鼠腹部。7-8天腹部鼓起，进行腹水收集，离心去杂质和脂肪。
[0063]
参考辛酸硫酸铵沉淀法粗提纯(刘俊琴,申丽洁.辛酸-硫酸铵法在纯化血清旋毛虫特异性igg抗体中的应用[j].中国病原生物学杂志,2008(08):595-597.)，利用protein g柱纯化腹水，首先用结合缓冲液填充泵，防止气泡的产生。处理后的腹水重复过蛋白柱3次后，用结合缓冲液和洗脱缓冲液依次冲洗蛋白柱3次，收集含有抗体的洗脱液，调剂ph至中性。然后用5倍柱体积结合缓冲液洗柱3 次并用20％乙醇封闭蛋白柱。此步骤获得的洗脱液即为纯化后的抗体。
[0064]
sds-page电泳：撕掉规格为10％的蛋白胶板底部绝缘带，装入电泳槽。加入适量的sds蛋白缓冲液，4
×
蛋白上样液处理抗体，加入6μl marker(160-20 kda)作为参照。电泳条件为(恒压140v 90min),结束后考马斯亮蓝染色，自动凝胶成像仪拍照。
[0065]
经sds-page变性电泳，获得分子量约为50kd的抗体重链条带，以及分子量约为25kd的轻链条带(图5)；且图中条带单一没有非目标的杂带，表明抗体纯化效果较好，纯度高。
[0066]
申请人委托江苏泰州百英生物公司对单克隆细胞株进行基因序列测序，测序抗体重链和轻链可变区的核苷酸序列，经abysis(http://www.abysis.org/abysis/)分析重轻链可变区的4个fr区及3个cdr区。该抗体重链恒定区 genbank:am745099.1核苷酸序列如seq id no.1所示；重链恒定区氨基酸序列如seq id no.2所示；轻链恒定区genbank:aj555479.1核苷酸序列如seq idno.3所示；轻链恒定区氨基酸序列如seq id no.4所示；抗体重链可变区核苷酸序列如seq in no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6所示(重链可变区氨基酸序列结构如图8所示)；轻链可变区核苷酸序列如seq id no.7所示，氨基酸序列如seq id no.8所示(轻链可变区序列结构如图9所示)。
[0067]
实施例6抗体性能鉴定
[0068]
6.1亚型鉴定：采用抗体亚型鉴定试剂盒fine test(购自wuhan fine biotechco.ltd)进行抗体亚型鉴定，鉴定方法参见试剂盒说明书，鉴定结果如附图6所示。结果表明该细胞株产生的抗体亚型为igg1型。
[0069]
6.2 elisa方法过程
[0070]
①
用cbs缓冲液将包被原pcbc-bsa(实施例2制备)稀释至1μg/ml，100μl/ 孔加入
到96孔酶标板中，37℃恒温孵育2h。
[0071]
②
洗涤：弃去酶标板中的包被液，用洗涤缓冲液pbst洗板四次,每次250μl/ 孔，在吸水纸上拍干。
[0072]
③
封闭：向酶标板中加入浓度3％mpbs封闭溶液，200μl/孔，37℃恒温孵育 2h；然后洗涤，洗涤同步骤
②
。
[0073]
④
加样：将pcb单克隆抗体(1mg/ml)以pbs缓冲液稀释1200倍后加入酶标板中，50μl/孔，同时加入50μl不同浓度pcb样品设置三个平行对照，37℃孵育1h。
[0074]
⑤
洗涤同步骤
②
。
[0075]
⑥
加酶标二抗：将酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，购自sigma
[0076]
公司)用浓度为3％的mpbs按1:5000倍稀释混匀后，加入酶标板中，100μl/ 孔，37℃恒温孵育1h；
[0077]
⑦
洗涤同步骤
②
。
[0078]
⑧
显色：将配制好的显色基底液tmb显色液以100μl/孔加入酶标板中，37℃恒温孵育15min。
[0079]
⑨
终止显色：向酶标板中以50μl/孔加入2m h2so4终止显色，在酶标仪上读取od
450
值。
[0080]
6.3基于该抗体的elisa方法灵敏度
[0081]
取pcb80标准品1毫克，以(dmso)为溶剂配制成浓度为100μg/ml的储备液，然后以ph7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)梯度稀释配制成不同浓度的pcb80 标准品溶液，分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、 1.95ng/ml，利用6.1建立的elisa方法建立标准曲线图(图7)，即以不加pcb 的读值为b0(值最大),加入pcb80后值为b，值随pcb80浓度增加而减小，以 b/b0为y轴,pcb浓度为x轴，利用origin进行非线性拟合，最终获得的线性方程为：y＝0.1509+0.76886/(1+(37.29x))
1.31879
，r2＝0.98529，线性范围为 7.44-205.43μg/l，ic
50
值为30.84μg/l，最低检测限为1.4μg/l。
[0082]
6.4抗体交叉反应率与识别谱：
[0083]
参考hj 922-2017，根据公式交叉反应率(cr)＝ic
50
(pcb80)/ic
50
(类似物)
ꢀ×
100％。交叉反应率大于0.1为识别。由表1可知该抗体能识别11种多氯联苯，而对于pcb105交叉反应率小于0.1即为不识别。单克隆抗体h8对pcb同系物交叉反应率与下表2所示。
[0084]
表2单克隆抗体h8对pcb同系物交叉反应率
[0085][0086]
实施例7检测验证
[0087]
本实施例利用筛选获得的抗体对添加样品中的多氯联苯进行检测，样品提取过程参考(songj,hongy,wangy,etal.directdetectionof3-amino-5-methylmorpholino-2-oxazolidinone(amoz)infoodsampleswithoutderivatisationstepbyasensitiveandspecificmonoclonalantibodybasedelisa[j].foodchemistry,2012,135(3):1330-1336.；gb5009.190-2014)，具体如下：
[0088]
7.1)样品制备
[0089]
取不含多氯联苯的鸡肉(购自本地超市)样品2g，分别添加100μl不同浓度pcb80，配制成终浓度为5、15、30μg
·
kg-1
的添加样，室温静置2小时待用。本实施例使用的不含多氯联苯的鸡肉在购买后，先进行gc-ms检测，验证不含有多氯联苯后，再作为样品进行实验。
[0090]
7.2)样品提取
[0091]
取空白鸡肉(购自本地超市)样品于高速食品搅拌机中均质，加入4ml去离子水和0.5ml1mol
·
l-1
hcl，充分混合，超声0.5h，在37℃水浴中孵育12h；以5.0ml0.1mol
·
l-1
磷酸氢二钾和0.4ml1mol
·
l-1
氢氧化钠将ph值调节至7.0，再添加6.0ml乙酸乙酯，然后将混合物旋转振荡10min，并以5000rpm离心10min取上清并在氮气下干燥，残留物溶于1mldmso中，即获得处理后的样品。
[0092]
7.3)多氯联苯的检测
[0093]
参考实施例6建立的elisa方法过程，对样品中的多氯联苯进行检测，将od
450
值结
果作为y值带入标准曲线：y＝0.1509+0.76886/(1+(37.29x))
1.31879
；即获得样品中多氯联苯pcb80的浓度x。
[0094]
收集用于间接竞争酶联免疫吸附分析结果如表3。添加回收率在74.6-91.3之间且变异系数良好。
[0095]
表3酶联免疫吸附试验直接检测加标鸡肉样品(n＝5)
[0096][0097]
7.4广谱识别检测试验
[0098]
根据6.4和7.1添加相应浓度梯度的pcb169、pcb126、pcb189、pcb157、 pcb167、pcb156、pcb111、pcb81、pcb123、pcb77等药物，按上述样品前处理用间接竞争elisa检测。结果表明添加回收率在82.36％-102.47％，cv系数在5.7-9.3％。说明该抗体能够测定多种pcbs。
[0099]
实施例8检测实际样品中多氯联苯
[0100]
样品为购自超市及农贸市场的整只光鸡、鸡胸肉、鸡腿等生鲜鸡肉产品共 20份，依据实施例7(7.2)建立的方法进行样品提取，以实施例6(6.2)建立的elisa过程进行检测，结果表明有2份样品显阳性，18份显阴性。证明所制备的抗体与建立的方法可实际应用检测鸡肉中多种pcbs的快速检测与筛查。